氨基寡糖素對苦瓜枯萎病的抗性誘導(dǎo)作用

黃熊娟，黃如葵，馮誠誠，琚茜茜，秦 健，梁家作，陳振東，黃玉輝，陳小鳳，劉杏連

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣西蔬菜育種與新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530007)

【研究意義】苦瓜是我國重要的特色瓜類蔬菜，在其產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的同時(shí)，連作障礙問題也日益突出。其中，苦瓜枯萎病發(fā)病率已呈直線上升趨勢，且重病區(qū)的發(fā)病率在85%以上，經(jīng)濟(jì)損失慘重。此外，苦瓜科研中的種質(zhì)資源和中間材料因枯萎病而大量死亡，對苦瓜種質(zhì)資源保存、創(chuàng)新及新品種選育也造成嚴(yán)重影響。目前，對枯萎病的防御策略主要是從耕作制度和種植方式優(yōu)化、抗病品種和嫁接砧木篩選利用、土壤消毒和土壤管理、栽培管理及化學(xué)防治和生物防治等角度著手。誘導(dǎo)抗病技術(shù)是一種安全有效的植物病害防治技術(shù)，可通過誘抗劑刺激植物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生廣譜、持久的抗病性能，其中的氨基寡糖素(一種植物免疫誘抗劑類新型生物農(nóng)藥[1])對各種果樹、蔬菜和作物的真菌、細(xì)菌和病毒均具有一定的防治效果[2-5]，但其對苦瓜枯萎病的抗性誘導(dǎo)效果尚不清楚。因此，探究氨基寡糖素誘導(dǎo)苦瓜幼苗抗枯萎病發(fā)生的方式及誘導(dǎo)抗病性對苦瓜組織結(jié)構(gòu)、次生代謝物質(zhì)和病程相關(guān)蛋白活性變化情況的影響，對完善氨基寡糖素誘導(dǎo)苦瓜抗枯萎病技術(shù)具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】與傳統(tǒng)殺菌劑相比，植物誘抗劑具有微量、廣譜、持效期長、不易產(chǎn)生抗藥性及對環(huán)境友好等特點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)，寡糖、聚糖類和苯并噻二唑類等有機(jī)化合物類誘抗劑對多種真菌病害的抗性誘導(dǎo)具有較好效果[6-9]。在土傳病害抗性誘導(dǎo)中，莊敬華等[10]研究認(rèn)為，0.1和0.5 mol/L水楊酸及4.0 mol/L草酸處理土壤對甜瓜枯萎病的誘抗有效；石延霞等[11-12]利用氟唑活化酯胚根浸種結(jié)合葉面噴霧、吡唑并嘧啶衍生物葉面噴施誘導(dǎo)黃瓜抗枯萎病，均獲得較好的誘導(dǎo)抗病效果；袁新琳等[13]研究認(rèn)為，氨基寡糖素可有效誘導(dǎo)棉花抗枯萎病和黃萎病。植物次生代謝產(chǎn)物主要包括木質(zhì)素、胼胝質(zhì)和酚類化合物等，而病原物侵襲可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生大量可溶性酚類物質(zhì)，抑制病原物遷移和擴(kuò)增[14]，細(xì)胞壁上的大量酚類物質(zhì)也與植物的抗病性密切相關(guān)[15]，在病原菌侵染產(chǎn)生過敏性反應(yīng)過程中，植物細(xì)胞中的木質(zhì)素、胼胝質(zhì)和酚類物質(zhì)等細(xì)胞結(jié)構(gòu)及植物組織木質(zhì)化程度均有所增強(qiáng)，能阻止病原菌從植物細(xì)胞汲取營養(yǎng)和水分，抵御病原菌侵染[16]。已有研究表明，在寄主植物和病原物抗病反應(yīng)及親和性互作的感病反應(yīng)中，過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)等植物體內(nèi)較重要的保護(hù)酶和防御酶與植物抗性密切相關(guān)[16-18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今，關(guān)于氨基寡糖素誘導(dǎo)苦瓜枯萎病抗性的研究未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以不同濃度誘抗劑氨基寡糖素對苦瓜幼苗進(jìn)行噴霧和灌根處理，誘導(dǎo)苦瓜對外來病原菌產(chǎn)生免疫反應(yīng)從而獲得對枯萎病的抗性，實(shí)現(xiàn)抵御枯萎病能力的提升，為完善氨基寡糖素誘導(dǎo)苦瓜抗枯萎病技術(shù)及促進(jìn)苦瓜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2018年7—10月在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所院科研基地進(jìn)行。供試誘抗劑為5%氨基寡糖素(海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司，水劑)，對照誘抗劑為0.5%幾丁聚糖(成都特普科技發(fā)展有限公司，水劑)和6%低聚糖素(海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司，水劑)；供試苦瓜品種桂農(nóng)科三號(hào)由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所選育提供；供試病原菌尖孢鐮刀菌苦瓜?；?Fusariumoxysporumf. sp.Momordicae，F(xiàn)OM)由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所保存提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 誘導(dǎo)方式 葉面噴霧誘導(dǎo)：配制5%氨基寡糖素1500倍液(Y-3處理)，于苦瓜2葉1心期首次噴施，每隔3 d噴施1次，共噴3次，3次重復(fù)，每重復(fù)40株；對照誘抗劑為0.5%幾丁聚糖300倍液(Y-1處理)和6.0%低聚糖素800倍液(Y-2處理)，以噴霧清水為空白對照(CK1)。使用微量噴霧系統(tǒng)將藥液均勻噴施于苦瓜葉面，噴霧量為200 μL/株。誘導(dǎo)24 h后用1×106個(gè)/mLFOM孢子懸浮液灌根接種。在接種后第15天調(diào)查苦瓜枯萎病發(fā)病情況及誘抗效果。

