王朋磊，剡轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，高莉娟，馬倩，宗西方，王升升，張吉宇

（蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020）

隨著人們對(duì)飲食水平的提高，畜牧業(yè)對(duì)牧草飼料的產(chǎn)量及品質(zhì)也要求更高［1］，但一些地區(qū)生境條件殘酷不適合抗逆性差的牧草生長，無法產(chǎn)出足夠的牧草，導(dǎo)致“人畜共糧”的現(xiàn)象嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的發(fā)展［1—2］。草木樨為一年生或兩年生豆科草本植物［1］，常見栽培種為白花草木樨（Melilotus albus）和黃花草木樨（Melilotus officinalis），白花草木樨的適應(yīng)性廣泛，在酸堿和貧瘠的土壤均能生長；含蛋白豐富可用于飼喂家畜［3—4］；固氮能力強(qiáng)，是良好的綠肥［5—6］，可與農(nóng)作物輪作以增加產(chǎn)量［7］；花期時(shí)間長，是良好的蜜源植物；其根系發(fā)達(dá)、植株高大，具有防風(fēng)固沙、保持水土的作用［4］。

目前我國對(duì)豆科牧草飼料的利用主要集中在紫花苜蓿（Medicago sativa）、紅豆草（Onobrychisviciaefolia）等植物，對(duì)草木樨利用較少，主要因?yàn)椴菽鹃睾休^高的香豆素。香豆素在霉菌的作用下轉(zhuǎn)化為雙香豆素，嚴(yán)重影響了草木樨的適口性而且家畜攝入過多后會(huì)出現(xiàn)敗血癥等癥狀［2，8—9］。而對(duì)于草木樨中香豆素的研究主要在分子方面，如分子標(biāo)記，基因功能驗(yàn)證等［10—12］；且國內(nèi)外對(duì)于草木樨的育種工作主要集中在產(chǎn)量、耐鹽性等方面［13］，所以對(duì)于草木樨香豆素含量的研究十分滯后，國內(nèi)尚無育成低香豆素的草木樨品種。為了提高草木樨的飼用價(jià)值，緩解當(dāng)前的飼草短缺問題，促進(jìn)草牧業(yè)的發(fā)展，培育出優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的草木樨新品種十分必要［2］。

自2011年以來，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院在甘肅省榆中縣和臨澤縣完成了從美國國家植物種質(zhì)資源庫（National Plant Germplasm System，NPGS）［14—15］引進(jìn)的50份白花草木樨種質(zhì)資源評(píng)價(jià)，并選擇出4份白花草木樨優(yōu)良種質(zhì)作為親本材料，通過自由雜交方式創(chuàng)制出25份半同胞家系。駱凱［14］及Luo等［16］于2014年開展了第一次輪回選擇，對(duì)半同胞家系進(jìn)行產(chǎn)量、香豆素含量等6個(gè)指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)。要想育成穩(wěn)定的新品種，有必要開展多次輪回選擇。因此，本研究將對(duì)白花草木樨開展第二次輪回選擇，對(duì)25份半同胞家系在榆中和臨澤兩個(gè)試驗(yàn)地點(diǎn)連續(xù)開展兩年的評(píng)價(jià)，測定指標(biāo)包括產(chǎn)量、品質(zhì)和香豆素含量等12個(gè)農(nóng)藝性狀，并分析農(nóng)藝性狀的遺傳變異，為進(jìn)一步選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)新品系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料為白花草木樨第二次輪回選擇的25份半同胞家系［16］。試驗(yàn)于2018、2019年在甘肅省臨澤縣蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站（100°02′E，39°15′N）和榆中縣試驗(yàn)田進(jìn)行（104°09′E，35°57′N）［14］。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，試驗(yàn)材料分別在兩個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)保苗25株。

1.2 測定性狀及方法

株高（plant height，PH）、莖粗（stem diameter，SD）、干重（dry weight，DW）、葉莖比（leaf：stem ratio，LSR）、分枝數(shù)（stem number，SN）、白粉病感病等級(jí)（powdery mildew rate，PM）、酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）、中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗滌木質(zhì)素（acid detergent lignin，ADL）、酸不溶性灰分（acid-insoluble ash，AIA）根據(jù)Luo等［16］的方法測定；采用凱氏定氮法測定粗蛋白（crude protein，CP）［17］含量；使用安捷倫1100型高效液相色譜儀（Agilent 1100，美國）測定香豆素（coumarin，Cou）［18］含量。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取3株進(jìn)行指標(biāo)測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016整理原始數(shù)據(jù)，使用專業(yè)育種軟件DeltaGen進(jìn)行遺傳方差分析、模式分析、表型相關(guān)性分析、狹義遺傳力、遺傳增益等分析，具體操作參見馬甜甜等［19］和Jahufer等［20］的方法。

