豌豆多糖對(duì)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠的保護(hù)作用

彭修義，劉連娣，王 瑞，宋蕭蕭，崔武衛(wèi),2，殷軍藝*

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.加拿大農(nóng)業(yè)及農(nóng)業(yè)食品部圭爾夫研究與發(fā)展中心，安大略 圭爾夫 NIG5C9)

炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，以慢性腹瀉、腹痛和直腸出血為特征[1]。近幾十年來(lái)，全球IBD發(fā)病率和流行率不斷升高，尤其是在西方國(guó)家最為普遍[2]。有關(guān)IBD發(fā)病機(jī)制，現(xiàn)有研究表明腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素12(IL-12)等促炎細(xì)胞因子與IL-4、IL-10等抗炎細(xì)胞因子的失衡，在調(diào)節(jié)IBD炎癥中起到關(guān)鍵作用[3]。目前治療IBD藥物，如糖皮質(zhì)激素、氨基水楊酸鹽、免疫抑制劑和生物制劑等[4]，若長(zhǎng)期服用會(huì)造成一定的副作用。因此，亟需尋找無(wú)毒副作用的天然活性物質(zhì)作為替代。

豌豆(PisumsativumL.)又稱雪豆、青豆等，屬于豆科(Leguminosae)蝶形華亞科(Papilionoideae)豌豆屬(Pisum)，是主要的食用豆類之一[5]。我國(guó)是全球第二大豌豆生產(chǎn)國(guó)，產(chǎn)量高達(dá)世界豌豆總產(chǎn)量的1/3[6]。豌豆?fàn)I養(yǎng)豐富，其中淀粉(60%～65%)、蛋白質(zhì)(21%～32%)和非淀粉多糖(～5%)的含量相對(duì)較高，脂質(zhì)含量(～2%)很低，是優(yōu)質(zhì)植物性食物來(lái)源[7]。豌豆還可發(fā)揮維持胃腸道功能穩(wěn)態(tài)[8]和控制血糖變化[9]等多種功能作用。Bibi等[10]研究了飲食中添加10%豌豆對(duì)于葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)添加豌豆飲食可減少腸炎小鼠中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)和IL-6等炎癥標(biāo)志物分泌。豌豆蛋白[11]和豌豆多酚提取物[12]均可以降低結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織損傷，阻止結(jié)腸縮短和疾病活動(dòng)指數(shù)(Disease activity index，DAI)上升，保護(hù)腸道屏障功能。

近年來(lái)，越來(lái)越多研究表明植物多糖作為一種天然活性成分，對(duì)IBD具有積極的預(yù)防和保護(hù)作用[13,14]，但是鮮有針對(duì)豌豆多糖的報(bào)道。結(jié)構(gòu)特征方面，Misaki等[7]將豌豆去皮后提取粗多糖進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)豌豆多糖屬于果膠類多糖，均重分子量為488 kDa，其中阿拉伯糖的含量高達(dá)50%。功能活性方面，有研究發(fā)現(xiàn)[15]豌豆莢中提取得到的多糖，具有良好的抗氧化和抗菌性能。豌豆殼纖維的膳食添加也有促進(jìn)腸道運(yùn)動(dòng)頻率，增強(qiáng)腸道健康的作用[16]。

因此，本研究采用水提醇沉法制備豌豆粗多糖，利用JK008樹(shù)脂對(duì)其進(jìn)行純化得到豌豆多糖(Pea Polysaccharides，PPs)，測(cè)定其基本結(jié)構(gòu)特征，并構(gòu)建DSS誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，探究豌豆多糖對(duì)小鼠基本生理狀況、結(jié)腸組織病理學(xué)及炎癥因子分泌等干預(yù)作用。本研究為結(jié)腸炎輔助治療產(chǎn)品開(kāi)發(fā)以及豌豆多糖高值化利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

豌豆(中豌六號(hào))，河北省廊坊市；C57BL/6小鼠(20±2 g)，SPF級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004，5周齡，雄性，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；JK008樹(shù)脂，安徽三星科技有限公司；葡聚糖硫酸鈉(DSS，MW36000～50000)，美國(guó)MP公司；4%多聚甲醛溶液和BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蘇木精、伊紅染料，武漢賽維爾生物有限公司；IL-1β、IL-6、IL-10、IL-22 ELISA試劑盒，南京福麥斯生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉等其他化學(xué)試劑均為分析純級(jí)別。