灌根誘導(dǎo)：配制5%氨基寡糖素1000倍液(G-3處理)，于苦瓜2葉1心期首次灌根，每株灌根50 mL，每隔3 d灌根1次，共灌3次，3次重復(fù)，每重復(fù)40株；對照誘抗劑為0.5%幾丁聚糖100倍液(G-1處理)和6%低聚糖素600倍液(G-2處理)，以清水灌根為空白對照(CK2)。誘導(dǎo)24 h后用1×106個(gè)/mLFOM孢子懸浮液灌根接種。在接種后第15天調(diào)查苦瓜枯萎病發(fā)病情況及誘抗效果。

1.2.2 最佳誘導(dǎo)濃度篩選 采用灌根誘導(dǎo)方式，設(shè)5%氨基寡糖素800倍液(NG1-1)、1000倍液(NG1-2)和1500倍液(NG1-3)3個(gè)濃度處理，以清水灌根為對照(NG1-CK)，3次重復(fù)，每重復(fù)40株，篩選5%氨基寡糖素灌根的最佳濃度，并以此濃度開展1.2.4和1.2.5試驗(yàn)。

1.2.3 枯萎病病情分級(jí)及誘抗效果評價(jià) 參考陳振東等[19]的方法進(jìn)行苦瓜枯萎病病情分級(jí)。無病癥為0級(jí)；子葉發(fā)黃為1級(jí)，子葉變黃且邊緣皺縮，但真葉正常為3級(jí)；子葉皺縮枯死、部分真葉發(fā)黃為5級(jí)；真葉發(fā)黃、部分葉片黃化或停止生長為7級(jí)；全株葉片黃化萎蔫或枯死為9級(jí)。病情指數(shù)(DI)為0表示免疫，0.01≤病情指數(shù)<15.00表示高抗(HR)，15.00≤病情指數(shù)<35.00表示抗病(R)，35.00≤病情指數(shù)<55.00表示中抗(MR)，55.00≤病情指數(shù)<75.00表示感病(S)，75.00≤病情指數(shù)<100.00表示高感(HS)。誘導(dǎo)抗病指數(shù)越高，表示誘導(dǎo)效果越好。

病情指數(shù)=∑(病株數(shù)×該級(jí)代表值)/(總株數(shù)×最高級(jí)代表值)×100

誘導(dǎo)抗病指數(shù)=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100

1.2.4 氨基寡糖素誘導(dǎo)對苦瓜病程相關(guān)蛋白酶活性的影響 配制5%氨基寡糖素1000倍液對苦瓜幼苗進(jìn)行灌根誘導(dǎo)(參照1.2.1中的灌根誘導(dǎo)方法)，分別設(shè)誘導(dǎo)不接種(T1)、誘導(dǎo)后接種(T2)、未誘導(dǎo)只接種(T3)和未誘導(dǎo)未接種(T4)4個(gè)處理，每處理50株。各處理苦瓜幼苗分別于誘導(dǎo)接種后0、1、2、4、6和8 d取苦瓜根部，參考蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的PAL試劑盒、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-GLU)試劑盒、POD試劑盒和PPO試劑盒說明分別進(jìn)行PAL、β-1,3-GA、POD和PPO活性測定。

1.2.5 氨基寡糖素誘導(dǎo)對枯萎病菌侵染苦瓜的影響 配制5%氨基寡糖素1000倍液(JG1)進(jìn)行灌根誘導(dǎo)(參照1.2.1中的灌根誘導(dǎo)方法)，設(shè)未誘導(dǎo)只接種為對照(JG-CK)。接種后0、2、4、6、8、10、14、18、22和26 d分別取苦瓜根組織備用。每處理50株，對照50株。采用酸性品紅染色法對苦瓜根系進(jìn)行處理，處理后取出放入培養(yǎng)皿中，用不加酸性復(fù)紅的乳酸液脫色30 min，置于TO型生物制片透明劑中透明2 min，在Olympus BX51顯微鏡下觀察菌絲侵染情況[20]。