使用DeltaGen［19—20］軟件中的Reml混合線性模型對(duì)半同胞家系進(jìn)行遺傳方差分析，模型表示為：

式中：Y ijk表示性狀的觀測值；M為平均值；gi為不同半同胞家系的基因型效應(yīng)；lj為不同試驗(yàn)地點(diǎn)的固定效應(yīng)；r jk為不同重復(fù)間的隨機(jī)效應(yīng)；（gl）ij為地點(diǎn)與基因型的互作效應(yīng)；εijk為總的殘差效應(yīng)［14］。

使用DeltaGen軟件進(jìn)行以兩試驗(yàn)點(diǎn)間25份半同胞家系各個(gè)性狀的BLUP值為基礎(chǔ)的主成分分析和聚類分析相結(jié)合的模式分析［21］，圖像化地表示各家系和性狀的關(guān)系［14］。親本將性狀傳遞給子代的能力及程度可用遺傳力和遺傳增益表示，其相關(guān)公式參考Luo等［16，22］的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 方差分析

25份F2代白花草木樨半同胞家系在榆中和臨澤兩地區(qū)各性狀平均值和變化范圍及狹義遺傳力如表1～2所示，結(jié)果表明試驗(yàn)材料有較大的表型差異。榆中地區(qū)白花草木樨的株高和干重的范圍分別為70～120 cm、34.3～145.0 g·plant—1，臨澤地區(qū)株高和干重分別為109～158 cm、44.1～224.7 g·plant—1。榆中地區(qū)的各性狀遺傳力范圍為0.34～0.81，干重、株高、莖粗的遺傳力分別為0.71、0.73、0.71；臨澤地區(qū)各性狀遺傳力范圍為0.43～0.86，干重、粗蛋白、香豆素含量的遺傳力分別為0.73、0.43、0.70.

表1 榆中地區(qū)白花草木樨半同胞家系各性狀基因型方差組分Table 1 The genotypic variance component of half-sib families traits of M.albus at Yuzhong

方差分析表明，榆中地區(qū)白花草木樨的株高、干重、莖粗、葉莖比表現(xiàn)出顯著的基因型變異（P＜0.05），白粉病感病等級(jí)和分枝數(shù)在各半同胞家系間沒有表現(xiàn)出顯著差異（表1）；臨澤地區(qū)所有產(chǎn)量性狀表現(xiàn)出顯著的基因型差異，品質(zhì)性狀中除酸不溶性灰分和粗蛋白，其余各性狀表現(xiàn)出顯著的基因型差異（P＜0.05）（表2）。從榆中—臨澤兩地區(qū)聯(lián)合分析（表3）可以看出，除分枝數(shù)以外，其他各產(chǎn)量性狀存在基因型×環(huán)境顯著互作（P＜0.05）。

表2 臨澤地區(qū)白花草木樨半同胞家系各性狀基因型方差組分Table 2 The genotypic variance component of half-sib families traits of M.albus at Linze

表3 基因型×環(huán)境互作下白花草木樨半同胞家系各性狀的遺傳方差組分Table 3 The genotypic var iance component of half-sib families traits of M.albus under genotype-by-location interaction

2.2 模式分析

根據(jù)榆中—臨澤兩地半同胞家系各性狀的BLUP值生成的主成分圖（圖1）表明干重與粗蛋白呈正相關(guān)關(guān)系，與香豆素呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；香豆素與葉莖比、粗蛋白呈正相關(guān)關(guān)系。干重與白粉病感病等級(jí)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。各性狀及家系的主成分分析結(jié)果表明第一主成分解釋了遺傳變異的26.1%，第二主成分解釋了遺傳變異的20.6%。聚類分析將這25份白花草木樨半同胞家系分為4個(gè)組（表4），其中第4組6個(gè)成員綜合表現(xiàn)最好，其香豆素平均含量最低為0.35%，平均干重最高為106.74 g·plant—1，白粉病感染程度最輕為1.27；第3組的兩個(gè)成員平均干重最低為59.11 g·plant—1，香豆素含量為0.47%，粗蛋白含量為12.12%，其表現(xiàn)較差。