1.2 儀器與設(shè)備

E2695高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；Dionex ICS 6000離子交換色譜儀、Variouskan Flash全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀、高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；FreeZone冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconco公司；23LV100病理切片掃描儀，德國(guó)徠卡生物系統(tǒng)有限公司；DFY-1000C高速粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 豌豆多糖提取制備及基本理化性質(zhì)測(cè)定

2.1.1 豌豆多糖的提取及純化

參考Bai等方法[17]并略作修改提取豌豆粗多糖。具體步驟如下：高速粉碎機(jī)將豌豆打成豆粉，過(guò)60目篩，取適量過(guò)篩豆粉，加入10倍體積蒸餾水，95 ℃水浴條件下充分?jǐn)嚢杼崛　Ｌ崛〗Y(jié)束后離心取上清液，依次加入適量的耐高溫α-淀粉酶、木瓜蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶酶解，酶解結(jié)束后煮沸滅酶15 min。旋蒸濃縮上清液至原體積1/5，勻速加入4倍95%乙醇至濃縮液，室溫靜置過(guò)夜，8 000 r·min-1離心10 min，收集沉淀。蒸餾水復(fù)溶后，旋蒸去掉多糖溶液有機(jī)相，冷凍干燥即得到豌豆粗多糖。

對(duì)豌豆粗多糖進(jìn)行純化。具體步驟如下：將凍干后的豌豆粗多糖復(fù)溶，配成10 mg·mL-1糖液，按照質(zhì)量比1：20的比例加入活化好的JK008樹(shù)脂，靜態(tài)吸附8 h，10 000 r·min-1離心10 min后合并上清，旋蒸濃縮醇沉(4倍體積95%乙醇)，旋蒸除去有機(jī)后凍干，即得純度較高的豌豆多糖。

2.1.2 基本組成測(cè)定

中性糖含量測(cè)定：采用苯酚-硫酸法[18]，吸取1 mL濃度為0.1 mg·mL-1樣品，加入1 mL 3%的苯酚搖勻，緩慢加入濃硫酸4 mL，充分混勻(移液管移取硫酸，緩慢加入，邊加入邊搖晃)室溫反應(yīng)35 min后，于490 nm處測(cè)定吸光度。

糖醛酸含量測(cè)定：采用咔唑-硫酸法[19]，吸取1 mL濃度為0.1 mg·mL-1樣品，冰浴中加入6 mL優(yōu)級(jí)濃硫酸，邊加邊緩慢搖晃，于85 ℃水浴20 min，取出冷卻至室溫，加入0.2 mL 0.1%咔唑-乙醇，搖晃混勻，室溫放置2 h，于530 nm處測(cè)定吸光度。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定：采用考馬斯亮藍(lán)法[20]，吸取1 mL濃度為0.1 mg·mL-1樣品，加入考馬斯溶液5 mL，蓋塞翻轉(zhuǎn)混合3～5次，室溫條件下反應(yīng)10 min，于595 nm處測(cè)定吸光度。

2.1.3 均一性和相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

采用高效凝膠滲透法進(jìn)行分子量分布測(cè)定[21]。稱取適量多糖樣品，用0.02%的NaN3水溶液完全溶解配置成1 mg·mL-1的糖溶液，過(guò)0.22 μm水系濾膜后進(jìn)樣檢測(cè)，以Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70、Dextran T-500、Dextran T-2000和Glc為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算樣品的相對(duì)分子質(zhì)量。

色譜條件：色譜柱為UltrahydrogelTMLinear Column(7.8 mm×300 mm)，流動(dòng)相為0.02% NaN3溶液，流速0.6 mL·min-1，柱溫40.0 ℃，樣品濃度為1 mg·mL-1，進(jìn)樣量20 μL。

2.1.4 單糖組成測(cè)定

采用高效陰離子交換色譜-脈沖積分安培法(HPAEC-PAD)檢測(cè)單糖組成[22]。稱取5 mg多糖樣品，于冰浴條件下加入0.5 mL 12 mol·L-1硫酸溶液，攪拌30 min后，加入2.5 mL去離子水稀釋，然后轉(zhuǎn)移至100 ℃油浴鍋中并攪拌水解2 h。水解完全后進(jìn)行充分冷卻，將水解液定容至50 mL容量瓶并稀釋5倍，過(guò)0.22 μm水系濾膜后進(jìn)Dionex ICS 6000離子交換色譜系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。