1.2.6 氨基寡糖素誘導(dǎo)對苦瓜次生代謝物質(zhì)的影響 配制5%氨基寡糖素1000倍液進(jìn)行灌根誘導(dǎo)處理(參照1.2.1中的灌根誘導(dǎo)方法)，觀察苦瓜根、莖、葉的木質(zhì)素、酚類化合物和胼胝質(zhì)變化情況。分別設(shè)誘導(dǎo)不接種(J1)、誘導(dǎo)后接種(J2)、未誘導(dǎo)只接種(J3)和未誘導(dǎo)未接種(J4)4個(gè)處理，每處理50株。分別于接種后0、1、2、4、6和8 d取苦瓜+1葉和+2葉(中部葉片)、根(距土表0.5 cm處)和莖(距土表0.5 cm處)，將根莖處理成厚1.0 mm的薄片(橫切面)，葉片處理成4.0 mm葉盤，放入冰醋酸和95%酒精混合液(1∶1)中，固定24 h后置于飽和水合氯醛水溶液中，抽氣去氣泡靜置60 d，待植物組織透明后浸泡于無水乙醇中48 h，用蒸餾水清洗3次后備用。

采用Maule反應(yīng)方法測定誘導(dǎo)后苦瓜木質(zhì)素的沉積量，將透明過的根、莖、葉組織塊浸于1%(W/V)KMnO4溶液中15 min，水沖洗2次，再浸于2%(W/V)HCl中5 min，水沖洗后用4.0 mol/L NH4Cl溶液制片，在Olympus BX51顯微鏡下觀察熒光情況。

采用甲苯胺藍(lán)染色法測定誘導(dǎo)后苦瓜的酚類化合物含量，將透明過的根、莖、葉組織塊浸于 0.05%甲苯胺藍(lán)(溶于 0.05 mol/L檸檬酸緩沖液，pH 3.0)中 10 min，在相同溶液中制片，在 Olympus BX51顯微鏡下觀察熒光情況，并測定各組織的熒光平均強(qiáng)度。

采用苯胺藍(lán)染色法測定誘導(dǎo)后苦瓜的胼胝質(zhì)含量，在透明過的根、莖、葉組織塊上滴 5～10 滴 0.5%(W/V)苯胺藍(lán)(溶于50%乙醇中)染色 4～8 h，50%乙醇(新配制)中沖洗制片，在 Olympus BX51顯微鏡下觀察熒光情況，并測定各組織的熒光平均強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007、DPSV 15.10和網(wǎng)頁版ImageJ.JS(https://cnij.imjoy.io/)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 5%氨基寡糖素葉面噴霧和灌根處理對苦瓜幼苗枯萎病抗性的影響

由表1可知，苦瓜幼苗葉面噴霧Y-1、Y-2和Y-3誘導(dǎo)接種15 d后，其枯萎病病株率分別為82.35%、94.44%和52.63%，其中，Y-1和Y-3處理分別較CK1降低5.15%和34.87%(絕對值，下同)，Y-2處理較CK1提高6.94%；Y-1、Y-2和Y-3處理的苦瓜病情指數(shù)分別為54.90、62.34和30.83，其中，Y-1和Y-2處理的病情指數(shù)分別較CK1提高0.73和8.17，Y-3處理的病情指數(shù)較CK1降低23.34；Y-1、Y-2和Y-3處理的誘導(dǎo)抗病指數(shù)分別為-1.34、-15.08和43.09，其中，Y-3處理的誘導(dǎo)抗病指數(shù)極顯著高于Y-1和Y-2處理(P<0.01，下同)，Y-1處理與Y-2處理的誘導(dǎo)抗病指數(shù)差異不顯著(P>0.05，下同)。說明5%氨基寡糖素1500倍液噴霧對苦瓜幼苗枯萎病抗性的誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于噴施0.5%幾丁聚糖300倍液和6.0%低聚糖素800倍液。

表1 誘導(dǎo)劑葉面噴霧和灌根處理對苦瓜幼苗枯萎病的抗性誘導(dǎo)效果

從表1可看出，苦瓜幼苗灌根G-1、G-2和G-3誘導(dǎo)接種15 d后，其枯萎病病株率分別為93.75%、91.67%和50.00%，分別較CK2降低6.25%、8.33%和50.00%；G-1、G-2和G-3處理的病情指數(shù)分別為75.69、87.96和25.00，其中，G-1和G-3處理分別較CK2降低8.75和59.44，G-2處理較CK2提高3.52；G-1、G-2和G-3處理的誘導(dǎo)抗病指數(shù)分別為10.36、-4.16和70.39，其中，G-3處理的誘導(dǎo)抗病指數(shù)極顯著高于G-1和G-2處理，G-1處理顯著高于G-2處理(P<0.05，下同)。說明5%氨基寡糖素1000倍液灌根對苦瓜幼苗枯萎病抗性的誘導(dǎo)效果優(yōu)于0.5%幾丁聚糖100倍液和6.0%低聚糖素600倍液灌根。

