關(guān)家樂,張一凡,朱 晶,梁春艷,朱旻鵬,肖志剛
(沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院,沈陽 110034)
高水分組織化植物蛋白具有與動(dòng)物肉相似的產(chǎn)品特性和感官[1],營養(yǎng)特性、質(zhì)地、味道和外觀與肉類相似[2],在飲食上以組織化植物蛋白替代動(dòng)物蛋白可降低人們體重、膽固醇和血壓水平,從而降低患心臟病和癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[3]。雖然高水分組織化植物蛋白可以與動(dòng)物肉的纖維結(jié)構(gòu)相媲美,但要達(dá)到與動(dòng)物肌肉組織對(duì)產(chǎn)品整體感官特性的影響效果仍然具有挑戰(zhàn)性[4]。通過顯微鏡觀察,擠壓變性的組織化植物蛋白不具有肌肉纖維或纖維束的三維各向異性結(jié)構(gòu),肌肉纖維的質(zhì)地及其固定水分的毛細(xì)作用才是肉類最理想的結(jié)構(gòu)屬性[5]。所以為了彌補(bǔ)這些差異,通常在植物替代產(chǎn)品中添加各種增稠劑、水結(jié)合劑和質(zhì)地增強(qiáng)劑等以改善組織化蛋白持水和持油性。淀粉具有獨(dú)特的增稠、凝膠、黏結(jié)、成膜、潤脹、糊化等特性,可作為增稠劑、增強(qiáng)劑,增強(qiáng)組織化蛋白產(chǎn)品保水性,改善口感和色澤,使擠壓過程以及產(chǎn)品的性質(zhì)穩(wěn)定[6]。Bon-Yeob等[7]研究表明添加10%玉米淀粉的組織化大豆蛋白比純組織化大豆蛋白具有更好蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。Zhang等[8]研究高水分?jǐn)D壓花生蛋白時(shí),加入2%小麥淀粉,使擠出物氫鍵的數(shù)量顯著增加,疏水作用、氫鍵與二硫鍵的相互作用均顯著增強(qiáng)。Nanta等[9]研究羥丙基淀粉對(duì)組織化大豆蛋白產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)特性的影響,添加羥丙基淀粉的組織化蛋白產(chǎn)品的硬度和膠著性均比對(duì)照樣品有所降低。木薯淀粉(CS)分子內(nèi)和分子間存在大量氫鍵,糊化溫度低,能較早吸水溶脹,可改善肉制品的吸水、吸油性。乙?;矸哿姿狨?ADSP)具有較好的凝膠性,在肉制品中作為凝膠劑、保水劑、增稠劑和組織賦形劑。羥丙基淀粉(HS)在高溫下黏度高并且穩(wěn)定,與蛋白的加熱變性同時(shí)發(fā)生可增加蛋白三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[10]。這3種淀粉均有改善組織化蛋白品質(zhì)的潛力,研究高水分?jǐn)D壓條件下淀粉類添加劑與植物蛋白的相互作用,對(duì)改善組織化植物蛋白食品的結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。
本實(shí)驗(yàn)利用雙螺桿擠壓機(jī)生產(chǎn)高水分組織化花生蛋白,研究木薯淀粉、乙酰化二淀粉磷酸酯和羥丙基淀粉對(duì)組織化花生蛋白品質(zhì)改良和蛋白結(jié)構(gòu)的影響,為組織化植物蛋白的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。
花生蛋白粉(蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)59.6%,干基);大豆分離蛋白(蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)87.4%,干基);木薯淀粉、乙酰化二淀粉磷酸酯、羥丙基淀粉,均為食品級(jí);磷酸鹽緩沖液、尿素(Urea)、十二烷基硫酸鈉(SDS),均為分析純;2-巰基乙醇(2-ME)為生物級(jí)。