色譜條件：色譜柱為CarboPacTMPA20保護(hù)柱和CarboPacTMPA20分析柱(4 mm×250 mm)，流動(dòng)相為氫氧化鈉、水和醋酸鈉溶液，流速0.5 mL·min-1，柱溫為30.0 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的分組及模型建立

42只C57BL/6J小鼠于飼養(yǎng)鼠籠中，室溫25 ℃±2 ℃，相對(duì)濕度50±5%，并執(zhí)行12 h/12 h的燈光/黑暗循環(huán)。靜養(yǎng)7 d之后，隨機(jī)將小鼠分為5組，分別為正常組、模型組、豌豆多糖低劑量組(L-PPs)、豌豆多糖中劑量組(M-PPs)和豌豆多糖高劑量組(H-PPs)，其中正常組10只小鼠，剩余4組每組8只小鼠。正常組和模型組每天經(jīng)口灌胃0.2 mL生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組每天經(jīng)口灌胃低(200 mg·kg-1)、中(400 mg·kg-1)、高(600 mg·kg-1)劑量的豌豆多糖溶液。灌胃7 d后，在第14天將模型組和實(shí)驗(yàn)組的飲水換成含3% DSS的滅菌水，正常組依舊給予正常滅菌水，造模7 d后，停止給予DSS無(wú)菌水，24 h后，將小鼠稱重后進(jìn)行脫頸處死，采集生物樣本。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程如圖1所示。

圖1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程Fig.1 Animal experiment design process

2.2.2 疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分

在DSS造模期間，參考Jackson等人的方法[23]并稍作修改，每天上午稱量小鼠的體重、觀察糞便性狀、記錄小鼠腹瀉、便血情況，進(jìn)行DAI評(píng)分，DAI評(píng)分為體重下降、糞便性狀和便血情況總得分的平均值，常用來(lái)表征小鼠結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Disease activity index scoring criteria

2.2.3 脾臟指數(shù)測(cè)定

取出并稱量脾臟，計(jì)算臟器指數(shù)，脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/體重(g)×100%。

2.2.4 結(jié)腸長(zhǎng)度測(cè)定

量取升結(jié)腸至直腸長(zhǎng)度為結(jié)腸長(zhǎng)度，評(píng)價(jià)結(jié)腸長(zhǎng)度變化。

2.2.5 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

截取小鼠約1 cm長(zhǎng)遠(yuǎn)端結(jié)腸組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定。石蠟包埋后，進(jìn)行切片與蘇木精伊紅染色，進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。按照Dieleman等人的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[24]并稍作修改，對(duì)結(jié)腸組織病理情況進(jìn)行評(píng)分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Histopathological scoring criteria

2.2.6 結(jié)腸組織炎癥因子測(cè)定

稱取適量結(jié)腸樣本，按照1：9(w/v)的比例加入預(yù)冷的PBS，研磨成勻漿后離心，收集上清液。按照對(duì)應(yīng)的ELISA試劑盒操作說(shuō)明，測(cè)定上清液中炎癥因子IL-6，IL-1β，IL-10，IL-22的含量。另外，按照BCA蛋白濃度試劑盒的說(shuō)明書(shū)檢測(cè)上清液總蛋白含量，作為炎癥因子含量的背景校正，單位為pg·mg-1。

2.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪圖，各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，組間差異采用單因素方差分析(One-way-ANOVA)和Tukey檢驗(yàn)。*P<0.05表示與模型相比有顯著性差異，**P<0.01、***P<0.001表示與模型組相比有極顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 豌豆多糖的基本理化性質(zhì)

表3為豌豆多糖的基本組成測(cè)定結(jié)果。可以看出，豌豆經(jīng)水提醇沉提取、JK008樹(shù)脂吸附純化之后，其中性糖含量和糖醛酸含量分別為55.3%和29.8%，總糖含量達(dá)到85.1%，純度較高。

表3 豌豆多糖的基本組成測(cè)定(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=3)Tab.3 Determination of the basic composition of pea polysaccharides(mean±SD,n=3)