2種枯萎病抗性誘導(dǎo)方式的最佳誘導(dǎo)效果比較結(jié)果表明，5%氨基寡糖素1000倍液灌根對苦瓜幼苗枯萎病抗性的誘導(dǎo)抗病指數(shù)(70.39)較5%氨基寡糖素1500倍液噴霧的誘導(dǎo)抗病指數(shù)(40.09)高27.30。因此，下一步以氨基寡糖素灌根誘導(dǎo)方式開展誘導(dǎo)濃度篩選試驗(yàn)。

2.2 5%氨基寡糖素灌根誘導(dǎo)苦瓜幼苗枯萎病抗性的濃度篩選結(jié)果

前期試驗(yàn)結(jié)果表明，以5%氨基寡糖素進(jìn)行灌根較葉面噴霧更適合苦瓜苗期枯萎病抗性誘導(dǎo)，因此，進(jìn)一步開展氨基寡糖素灌根誘導(dǎo)濃度篩選試驗(yàn)。由表2可知，苦瓜幼苗灌根NG1-1、NG1-2和NG1-3誘導(dǎo)接種15 d后，其枯萎病病株率分別為50.00%、37.50%和50.00%，分別較NG1-CK降低50.00%、62.50%和50.00%；病情指數(shù)分別為27.22、19.44和26.11，分別較NG1-CK降低64.59、72.37和65.70；誘導(dǎo)抗病指數(shù)分別為70.35、73.24和71.56，其中，NG1-2處理的誘導(dǎo)抗病指數(shù)最高，但三者間無顯著差異。說明5%氨基寡糖素800倍液、1000倍液和1500倍液灌根對苦瓜枯萎病均具有較好的誘抗效果，且抗性均達(dá)抗病(R)水平，其中1000倍液的誘導(dǎo)抗病效果最佳。因此，以5%氨基寡糖素1000倍液灌根進(jìn)一步開展其他試驗(yàn)。

表2 不同濃度5%氨基寡糖素對苦瓜幼苗枯萎病的抗性誘導(dǎo)效果比較

2.3 5%氨基寡糖素對苦瓜根系病程相關(guān)蛋白酶活性的影響

2.3.1 對PPO活性的影響 從圖1-A可看出，T1、T2和T3處理的PPO活性在誘導(dǎo)或接種后迅速升高，處理1 d即達(dá)峰值，以T2處理的峰值明顯高于其他處理，隨后3個(gè)處理的PPO活性均開始逐漸下降，至處理第6天又開始上升，處理第8天達(dá)第二峰值，但3個(gè)處理間差異較??；而T4處理的PPO活性在處理后1 d升幅較小，且在處理1 d后均均處于降低狀態(tài)?？梢姡?%氨基寡糖素誘導(dǎo)和接種均可提高苦瓜幼苗根系組織的PPO活性，并維持在較高水平，有利于提高苦瓜幼苗抵抗枯萎病侵染的能力，尤其以誘導(dǎo)后接種(T2處理)的效果更佳。

2.3.2 對PAL活性的影響 從圖1-B可看出，T2處理的PAL活性在處理后1 d達(dá)峰值，之后活性緩慢降低，在處理第2天又緩慢升高，并保持在較平穩(wěn)的高水平；T1處理的PAL活性在處理后1 d達(dá)峰值，隨后快速降低，處理第2天快速升高，并在處理第4天達(dá)第二峰值，隨后呈降低趨勢；T3處理的PAL活性分別在處理的第1天和第6天出現(xiàn)2個(gè)峰值，但升高幅度不大；T4處理的PAL活性在處理后呈波動(dòng)降低趨勢。說明5%氨基寡糖素誘導(dǎo)和接種均可提高苦瓜根系組織的PAL活性，并維持在較高水平，有利于提高苦瓜幼苗抵抗枯萎病侵染的能力，尤其以誘導(dǎo)后接種(T2處理)的效果更佳。