DS56-Ⅲ雙螺桿擠壓機(jī);CT3質(zhì)構(gòu)儀;CR-400色彩色差計(jì);VETEX80傅里葉紅外光譜儀;S4800掃描電子顯微鏡;Scientz-12冷凍干燥機(jī);DR-3000酶標(biāo)分析儀。
1.2.1 高水分組織化花生蛋白的制備
采用雙螺桿擠壓機(jī)擠出、冷卻成型,擠壓機(jī)由進(jìn)料、擠壓和控制系統(tǒng)組成,螺桿直徑36 mm,長徑比為40∶1?;ㄉ鞍追酆痛蠖狗蛛x蛋白按4∶1比例混合,將木薯淀粉、乙?;矸哿姿狨ズ土u丙基淀粉分別按0%、3%、6%、9%和12%的比例加入后混合均勻。擠壓參數(shù)設(shè)置:5段控溫雙螺桿擠壓機(jī)各段由進(jìn)料端至出料端的溫度設(shè)置分別為60、80、130、160、160 ℃,螺桿轉(zhuǎn)速 280 r/min,喂料速度8.5 kg/h,冷卻溫度55 ℃、物料含水量60%。
1.2.2 組織化度測定
樣品裁剪形狀如圖1所示,厚度為10 mm,擠出方向如圖1所示(FV)。采用 NONE 探頭和TA-SBA夾具對(duì)樣品進(jìn)行剪切,剪切程度為樣品厚度的70%,設(shè)置測試前速度、測試速度和測試后速度均為1 mm/s,組織化度為橫向剪切力所做的功與縱向剪切力所做的功的比值[11],每個(gè)樣品測量5次,取平均值。
圖1 組織化度測定樣品形狀示意圖
1.2.3 色澤測定
采用色差儀對(duì)花生蛋白組織化樣品的5個(gè)不同部位測定色澤,取平均值,應(yīng)用L*、a*、b*表色系。L*為明度指數(shù),值越大表明被測物越白亮。a*為紅色度、b*為黃色度,ΔE表示產(chǎn)品與白色板的色差。
(1)
1.2.4 質(zhì)構(gòu)測定
選取硬度、內(nèi)聚性、彈性、咀嚼性和膠著性5個(gè)指標(biāo)反映擠出物的質(zhì)構(gòu)特性。測定樣品邊長為25 mm的正方形。質(zhì)構(gòu)儀的操作參數(shù)為:TPA 模式,探頭 TA7,測試前、后速度均為1.0 mm/s,下壓程度10%。每個(gè)樣品測量5次,取平均值。
1.2.5 吸水、吸油能力
吸水能力(WAC)和吸油能力(OAC)的測定采用Sosulski等[12]方法,并略有修改。WAC測定:2 g凍干研磨樣品與30 mL蒸餾水充分混合1 min,3 000 r/min離心30 min,離心后丟棄上清液,稱樣品的離心管質(zhì)量,WAC表示為每克樣品吸收水量。OAC測定:將1 g凍干研磨樣品與10 mL玉米油于預(yù)稱重的離心管中混合,攪拌2 min,使樣品完全分散在油中,28 ℃靜置30 min,3 000 r/min離心30 min,丟棄上清液倒置10 min,瀝干油后稱重,OAC表示為每克樣品吸油量。所有樣品均重復(fù)測定3次取平均值。
(2)
(3)
式中:m0、O0為干燥樣品質(zhì)量/g;m1、O1為離心管與樣品總質(zhì)量/g;m2、O2為離心管與沉淀物總質(zhì)量/g。
1.2.6 傅里葉變換紅外光譜分析(FT-IR)
根據(jù)Wang等[13]方法,準(zhǔn)確稱量2 mg樣品及198 mg KBr ,使用液壓機(jī)將其制成1~2 mm厚薄片。共進(jìn)行了64次掃描,分辨率為4 cm-1,掃描范圍為400~4 000 cm-1。溴化鉀粉末作為空白,通過peakfit軟件進(jìn)行紅外光譜擬合處理求蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。
1.2.7 蛋白質(zhì)溶解度測定
根據(jù)張金闖[14]的方法配制浸提溶劑:①0.04 mol/L pH 7.6,磷酸鹽緩沖液(P);②pH 7.6,P+8 mol/L Urea溶解液;③pH 7.6,P+0.1 mol/L 2-ME溶解液;④pH 7.6,P+1.5%SDS溶解液;⑤ pH 7.6,P+8 mol/L Urea+0.1 mol/L 2-ME溶解液;⑥ pH 7.6,P+8 mol/L Urea+1.5%SDS溶解液;⑦pH 7.6,P+1.5%SDS+0.1 mol/L 2-ME溶解液;⑧pH 7.6,P+8 mol/L Urea+1.5%SDS+0.1 mol/L 2-ME溶解液。