圖2是采用高效凝膠滲透法測(cè)定豌豆多糖的分子量結(jié)果，豌豆多糖相對(duì)分子量分布較寬且不均一，有四個(gè)洗脫峰，依據(jù)保留時(shí)間的不同，表明豌豆多糖由4.68×103，610，144和2.8 kDa 4個(gè)組分構(gòu)成且以610 kDa分子量為主。與Wu等人[25]測(cè)定豌豆多糖分子量主要為110和25 kDa的結(jié)果不一致，這可能是采用的多糖純化方式不同導(dǎo)致的，Wu采用Sevag法脫蛋白的方式純化多糖，而本研究則是采用JK008樹(shù)脂吸附的方式，因此結(jié)果上存在一定差異。Sevag法脫除多糖中蛋白是實(shí)驗(yàn)室常用的方法，但是存在操作繁瑣、成本較高和環(huán)境不友好的缺點(diǎn)，而JK008樹(shù)脂作為一種大孔吸附樹(shù)脂，有著良好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和比表面積，具有操作簡(jiǎn)單，純化高效和安全無(wú)毒的優(yōu)點(diǎn)[26-27]。本研究使用JK008樹(shù)脂對(duì)豌豆粗多糖進(jìn)行純化，可以有效脫除豌豆粗多糖中的蛋白質(zhì)和色素，提高中性糖和糖醛酸含量。

t/min圖2 豌豆多糖的高效凝膠色譜圖Fig.2 High-efficiency gel chromatogram of pea polysaccharides

豌豆多糖是主要由Rha、Ara、Gal、Glc、Xyl、Man和GalA組成(表4)，以Ara(20.1%)、Gal(15.1%)和GalA(13.1%)為主，屬于果膠類多糖，與Zhang等[28]報(bào)道的結(jié)果相似。

表4 豌豆多糖的單糖組成分析(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=3)Tab.4 Monosaccharide composition analysis of pea polysaccharides(mean±SD,n=3)

3.2 豌豆多糖對(duì)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠的干預(yù)保護(hù)作用

3.2.1 對(duì)小鼠體重和DAI評(píng)分的影響

DAI值常被用來(lái)表征結(jié)腸炎小鼠患病程度，結(jié)腸炎造模期間小鼠的體重及DAI值變化率如圖3所示。正常組小鼠的體重保持穩(wěn)定且略有上升，模型組和給藥組小鼠在第4天后體重均呈現(xiàn)了不同程度的下降，其中M-PPs和H-PPs相比于模型組體重下降趨勢(shì)相對(duì)較慢(圖3A)。圖3B顯示，正常組的DAI值基本為零，而其他組別DAI值則隨著造模時(shí)間的推移而逐漸增大，在第7天，模型組DAI值達(dá)到最大，而豌豆多糖組的DAI值相比于模型組則更低，其中M-PPs的DAI得分相較于L-PPs和H-PPs更低。上述結(jié)果說(shuō)明，DSS誘導(dǎo)的小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型成功，而豌豆多糖干預(yù)延緩了結(jié)腸炎小鼠的體重下降，改善了結(jié)腸炎小鼠DAI評(píng)分，減輕了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎患病程度。

t/d

3.2.2 對(duì)小鼠脾臟指數(shù)的影響

脾臟是重要的免疫器官，隨著炎癥的發(fā)生和加重，脾臟會(huì)出現(xiàn)腫大[3]。豌豆多糖對(duì)小鼠脾臟指數(shù)的影響如圖4所示。

圖4 豌豆多糖對(duì)小鼠脾臟指數(shù)的影響(圖上方為各組脾臟代表性圖片)。(n=5～6)Fig.4 Effect of pea polysaccharides on spleen index in mice (representative pictures of spleens in each group above).(n=5～6)

可以發(fā)現(xiàn)，模型組(6.24±0.29%)的脾臟指數(shù)相較于正常組(4.01±0.07%)顯著升高(P<0.001)，說(shuō)明模型組的脾臟腫大程度高，炎癥嚴(yán)重。在豌豆多糖的干預(yù)下，脾臟腫大情況得到緩解，其中M-PPs組的脾臟指數(shù)(4.69±0.22%)相較于模型組極顯著的降低(P<0.001)，如實(shí)物圖所示，脾臟腫大明顯改善，炎癥緩解。