2.3.3 對POD活性的影響 從圖1-C可看出，T1、T2和T3處理的POD活性變化趨勢一致，均在處理后迅速升高，處理第2天達(dá)峰值，隨后活性急劇下降，在處理第4天活性降至谷底后又迅速升高，處理第8天達(dá)第二峰值，2個(gè)峰值均以T2處理最高；T4處理的POD活性變化較平緩，無明顯的升降變化。說明5%氨基寡糖素誘導(dǎo)和接種均可迅速提高苦瓜根系組織的POD活性，有利于提高苦瓜幼苗抵抗枯萎病侵染的能力，尤其以誘導(dǎo)后接種(T2處理)的效果更佳。

2.3.4 對β-1,3-GLU活性的影響 圖1-D表明，T2處理的β-1,3-GLU活性在處理后快速升高，并在處理的第1天達(dá)峰值，隨后活性開始下降，處理的第2天降至T4處理水平，之后活性上升，在處理的第6天達(dá)第二峰值；T1處理的β-1,3-GLU活性在處理后快速升高，在處理的第1天達(dá)峰值，隨后活性開始下降，在處理2 d后又繼續(xù)升高，在處理的第6天達(dá)第二峰值，且該峰值明顯高于其他處理；T3處理的β-1,3-GLU活性變化趨勢與T2處理相似，但活性整體較T2處理低；T4處理β-1,3-GLU活性的升降變化平緩。說明5%氨基寡糖素誘導(dǎo)和接種均可迅速提高苦瓜根系組織的β-1,3-GLU活性，有利于提高破壞真菌細(xì)胞壁能力，從而提高抵抗枯萎病能力。

A、B、C、D分別代表PPO、PAL、POD、β-1,3-GLU活性A，B，C and D represented activities of PPO，PAL，POD and β-1,3-GLU，respectively 圖1 5%氨基寡糖素誘導(dǎo)接種后苦瓜幼苗PPO、PAL、POD和GLU活性的變化情況Fig.1 Activity changes of PPO，PAL，POD and GLU in bitter gourd seedlings after being induced by 5% amino-oligosaccharide and inoculation

2.4 5%氨基寡糖素誘導(dǎo)對枯萎病菌侵染苦瓜的影響

經(jīng)顯微觀察，經(jīng)5%氨基寡糖素誘導(dǎo)接種后6 d，苦瓜根系中開始有枯萎病菌侵染(圖2-A)，接種后6～14 d根系中觀察到少量菌絲，接種后18 d出現(xiàn)大量菌絲(圖2-B)，接種后22 d開始出現(xiàn)孢子(圖2-C)，接種后24 d產(chǎn)生大量孢子；而對照(JG-CK)在接種后2 d即發(fā)現(xiàn)有菌絲產(chǎn)生(圖2-D)，接種后8 d出現(xiàn)大量菌絲并產(chǎn)生孢子(圖2-E)，接種后14 d產(chǎn)生大量孢子(圖2-F)?？梢姡?%氨基寡糖素誘導(dǎo)不能阻止苦瓜枯萎病菌菌絲對根系的侵染，但可延緩枯萎病菌的侵染時(shí)間，同時(shí)可阻止菌絲進(jìn)一步發(fā)展和抑制孢子形成。

2.5 5%氨基寡糖素誘導(dǎo)對苦瓜次生代謝物質(zhì)的影響

2.5.1 對苦瓜木質(zhì)素沉積的影響 在5%氨基寡糖素誘導(dǎo)后接種0 d取樣發(fā)現(xiàn)，J1或J2處理苦瓜幼苗的根、莖和葉片中均出現(xiàn)木質(zhì)素沉積現(xiàn)象，根細(xì)胞組織(圖3-A)、莖組織的韌皮部和木質(zhì)部(圖3-B)及葉面細(xì)胞壁(圖3-C)均出現(xiàn)木質(zhì)素沉積，但J1處理與J2處理差異不明顯；隨著處理時(shí)間的延長，根、莖和葉片中木質(zhì)素沉積量明顯增加，J1或J2處理的木質(zhì)素沉積量在根組織的細(xì)胞壁(圖3-D)、莖組織的細(xì)胞壁和韌皮部(圖3-E)及葉片的大葉脈和細(xì)胞壁(圖3-F)沉積明顯。說明經(jīng)5%氨基寡糖素誘導(dǎo)后的苦瓜組織均存在不同程度的木質(zhì)素沉積現(xiàn)象。