表4 白花草木樨聚類分組信息和組內(nèi)性狀均值Table 4 The group information and the average of traits within group of M.albus

2.3 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果能準(zhǔn)確表示性狀間的相關(guān)性及顯著水平。相關(guān)系數(shù)如表5所示，可以看出莖粗與干重、株高之間存在極顯著（P＜0.01）的正相關(guān)關(guān)系；株高與葉莖比呈極顯著（P＜0.01）的負(fù)相關(guān)關(guān)系；酸性洗滌纖維分別與酸性洗滌木質(zhì)素、酸不溶性灰分呈極顯著（P＜0.01）和顯著（P＜0.05）的正相關(guān)關(guān)系；粗蛋白與酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維存在極顯著（P＜0.01）的負(fù)相關(guān)關(guān)系。干重、粗蛋白、香豆素含量三者之間的相關(guān)關(guān)系與圖1結(jié)果反映一致。

表5 兩地點(diǎn)的白花草木樨性狀間的表型相關(guān)系數(shù)Table 5 Phenotypic correlation coeff icients between M.albus traits across two locations

圖1 白花草木樨各性狀主成分分析Fig.1 Principal component analysis of traits of M.albus

2.4 遺傳增益預(yù)估

遺傳增益是根據(jù)半同胞家系間各性狀基因型與環(huán)境互作的遺傳方差而進(jìn)行預(yù)估的值。從表6可知，干重、粗蛋白、香豆素含量的遺傳增益增加百分比分別為4.3%、1.64%、—11.51%，產(chǎn)量性狀上遺傳增益增加百分比大小依次為干重、葉莖比、分枝數(shù)、莖粗、株高；干重遺傳增益增加百分比最多，而香豆素遺傳增益增加百分比為負(fù)值。

表6 基于兩地點(diǎn)評(píng)價(jià)半同胞家系的性狀經(jīng)過一個(gè)選擇周期獲得的預(yù)期遺傳增益Table 6 Predicted genetic gain（ΔG）of per selection cycle in response to direct single trait selection based on the half-sib families evaluated across two locations

3 討論

植物的性狀表現(xiàn)是由基因和環(huán)境相互作用形成的［23］。目前有充分的證據(jù)表明，只要種質(zhì)資源中存在遺傳變異，選擇適當(dāng)?shù)沫h(huán)境和性狀就可以通過植物育種成功地改良種群［24］。Caradus［25］在白三葉（Trifolium repens）育種中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量相關(guān)的性狀對(duì)環(huán)境與基因型的相互作用很敏感。Jahufer等［26］在新西蘭利用同樣的原理對(duì)26份白三葉草進(jìn)行遺傳改良。Luo等［16］在榆中和臨澤地區(qū)的白花草木樨半同胞家系進(jìn)行第一次選擇評(píng)價(jià)時(shí)，發(fā)現(xiàn)株高、莖粗等農(nóng)藝性狀有顯著的基因型差異和較大的重復(fù)力［10］。這充分表明試驗(yàn)材料具有培育出低香豆素新品種的潛質(zhì)，同時(shí)也為白花草木樨后續(xù)的評(píng)價(jià)工作奠定了基礎(chǔ)。

本研究在臨澤和榆中兩個(gè)不同氣候環(huán)境中對(duì)白花草木樨半同胞家系進(jìn)行第二次輪回選擇，進(jìn)一步挖掘育種材料的潛力，提升育種進(jìn)度。產(chǎn)量是植物育種工作的首要目標(biāo)，從表1～2可知臨澤地區(qū)干重與株高等產(chǎn)量及遺傳力大小表現(xiàn)優(yōu)于榆中地區(qū)，因此選擇臨澤地區(qū)的試驗(yàn)材料進(jìn)行了品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)和香豆素含量的測定。本研究表明第二次輪回選擇的25份白花草木樨半同胞家系在榆中和臨澤地區(qū)的干重、株高等產(chǎn)量性狀變化范圍較大，且具有顯著的遺傳變異和基因與環(huán)境互作，表明半同胞家系存在性狀分離，具有進(jìn)一步優(yōu)化選擇的潛力。