3.2.3 對(duì)小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度和結(jié)腸組織病理的影響

豌豆多糖對(duì)小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度和結(jié)腸組織病理的影響見(jiàn)圖5。DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型中，隨著炎癥嚴(yán)重程度的增加結(jié)腸會(huì)縮短[29]，從圖5A和圖5B可以明顯看出，模型組的結(jié)腸與正常組相比顯著縮短，而M-PPs和H-PPs組結(jié)腸長(zhǎng)度相較于模型組有增長(zhǎng)的趨勢(shì)，但是差異不顯著。

結(jié)腸的腸絨毛、隱窩、腺體的結(jié)構(gòu)完整性以及杯狀細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和數(shù)量，可以在一定程度上反映結(jié)腸的健康程度[30]。為了評(píng)估豌豆多糖對(duì)結(jié)腸組織的影響，對(duì)小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行了病理學(xué)切片分析(圖5C)及組織學(xué)評(píng)分(圖5D)。從圖可以看出，正常組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)完整。模型組結(jié)腸組織的隱窩發(fā)生萎縮甚至消失，杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，中性粒細(xì)胞大量浸潤(rùn)，黏膜下層發(fā)生水腫，與肌層的緊密連接受損，組織學(xué)評(píng)分相比于正常組極顯著升高(P<0.001)。相比與模型組而言，豌豆多糖組結(jié)腸組織的結(jié)構(gòu)則更加完整，杯狀細(xì)胞數(shù)量增多，損傷更少。此外，與L-PPs和H-PPs組相比，M-PPs組隱窩結(jié)構(gòu)更加完好，隱窩沒(méi)有發(fā)生上移，結(jié)腸黏膜下層水腫更輕，與肌層結(jié)合更緊密。M-PPs組的組織學(xué)評(píng)分與模型組之間存在顯著性差異(P<0.05)，表明M-PPs組的小鼠結(jié)腸損傷的情況得到很好改善，結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)的完整性得到有效保護(hù)。

圖5 豌豆多糖對(duì)小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度和結(jié)腸組織病理的影響。(n=6～8)(A)結(jié)腸形貌觀察；(B)小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度；(C)各組代表性的HE染色組織切片；(D)組織病理學(xué)評(píng)分。注：(a):杯狀細(xì)胞；(b):隱窩(c):黏膜下層(d):肌層(e):中性粒細(xì)胞。

3.2.4 對(duì)小鼠結(jié)腸組織促炎和抗炎細(xì)胞因子的影響

炎癥細(xì)胞因子的水平對(duì)于評(píng)判炎癥的輕重程度具有重要作用，促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子的平衡對(duì)于炎癥的調(diào)控有著重要影響[31]。豌豆多糖對(duì)小鼠結(jié)腸組織炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響如圖6所示。與正常組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6含量升高，其中IL-1β的含量極顯著升高(P<0.001)，抗炎細(xì)胞因子IL-10和IL-22的含量則極顯著降低(P<0.001)。在豌豆多糖干預(yù)下，結(jié)腸炎小鼠促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-1β水平降低，IL-10和IL-22水平提高。與L-PPs和H-PPs組相比，M-PPs組腸炎小鼠結(jié)腸組織IL-22的分泌水平(364.36±15.87) pg·mg-1相較于模型組極顯著升高(P<0.001)，和正常組的水平相當(dāng)。

圖6 豌豆多糖對(duì)小鼠結(jié)腸組織炎癥細(xì)胞因子水平的影響。(n=5～6)(A)IL-6水平；(B)IL-1β水平；(C)IL-10水平；(D)IL-22水平。

3.3 討論

DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎模型是一種常用的、簡(jiǎn)單且易于操作的結(jié)腸炎模型，與人類UC的病理特征相似，臨床表現(xiàn)為體重下降、腹瀉便血，發(fā)生炎癥反應(yīng)，組織病理學(xué)表現(xiàn)為杯狀細(xì)胞減少、隱窩結(jié)構(gòu)破壞以及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)[32]。在本研究中，模型組小鼠相較于正常組出現(xiàn)了體重明顯下降、稀便和便血情況嚴(yán)重、脾臟腫大、結(jié)腸縮短等癥狀，在結(jié)腸病理組織學(xué)上表現(xiàn)出隱窩結(jié)構(gòu)異常且隱窩上移，杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，中性粒細(xì)胞大量浸潤(rùn)，發(fā)生隱窩炎等結(jié)腸組織病變。而在豌豆多糖干預(yù)下，結(jié)腸炎小鼠的一般癥狀得到一定緩解，結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整性提高。此外，相較于與L-PPs和H-PPs組，M-PPs組顯示出更好的緩解作用，其脾臟指數(shù)極顯著降低，結(jié)腸長(zhǎng)度更長(zhǎng)，組織學(xué)評(píng)分也更低。