2.5.2 對苦瓜酚類化合物代謝變化的影響 從圖4～5可看出，在J1或J2處理的根組織中，接種后0 d開始出現(xiàn)熒光信號(hào)(圖4-A)，有酚類物質(zhì)沉積(圖5-A)，隨后平均熒光強(qiáng)度呈上升趨勢，接種后2和6 d平均熒光強(qiáng)度分別達(dá)峰值，酚類物質(zhì)沉積量較大(圖5-B)，接種后8 d平均熒光強(qiáng)度降低，酚類物質(zhì)沉積減少(圖5-C)；而在J3和J4處理的根系組織中，接種后0 d出現(xiàn)微弱熒光信號(hào)(圖4-A)，J3處理在接種后1 d平均熒光強(qiáng)度達(dá)峰值，隨后緩慢下降，J4處理在接種后2和8 d平均熒光強(qiáng)度分別達(dá)峰值，但整體波動(dòng)不大，熒光信號(hào)不強(qiáng)。在J1或J2處理的莖組織中，接種后0 d無明顯熒光信號(hào)(圖4-B)，有少量酚類物質(zhì)沉積(圖5-D)，接種后1 d開始出現(xiàn)熒光信號(hào)，有酚類物質(zhì)沉積(圖5-E)，隨后熒光信號(hào)迅速增強(qiáng)，平均熒光強(qiáng)度在接種后4 d達(dá)峰值，酚類物質(zhì)沉積量較大(圖5-F)，接種后6 d熒光信號(hào)減弱，接種后8 d信號(hào)繼續(xù)增強(qiáng)，其中J2處理的平均熒光強(qiáng)度出現(xiàn)第二峰值；而在J3和J4處理的莖組織中，接種后0 d無明顯熒光信號(hào)(圖4-B)，隨后平均熒光強(qiáng)度緩慢增強(qiáng)，J3處理在接種后4 d出現(xiàn)峰值，J4處理在接種后6 d出現(xiàn)峰值，但熒光強(qiáng)度均不強(qiáng)。在J1或J2處理的葉組織中，接種后0 d開始出現(xiàn)熒光信號(hào)(圖4-C)，有酚類物質(zhì)沉積(圖5-G)，接種后4 d熒光信號(hào)最強(qiáng)，酚類物質(zhì)沉積量較大(圖5-H)，隨后熒光信號(hào)減弱，至接種后8 d熒光信號(hào)繼續(xù)減弱，酚類無明顯沉積(圖5-I)。說明經(jīng)5%氨基寡糖素誘導(dǎo)后，苦瓜幼苗根、莖和葉片中均出現(xiàn)不同程度的酚類化合物沉積現(xiàn)象。

A、B、C分別代表氨基寡糖素誘導(dǎo)接種后6、18和22 d苦瓜幼苗根系受枯萎病菌侵染情況；D、E、F分別代表對照接種后2、8和14 d苦瓜幼苗根系受枯萎病菌侵染情況；M代表菌絲；S代表孢子A，B and C represented the wilt pathogen infection status of bitter gourd seedlings induced and inoculated with amino-oligosaccharide on 6，18 and 22 days，respectively；D，E and F represented the wilt pathogen infection status of bitter gourd seedlings in the control on 2，8 and 14 days of inoculation；M represented mycelium；S represented spore圖2 5%氨基寡糖素誘導(dǎo)接種后苦瓜幼苗根系枯萎病菌的侵染情況Fig.2 Wilt pathogen infection status in bitter gourd roots after being induced and inoculated by 5% amino-oligosaccharides

A、D分別代表誘導(dǎo)接種后0和8 d J1處理根系木質(zhì)素的沉積情況；B、E分別代表誘導(dǎo)接種后0和8 d J2處理莖木質(zhì)素的沉積情況；C、F分別代表誘導(dǎo)接種后0和6 d J1處理葉片木質(zhì)素的沉積情況A and D represented root lignin deposition on 0 and 8 days of J1 treatment after induction and inoculation，respectively；B and E represented stem lignin deposition on 0 and 8 days of J2 treatment after induction and inoculation；C and F represented leaf lignin deposition on 0 and 6 days of J1 treatment after induction and inoculation圖3 5%氨基寡糖素誘導(dǎo)接種后苦瓜幼苗根、莖和葉木質(zhì)素的沉積情況Fig.3 The dynamic changes of lignin in root，stem and leaf of bitter gourd seedlings after being induced by 5% amino-oligosaccharide and inoculation

A、B、C分別代表根、莖和葉組織酚類化合物的平均熒光強(qiáng)度A，B and C represented the mean gray value change of phenolic compounds in root，stem and leaf，respectively 圖4 5%氨基寡糖素誘導(dǎo)接種后苦瓜幼苗酚類化合物平均熒光強(qiáng)度的變化情況Fig.4 Mean gray value changes of phenolic compounds in bitter gourd seedlings after being induced by 5% amino-oligosaccharide and inoculation