樣品浸提與稀釋:不同擠壓區(qū)段樣品經(jīng)過冷凍干燥后,粉碎,過80目篩網(wǎng)。取粉狀樣品0.25 g于25 mL燒杯中,分別加入10 mL8種溶劑,常溫下攪拌浸提1 h后,放入冰箱4 ℃保存,離心(12 000 g,10 ℃,15 min),取上清液。沉淀中再分別加入10 mL 8種浸提溶劑,重復(fù)浸提2次,離心。取0.05 mL上清液于1.5 mL離心管中,加入0.95 mL去離子水,將上清液稀釋20倍,用搖床混勻(160 r/min,1 h)。加20 μL上清液到 96 孔酶標(biāo)板中,采用 Lowery法測得(測定波長650 nm)上清液中可溶性蛋白含量,原料和擠出樣品中總的蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測定。
蛋白質(zhì)白質(zhì)溶解度=
(4)
總蛋白質(zhì)量濃度=
(5)
根據(jù) Chen等[15]的方法,對(duì)蛋白質(zhì)不同結(jié)合狀態(tài)化學(xué)交聯(lián)鍵分析:(1)天然狀態(tài)蛋白,①;(2)氫鍵,②-①;(3)二硫鍵,③-①;(4)疏水相互作用,④-①;(5)氫鍵和二硫鍵交互作用,⑤+①-②-③;(6)氫鍵和疏水相互作用交互作用,⑥+①-②-④;(7)疏水相互作用和二硫鍵交互作用,⑦+①-③-④;(8)氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵交互作用,⑧+②+③+④-①-⑤-⑥-⑦。
1.2.8 掃描電子顯微鏡(SEM)
將擠壓樣品沿縱向切割,樣品冷凍干燥48 h,并使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡在5 kV電子束操作下分析擠壓樣品切面微觀結(jié)構(gòu),放大倍數(shù)500倍。
運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,每組實(shí)驗(yàn)做3次平行,采用Duncan對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析(P<0.05),利用Origin 2017軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖處理,結(jié)果的表達(dá)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的方式。
由圖2可知,隨著ADSP和HS含量的增加,產(chǎn)品組織化度先增加后降低,添加3%的ADSP和6%的HS可提高產(chǎn)品組織化度,而添加CS對(duì)產(chǎn)品組織化度沒有顯著改善。添加少量淀粉可提高產(chǎn)品組織化度,改善組織結(jié)構(gòu),產(chǎn)品纖維狀結(jié)構(gòu)比較細(xì),排列緊密。這說明添加淀粉有利于沿?cái)D壓方向形成纖維結(jié)構(gòu),使組織化蛋白產(chǎn)品結(jié)構(gòu)緊密。分散在蛋白質(zhì)分子之間的淀粉可以改善蛋白的流動(dòng)性和柔韌性,進(jìn)一步促進(jìn)各向異性纖維結(jié)構(gòu)的形成。添加12%CS、12%ADSP和12%HS組織化度下降,纖維狀結(jié)構(gòu)比較粗,結(jié)構(gòu)松軟。添加大量淀粉形成的淀粉-蛋白質(zhì)復(fù)合物會(huì)阻礙蛋白質(zhì)的結(jié)合和聚合,此外,淀粉和蛋白之間的作用力可能導(dǎo)致產(chǎn)品更高的表面張力,從而阻止纖維結(jié)構(gòu)的形成[16]。淀粉含量越高,淀粉本身的膨化作用增大了組織化蛋白產(chǎn)品組織結(jié)構(gòu)間的縫隙,不利于產(chǎn)品成型。