近年來(lái)，很多研究者指出果膠類多糖作為一種腸道微生物群可及的碳水化合物，對(duì)結(jié)腸炎癥具有改善作用。Pan等人[33]從中藥菝葜的根莖中提取果膠多糖，揭示了其對(duì)腸道黏膜侵蝕和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的緩解作用。本研究提取制備的豌豆多糖是一種果膠類多糖，阿拉伯糖的含量較高，而阿拉伯糖在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中可以發(fā)揮抗炎作用[34]。Zhang等人[35]從牛蒡中提取純化多糖，其阿拉伯糖的含量超過(guò)50%，能夠在體內(nèi)外抑制促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-1β的產(chǎn)生，增加抗炎細(xì)胞因子IL-10含量。這表明豌豆多糖表現(xiàn)出對(duì)結(jié)腸炎小鼠抗炎作用的原因之一可能是其阿拉伯糖的含量較高。

炎癥細(xì)胞因子作為免疫反應(yīng)中不可或缺的組成部分，可以向眾多的免疫細(xì)胞發(fā)送信號(hào)，對(duì)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)至關(guān)重要[36]。過(guò)量的促炎細(xì)胞因子如IL-6、IL-1β等，可引發(fā)與免疫反應(yīng)相關(guān)的疾病，而抗炎細(xì)胞因子如IL-10等可改善炎癥反應(yīng)[37]。在豌豆多糖的干預(yù)下，結(jié)腸炎小鼠IL-6、IL-1β水平降低，IL-10的水平相對(duì)提高。此外，豌豆多糖的干預(yù)使結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織IL-22的分泌水平均顯著提高，其中M-PPs組和正常組的水平相當(dāng)。有研究指出[38]IL-22可促進(jìn)杯狀細(xì)胞分泌粘蛋白，形成穩(wěn)定的腸道屏障，隔離上皮細(xì)胞和微生物之間的直接相互作用，促進(jìn)結(jié)腸損傷的恢復(fù)。因此，抗炎細(xì)胞因子IL-22水平的調(diào)控，可能是豌豆多糖發(fā)揮對(duì)結(jié)腸炎小鼠保護(hù)作用的重要因素之一。

綜上所述，豌豆多糖干預(yù)可以發(fā)揮對(duì)結(jié)腸炎小鼠的保護(hù)作用，這可能與保護(hù)結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，增強(qiáng)腸道屏障功能以及調(diào)控結(jié)腸組織促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子分泌水平的平衡有關(guān)。此外，相較于與L-PPs和H-PPs組，M-PPs組對(duì)于結(jié)腸炎的保護(hù)效果更佳，一方面L-PPs組的干預(yù)效果不佳可能是劑量不足導(dǎo)致的，另一方面H-PPs組的干預(yù)劑量過(guò)高，則可能會(huì)致使腸道部分有害菌的增加，擾亂腸道微生物的平衡[39]，進(jìn)而降低保護(hù)效果。這說(shuō)明灌胃多糖的干預(yù)劑量也并非越大越好，要尋找一個(gè)最佳干預(yù)劑量。

4 結(jié)論

本研究提取純化得到的豌豆多糖是一種阿拉伯糖含量較高的果膠類多糖，能夠改善腸道完整性和腸道屏障功能，抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，提高抗炎細(xì)胞因子水平，減輕DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，具有治療或輔助治療結(jié)腸炎的潛力，未來(lái)可進(jìn)一步針對(duì)豌豆多糖干預(yù)劑量及其與結(jié)腸炎治療藥物復(fù)配對(duì)其功能提質(zhì)性和副作用進(jìn)行探究。本研究為結(jié)腸炎輔助治療產(chǎn)品開(kāi)發(fā)以及豌豆多糖高值化利用提供理論基礎(chǔ)。