A、B、C代表誘導(dǎo)接種后0、6和8 d J2處理根系酚類化合物的沉積情況；D、E、F代表誘導(dǎo)接種后0、1和8 d J2處理莖酚類化合物的沉積情況；G、H、I代表誘導(dǎo)接種后0、4和8 d J2處理葉片酚類化合物的沉積情況A，B and C represented root phenolic compound deposition on 0，6 and 8 days of J2 treatment after induction and inoculation；D，E and F represented stem phenolic compound deposition on 0,1 and 8 days of J2 treatment after induction and inoculation；G，H and I represented leaf phenolic compound deposition on 0, 4 and 8 days of J2 treatment after induction and inoculation圖5 5%氨基寡糖素誘導(dǎo)接種后苦瓜幼苗根、莖和葉酚類化合物的沉積情況Fig.5 Phenolic compound deposition in root，stem and leaf of bitter gourd seedlings after being induced by 5% amino-oligosaccharide and inoculation

2.5.3 誘導(dǎo)后苦瓜胼胝質(zhì)的變化 從圖6～7可看出，在J1或J2處理的根組織中，接種后0 d出現(xiàn)熒光信號(hào)(圖6-A)，隨后平均熒光強(qiáng)度呈上升趨勢，接種后4 d平均熒光強(qiáng)度達(dá)峰值，胼胝質(zhì)沉積量較大，隨后熒光信號(hào)和平均熒光強(qiáng)度減弱(圖7-A)；而在J3和J4處理的根系組織中，接種后0 d出現(xiàn)微弱熒光信號(hào)(圖6-A)，其中，J3處理隨后呈緩慢上升趨勢，接種后4 d達(dá)峰值，隨后急劇下降，而J4處理的熒光信號(hào)波動(dòng)相對平緩，熒光強(qiáng)度處于較低水平(圖7-A)。在J1或J2處理的莖組織中，接種后0 d有微弱熒光信號(hào)(圖6-B)，接種后1 d到第一峰值，但平均熒光強(qiáng)度較低，隨后呈下降趨勢，胼胝質(zhì)沉積不明顯，接種后4 d后熒光信號(hào)迅速增強(qiáng)，平均熒光強(qiáng)度在接種后8 d達(dá)峰值，胼胝質(zhì)沉積量較大(圖7-B)；而在J3和J4處理的莖組織中，接種后0 d無明顯熒光信號(hào)(圖6-B)，隨后平均熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，但整體波動(dòng)不大，熒光強(qiáng)度均不高(圖7-B)。在J1或J2處理的葉組織中，接種后0 d開始出現(xiàn)熒光信號(hào)(圖6-C)，有胼胝質(zhì)沉積，接種后6 d J1處理的熒光信號(hào)最強(qiáng)，胼胝質(zhì)沉積量較大(圖7-C)，隨后熒光信號(hào)減弱，接種后8 d熒光信號(hào)不明顯，胼胝質(zhì)無明顯沉積，而J2處理在接種后2 d熒光信號(hào)最強(qiáng)(圖6-C)，胼胝質(zhì)沉積量較大，隨后熒光信號(hào)減弱，接種后8 d熒光信號(hào)不明顯，胼胝質(zhì)無明顯沉積(圖7-C)。說明經(jīng)5%氨基寡糖素誘導(dǎo)后，苦瓜幼苗根、莖和葉片中均出現(xiàn)不同程度的胼胝質(zhì)沉積現(xiàn)象。

3 討 論

氨基寡糖素作為一種新型植物免疫誘抗劑在抗病誘導(dǎo)方面具有較好效果，已受到越來越多研究者的關(guān)注。已有研究表明，氨基寡糖素可誘導(dǎo)棉花抗枯黃萎病[13]、番茄抗早疫病[21]、香蕉抗褐緣灰斑病[22]和火龍果抗?jié)儾23]。檀志全等[24]研究發(fā)現(xiàn)，5%氨基寡糖素對葡萄霜霉病的預(yù)防效果為78.29%，對葡萄炭疽病的預(yù)防效果為60.00%。李育林[25]研究發(fā)現(xiàn)，噴施3%氨基寡糖素250倍液對葡萄霜霉病的防效達(dá)74.73%。本研究結(jié)果表明，5%氨基寡糖素1000倍液灌根可有效誘導(dǎo)苦瓜對枯萎病的抗性，誘導(dǎo)接種后的苦瓜枯萎病病情指數(shù)降低59.44，對枯萎病的抗性達(dá)抗病(R)水平，誘導(dǎo)抗病指數(shù)為70.39，與上述研究結(jié)果相似。

A、B、C分別代表根、莖和葉組織胼胝質(zhì)的平均熒光強(qiáng)度A，B and C represented the mean gray value change of callose in root，stem and leaf，respectively 圖6 5%氨基寡糖素誘導(dǎo)接種后苦瓜幼苗胼胝質(zhì)的平均熒光強(qiáng)度的變化情況Fig.6 Mean gray value changes of callose in bitter gourd seedlings after being induced by 5% amino-oligosaccharide and inoculation