要在多個(gè)性狀中進(jìn)行優(yōu)化選擇，就必須了解各性狀間的關(guān)聯(lián)。本研究采用表型和基因型結(jié)合模式分析檢驗(yàn)了所測性狀之間的關(guān)聯(lián)。產(chǎn)量的高低跟多個(gè)因素有關(guān)，干重與莖粗、株高、分枝數(shù)、葉莖比相關(guān)性依次減弱，表明本研究所選指標(biāo)充分表征了材料產(chǎn)量高低。ADF、NDF等纖維指標(biāo)與分枝數(shù)有著密切的相關(guān)關(guān)系，說明纖維含量主要由分枝數(shù)決定；而產(chǎn)量指標(biāo)又分別與粗蛋白和纖維呈正相關(guān)，表明可以在追求產(chǎn)量的同時(shí)提高品質(zhì)。許瑾等［8］研究表明白花草木樨葉片中香豆素含量為1.75%～1.82%，莖中為0.61%～0.97%。香豆素作為草木樨中需要減少的次級(jí)代謝物質(zhì)，與葉莖比這個(gè)食物消化率和采食量的指標(biāo)存在正相關(guān)關(guān)系，這可能是因?yàn)榘谆ú菽鹃厝~片中香豆素含量高于莖中，同時(shí)表明葉莖比可以作為反映香豆素含量的一個(gè)指標(biāo)。香豆素與產(chǎn)量性狀存在著負(fù)相關(guān)關(guān)系；品質(zhì)與產(chǎn)量、香豆素含量有正相關(guān)關(guān)系，這種關(guān)系成為本研究選擇育種成功的關(guān)鍵，說明在白花草木樨中香豆素、產(chǎn)量、品質(zhì)三者間的關(guān)系可以進(jìn)一步的選擇優(yōu)化，使第二次輪回選擇白花草木樨半同胞家系的評(píng)價(jià)工作有效彌補(bǔ)品質(zhì)方面的不足。Jahufer等［27］研究柳枝稷（Panicum virgatum）產(chǎn)量、木質(zhì)素、乙醇時(shí)，使用類似的方法有效地提高了柳枝稷的利用價(jià)值。

主成分與聚類分析的結(jié)合模式分析已被應(yīng)用于概括復(fù)雜環(huán)境的基因型與性狀的關(guān)系。Davodi等［28］利用模式分析方法，從12個(gè)性狀出發(fā)，對(duì)200份紫花苜蓿種質(zhì)資源的表現(xiàn)進(jìn)行了綜合分析，以期對(duì)紫花苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)進(jìn)行改良。本研究模式分析結(jié)果（圖1，表4）表明第一、二主成分解釋了遺傳變異的46.7%，并將株高、干重等12個(gè)性狀的相關(guān)關(guān)系以及25份材料在各性狀上的表現(xiàn)進(jìn)行圖像化匯總。根據(jù)各性狀混合線性模型預(yù)測BLUP平均值，使用歐式距離方法將表現(xiàn)相似的半同胞家系聚為一類，從聚類的4組表現(xiàn)來看，第4組有6個(gè)成員可以作為后續(xù)的育種備選材料。駱凱［14］第一次輪回選擇后，測得香豆素含量最高為1.11%，最低為0.21%，平均值為0.50%，與第一次輪回選擇白花草木樨半同胞家系相比，第二次輪回選擇后香豆素含量平均值為0.44%，總體含量有所降低。為了進(jìn)一步驗(yàn)證對(duì)第二次輪回選擇半同胞家系的選擇評(píng)價(jià)效果，在20%的選擇壓力下估算了每個(gè)性狀的遺傳增益，這25份F2白花草木樨半同胞家系經(jīng)過一個(gè)周期的輪回選擇在產(chǎn)量上有所提高，說明經(jīng)過評(píng)價(jià)選擇后產(chǎn)量和品質(zhì)有所增加，香豆素含量有所降低。這為后續(xù)的育種工作奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

草木樨具有諸多優(yōu)良牧草特性，但其香豆素含量影響了飼用價(jià)值。在甘肅省榆中縣和臨澤縣對(duì)25份白花草木樨半同胞家系進(jìn)行第二次輪回選擇，使草木樨的產(chǎn)量、品質(zhì)提高的同時(shí)降低香豆素含量，說明白花草木樨具有很大的育種前景。