圖2 淀粉對(duì)組織化蛋白產(chǎn)品組織化度的影響
由表1可知,隨著淀粉含量的增加組織化蛋白產(chǎn)品L*值逐漸升高,a*、b*和ΔE降低,產(chǎn)品色澤越來越明亮。常曉明等[17]研究表明淀粉的添加顯著地影響了大豆組織化蛋白的顏色,并且添加量越高產(chǎn)品顏色越淺。添加ADSP組織化蛋白產(chǎn)品L*值顯著高于另外2種淀粉,且產(chǎn)品a*、b*和ΔE顯著低于其他淀粉,這可能由于ADSP糊化后比其他2種淀粉具有更高的透明度。添加CS組織化蛋白產(chǎn)品L*值較低,可能由于CS中含有較多的支鏈淀粉,支鏈淀粉能促進(jìn)蛋白質(zhì)分子間的相互作用,導(dǎo)致游離氨基的丟失[18],有利于發(fā)生美拉德反應(yīng)導(dǎo)致產(chǎn)品顏色加深。Hellemans等[19]研究表明支鏈淀粉對(duì)分子降解更為敏感,會(huì)轉(zhuǎn)化為短鏈糊精和低聚糖,它們可能通過美拉德反應(yīng)與蛋白質(zhì)的氨基相互作用。
如表2所示,隨著CS和ADSP添加量的增加,產(chǎn)品硬度、膠著性和咀嚼性降低,這與Phawinee等[9]研究結(jié)果一致。蛋白與淀粉混合物在加熱過程中表現(xiàn)出互相獨(dú)立的熱特性,淀粉的存在會(huì)與蛋白競爭水分,添加大量淀粉不利于形成蛋白質(zhì)多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),導(dǎo)致組織化蛋白產(chǎn)品質(zhì)地松軟。但CS添加后對(duì)產(chǎn)品內(nèi)聚性和彈性影響不顯著,ADSP可增加產(chǎn)品彈性。隨著HS添加量的增加,產(chǎn)品內(nèi)聚性升高,彈性和咀嚼性降低,HS的添加雖使產(chǎn)品硬度與膠著性降低,但在6%添加量時(shí),產(chǎn)品的硬度、咀嚼性和膠著性仍較大。表明添加6%HS可增強(qiáng)蛋白三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,有利于擠壓組織化蛋白產(chǎn)品高纖維狀結(jié)構(gòu)的形成。羥丙基淀粉因氫鍵作用較弱,二硫鍵作用加強(qiáng),蛋白三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)得到穩(wěn)定。
表1 淀粉對(duì)組織化花生蛋白產(chǎn)品色澤的影響
表2 淀粉對(duì)組織化花生蛋白產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)特性的影響
由圖3可知,添加ADSP和HS后組織化蛋白的WAC略有提高,這可能由于ADSP和HS與蛋白以及與水分子之間的相互作用,使組織化蛋白具有更高孔隙率。而CS在添加量為6%、9%的條件下WAC基本不變,3%和12%的條件下WAC略有提高,且與ADSP和HS相同添加量時(shí)的WAC相近。由于HS與蛋白的加熱變性同時(shí)發(fā)生,二硫鍵作用加強(qiáng),蛋白三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定,吸水能力比較強(qiáng),HS添加量為12%時(shí)組織化蛋白吸水能力最強(qiáng)。在相同條件下,添加CS的樣品吸水性低于添加ADSP和HS的樣品,這可能由于木薯淀粉糊化溫度較低,較早的吸水溶脹,不利于同蛋白質(zhì)共同形成多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。