A代表誘導(dǎo)接種后6 d J2處理根系的胼胝質(zhì)沉積情況；B代表誘導(dǎo)接種后2 d J1處理莖的胼胝質(zhì)沉積情況；C代表誘導(dǎo)接種后6 d J1處理葉片的胼胝質(zhì)沉積情況A represented root callose deposition on 6 days of J2 treatment after induction and inoculation；B represented stem callose deposition on 2 days of J1 treatment after induction and inoculation；C represented leaf callose deposition on 6 days of J1 treatment after induction and inoculation圖7 5%氨基寡糖素誘導(dǎo)接種后苦瓜幼苗根、莖和葉胼胝質(zhì)的沉積情況Fig.7 Callose deposition in root, stem and leaf of bitter gourd seedlings after being induced by 5% amino-oligosaccharide and inoculation

在病原菌侵染過程中，寄主植物為抵抗病原菌侵染會(huì)啟動(dòng)自身的免疫系統(tǒng)，促進(jìn)細(xì)胞壁次生代謝物質(zhì)活性提高及植保素和病程相關(guān)蛋白合成等誘導(dǎo)抗病性反應(yīng)。苯丙烷代謝途徑是植物最重要的次生代謝途徑之一，由這一途徑產(chǎn)生的次生物質(zhì)木質(zhì)素和酚類物質(zhì)在植物生長發(fā)育、抵御病蟲害及構(gòu)成植物支撐系統(tǒng)等方面具有重要意義。PAL和POD均是植物苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶，與木質(zhì)素、植保素和酚類化合物等抗性物質(zhì)的形成密切相關(guān)[26]。PPO可催化木質(zhì)素和酚類氧化產(chǎn)物的形成，產(chǎn)生保護(hù)性屏蔽[27]。β-1,3-GLU是植物真菌病的重要抗性物質(zhì)之一，通過水解β-1,3-葡聚糖破壞真菌細(xì)胞壁而導(dǎo)致病原真菌死亡，發(fā)揮防御病害作用[28-30]。Liu等[31]研究發(fā)現(xiàn)，以苯并噻二唑(ASM)處理甜瓜，可激活甜瓜果實(shí)的內(nèi)苯丙烷代謝相關(guān)酶活性及增強(qiáng)相關(guān)代謝物質(zhì)含量，從而加強(qiáng)果實(shí)細(xì)胞壁和防止病原入侵。商文靜[32]研究表明，殼寡糖誘導(dǎo)后煙葉體內(nèi)與抗病性相關(guān)的各種防御酶活性均發(fā)生不同程度變化，PAL活性在接種后大幅度升高。王杰等[33]噴施6.25 mg/L氨基寡糖素能系統(tǒng)誘導(dǎo)煙草POD、PAL和SOD活性，提高煙草抗病性。袁新琳等[13]研究表明，氨基寡糖素能誘導(dǎo)棉葉中POD、PPO和PAL活性提高。本研究中，5%氨基寡糖素誘導(dǎo)可有效提高苦瓜幼苗根系中的PPO、PAL和POD活性，與前人研究結(jié)果一致[13]；經(jīng)過氨基寡糖素誘導(dǎo)接種后6 d，苦瓜根系開始有枯萎病菌侵染，接種后6～14 d根系中觀察到少量菌絲，而對照在接種后2 d即發(fā)現(xiàn)有菌絲產(chǎn)生，接種后8 d出現(xiàn)大量菌絲，接種后14 d有大量孢子產(chǎn)生，說明氨基寡糖素誘導(dǎo)可延緩枯萎病菌侵染時(shí)間，同時(shí)可阻止菌絲進(jìn)一步發(fā)展和抑制孢子形成，與石延霞等[12]、孫輝[34]、石延霞[35]的研究結(jié)果一致，表明誘抗劑氨基寡糖素可有效誘導(dǎo)植物枯萎病的抗性，推測其抗性生理機(jī)理可能是通過苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶調(diào)控木質(zhì)素和酚類化合物沉淀，進(jìn)而直接阻礙枯萎病菌菌絲對苦瓜的侵染而增強(qiáng)苦瓜對枯萎病的防御能力；誘導(dǎo)β-1,3-GLU提高，有效延緩苦瓜枯萎病菌的擴(kuò)展速度。

4 結(jié) 論

5%氨基寡糖素誘導(dǎo)可激發(fā)苦瓜抗病免疫系統(tǒng)啟動(dòng)，提高苦瓜幼苗根系的PPO、PAL、POD和β-1,3-GLU活性，促進(jìn)苦瓜根、莖和葉組織細(xì)胞壁中木質(zhì)素和酚類物質(zhì)沉積，木質(zhì)化程度增加，增強(qiáng)苦瓜對枯萎病的防御能力，延緩苦瓜枯萎病菌的擴(kuò)展速度，有效誘導(dǎo)苦瓜枯萎病的抗性。