由圖4可知,添加3種淀粉均可提高組織化蛋白的OAC,在添加量相同的條件下,HS對(duì)OAC的提高最大,ADSP次之,CS最小。CS在添加量為3%時(shí)吸油力最高,ADSP添加為12%時(shí)吸油力最高,HS在添加量為9%時(shí)吸油力最高。原因可能是淀粉的糊化加大了物料的膨化,使得蛋白質(zhì)凝聚度降低,結(jié)構(gòu)越來越疏松,氣腔增大,持水性、持油性變好,同時(shí)淀粉與油脂可以形成淀粉-脂肪復(fù)合物,使樣品吸油能力逐漸增加。楊勇等[20]采用高濕擠壓技術(shù)制備玉米淀粉-大豆分離蛋白基素肉,玉米淀粉添加量控制在 3%~4%范圍內(nèi),持水性和持油性相對(duì)較高。
圖3 淀粉對(duì)組織化花生蛋白吸水能力的影響
圖4 淀粉對(duì)組織化花生蛋白吸油能力的影響
圖5 添加不同淀粉的組織化蛋白紅外譜圖
圖6 不同淀粉對(duì)組織化蛋白樣品比率的影響
表3 淀粉對(duì)組織化花生蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響
酰胺Ⅰ帶(1 700~1 600 cm-1)是研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)最敏感的光譜區(qū),主要由肽鏈的C—O伸縮振動(dòng)引起[24]。如圖5所示,1 658 cm-1附近譜帶強(qiáng)度大,表明β-折疊及β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)為組織化花生蛋白酰胺Ⅰ帶中主要構(gòu)成。由表3可知,不同淀粉的加入對(duì)組織化蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋及β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)無顯著影響,隨著CS添加量的增加,β-折疊結(jié)構(gòu)比例先增加后減小,無規(guī)則卷曲比例不斷減小,說明部分無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu),在CS添加量為9%時(shí),β-折疊比例最高;隨著ADSP添加量增加,β-折疊含量先增加后減少,與之相應(yīng),無規(guī)則卷曲比例先減小后增加;隨著HS添加量的增加,無規(guī)則卷曲含量逐漸降低,β-折疊不斷增加。加入少量淀粉可提高組織化蛋白β-折疊結(jié)構(gòu)含量,但淀粉添加量過多會(huì)使β-折疊結(jié)構(gòu)含量降低,進(jìn)而影響組織化蛋白產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)、感官等特性。
組織化蛋白化學(xué)交聯(lián)鍵的變化可用蛋白在不同浸提溶液中的溶解度來表示,組織化蛋白樣品在浸提溶液中溶解度的不同表明組織化蛋白產(chǎn)品化學(xué)鍵結(jié)構(gòu)的多樣性。蛋白溶解度越高,表明組織化蛋白中化學(xué)鍵作用越強(qiáng)。如圖7所示,與原料相比,擠壓組織化蛋白氫鍵、二硫鍵和疏水相互作用逐漸減弱,化學(xué)鍵之間的交互作用逐漸增強(qiáng),可能是由于擠壓蛋白質(zhì)變性會(huì)導(dǎo)致氫鍵、二硫鍵和疏水相互作用向更為復(fù)雜的綜合作用力轉(zhuǎn)變,維持其構(gòu)象的作用力變得更為復(fù)雜[25]。隨著淀粉添加量的增加,蛋白質(zhì)分子間疏水相互作用顯著增強(qiáng),這可歸因于淀粉本身的吸水作用,由于淀粉競爭水分,蛋白質(zhì)中的疏水側(cè)鏈避開水而聚集到蛋白質(zhì)內(nèi)部,而不是被水溶劑化。由圖7可知,疏水相互作用和二硫鍵交互作用是維持組織化蛋白網(wǎng)絡(luò)狀纖維結(jié)構(gòu)的主要作用力,二硫鍵和疏水相互作用在蛋白擠壓聚集過程中起關(guān)鍵作用,與Li等[26]研究結(jié)論一致。淀粉添加量增加,蛋白質(zhì)分子間疏水相互作用逐漸增強(qiáng),疏水相互作用是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動(dòng)力,表明蛋白分子進(jìn)一步交聯(lián),使維持組織化花生蛋白構(gòu)象的作用力變得更為復(fù)雜,疏水作用增強(qiáng)也表明了蛋白質(zhì)折疊和螺旋的穩(wěn)定。需要說明的是計(jì)算氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵之間的相互作用時(shí),由于尿素溶液對(duì)氫鍵和疏水相互作用均有破壞作用,導(dǎo)致分析氫鍵和疏水相互作用時(shí)的重復(fù)計(jì)算,得出負(fù)值。
組織化蛋白沿縱向剪切,切面的掃描電鏡圖如圖8所示。無淀粉添加組織化蛋白結(jié)構(gòu)比較緊密,內(nèi)部存在纖維狀結(jié)構(gòu),但纖維呈無序狀排列,纖維間存在較大孔洞。添加一定量CS后,組織化蛋白的結(jié)構(gòu)有所改善,內(nèi)部纖維組織化結(jié)構(gòu)更明顯,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%時(shí)內(nèi)部結(jié)構(gòu)更為有序,但仍存在較大孔洞。添加ADSP和HS可明顯改善組織化蛋白的纖維結(jié)構(gòu),分別在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%和6%時(shí),表現(xiàn)出更細(xì)的纖維結(jié)構(gòu)和更有序的排列。添加9%淀粉使組織孔洞增大,組織纖維化程度降低,這與組織化度的結(jié)果一致。添加少量淀粉穩(wěn)定了水分,減少了網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中水分通道的出現(xiàn),從而促進(jìn)了致密完整蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的形成。但淀粉添加量過多會(huì)破壞蛋白質(zhì)形成的連續(xù)網(wǎng)絡(luò),兩個(gè)獨(dú)立網(wǎng)絡(luò)相互交織很難形成剛性結(jié)構(gòu)[27],所以組織化蛋白結(jié)構(gòu)變松散,纖維結(jié)構(gòu)比較粗,排列變混亂。
圖8 淀粉對(duì)組織化花生蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響(×500)
以花生蛋白粉為主要原料,研究CS、ADSP和HS對(duì)高水分組織化花生蛋白品質(zhì)改良和蛋白結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)果表明:添加少量ADSP和HS有助于產(chǎn)品組織化度的提高,3種淀粉都改善了組織化蛋白產(chǎn)品色澤,產(chǎn)品亮度值增加,降低了產(chǎn)品硬度和咀嚼性。添加ADSP和HS提高了組織化蛋白產(chǎn)品的吸水吸油能力,有利于產(chǎn)品在食品工業(yè)中的應(yīng)用。紅外光譜研究表明淀粉增強(qiáng)了美拉德反應(yīng),促進(jìn)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)由無規(guī)則卷曲向β-折疊轉(zhuǎn)變?;瘜W(xué)交聯(lián)鍵變化分析表明,淀粉促進(jìn)了蛋白質(zhì)之間疏水相互作用,疏水相互作用和二硫鍵交互作用是維持蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)狀纖維結(jié)構(gòu)的主要作用力。掃描電鏡結(jié)果表明,淀粉添加有助于蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成,添加3%ADSP組織化蛋白纖維結(jié)構(gòu)明顯,具有較高的組織化度。ADSP和HS對(duì)組織化蛋白品質(zhì)改良具有更好的效果。