張永超，梁國玲，秦燕，劉文輝，賈志鋒，劉勇，馬祥

（青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海大學(xué)，青海 西寧 810000）

老芒麥（Elymus sibiricus）是禾本科（Gramineae）披堿草屬（Elymus）的模式植物，又名西伯利亞披堿草、垂穗大麥草等［1］。老芒麥在我國主要分布于西北、東北、華北等地區(qū)，是青藏高原等地區(qū)最重要的飼草之一，也是高寒草甸草原和草甸群落中的優(yōu)勢(shì)種和建群種［2］。

植物經(jīng)過多年的生長(zhǎng)，代謝和分子水平突變的積累，逐漸表現(xiàn)出退化癥狀。衰老是植物發(fā)育的重要階段，常常與退化，凋敝，發(fā)病和死亡相關(guān)。程序化的衰老是在時(shí)間序列上，受到自身發(fā)育和環(huán)境的影響，由遺傳物質(zhì)嚴(yán)格調(diào)控植物體內(nèi)的激素、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、激酶和轉(zhuǎn)錄因子的系列轉(zhuǎn)錄和表達(dá)完成［3］，是植物對(duì)環(huán)境養(yǎng)分波動(dòng)的快速響應(yīng)［4］。老齡化是一個(gè)與時(shí)間相關(guān)的變化過程，它與植物整個(gè)生活史中的生長(zhǎng)、分化、成熟、衰老和死亡各個(gè)階段相互融合和相互作用［5］。研究表明，植物衰老受到葉綠體的降解，氮含量降低，脂類代謝加快和激素等內(nèi)部因素［6］和高溫、低溫、干旱和疾病等外部因素影響［7］。

光合作用是植物積累有機(jī)物的重要途徑，而光合作用主要由葉綠素參與完成［8］。研究表明葉綠素含量和光合效率成正比［9］。小麥（Triticum aestivum）葉綠素含量隨著生育期的推進(jìn)呈先升后降趨勢(shì)，花期最大［9］。水稻（Oryza sativa）葉位從高到低，光合系統(tǒng)Ⅱ的最大光化學(xué)效率（maximal photochemistry efficiency of PSⅡin the light，F(xiàn)v/Fm）和實(shí)際光化學(xué)效率（actual photochemical efficiency of PSⅡin the light，ΦPSⅡ）顯著降低，隨著葉片的衰老，葉綠素含量下降［10］。在單一生長(zhǎng)季中植物葉片通常會(huì)隨著葉位上升，自下而上進(jìn)行衰老，但偶爾也會(huì)出現(xiàn)逆向衰老現(xiàn)象，旗葉早于倒二葉發(fā)生衰老［11］。葉綠素的動(dòng)態(tài)變化和植物葉片光合特征可以對(duì)牧草或作物生長(zhǎng)、高產(chǎn)管理提供一定的指導(dǎo)和指示作用，可以反映植物的生長(zhǎng)和衰老過程。

植物衰老研究往往關(guān)注于一個(gè)生長(zhǎng)季，某一器官（葉片）的衰老，以一年生植物為主［12—14］，多年生較少，且多年生植物研究也多集中于一個(gè)生長(zhǎng)季中［15—18］。多年生植物整個(gè)生活史過程，年際間葉綠素含量和葉片光合特征的變化是否和植物衰老相關(guān)，罕見報(bào)道。不同樹齡油茶（Camellia oleifera）的二年生葉片葉綠素含量要高于一年生［16］。紅三葉（Trifolium pratense）衰老葉片中葉綠素、類胡蘿卜素和可溶性蛋白含量顯著降低［19］。毛竹（Phyllostachys heterocycla）葉片光合效率和葉綠素含量在衰老過程中顯著下降［20］。多年生草本植物南荻（Triarrhena lutarioriparia）葉片的衰老等級(jí)與葉綠素含量顯著負(fù)相關(guān)［21］。3齡馬蘭（Kalimerisintegrifolia）凈光合速率顯著低于1、2齡［18］。

土壤養(yǎng)分匱缺是促進(jìn)植物衰老的重要影響因素。養(yǎng)分添加，尤其是氮素對(duì)延緩葉片衰老、提高葉片光合有效作用時(shí)間和效率有明顯效果。一年生作物燕麥（Avena sativa）施氮后，其葉面積、葉綠素含量均顯著提高，過氧化物酶（peroxidase，POD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性顯著增強(qiáng)，葉片衰老減緩［12］。隨施氮量的提高，羊草（Leymus chinensis）葉片從上到下葉綠素含量均呈先增加后減小的變化趨勢(shì)，低氮水平下，羊草上部葉片葉綠素含量顯著增加，施氮有效增強(qiáng)羊草葉片過氧化物酶和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，延緩了羊草衰老［22］。本研究選取青藏高原東北部青海湖湖東地區(qū)1～6齡的青牧1號(hào)老芒麥作為試驗(yàn)材料，擬揭示1～6齡過程中老芒麥的葉綠素和光合變化特征，同時(shí)探討?zhàn)B分添加對(duì)延緩老芒麥衰老的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于青海省海北州西海鎮(zhèn)青藏高原多年生牧草種質(zhì)資源圃，100°59′E、36°54′N，海拔3159 m，屬高原大陸性氣候，寒冷期長(zhǎng)，年平均氣溫0.9℃，最高氣溫30.5℃，最低氣溫—33.8℃，≥10℃年積溫634.5℃。光照充足，太陽輻射強(qiáng)。干濕季分明，雨熱同季，年平均降水量403.6 mm，無霜期30 d。土壤類型為黑鈣土，土壤養(yǎng)分含量為：有機(jī)質(zhì)38.35 g·kg—1、堿解氮2.58 mg·kg—1、速效磷1.36 mg·kg—1、速效鉀21.69 mg·kg—1，土壤pH為8.21［6］。

1.2 試驗(yàn)處理

本研究選用青藏高原高寒地區(qū)審定登記的青牧1號(hào)老芒麥為研究對(duì)象。從2015年開始，每年5月中旬進(jìn)行老芒麥田間種植，播量2.25 g·m—2，行距30 cm，小區(qū)面積15 m2（3 m×5 m），種植當(dāng)年施入底肥尿素10 g·m—2，過磷酸鈣50 g·m—2。處理1：2015—2020年青牧1號(hào)老芒麥田，種植后不做任何處理。處理2：對(duì)2020年6齡老芒麥田進(jìn)行施肥處理，設(shè)置氮肥3個(gè)處理（45，60和75 kg·hm—2，N的含量），和磷肥3個(gè)處理（60，75和90 kg·hm—2），以不施肥為對(duì)照。處理3：以2015年建植的老芒麥田，從2016年開始進(jìn)行每年連續(xù)施肥處理，設(shè)置施肥處理16個(gè)（表1）。

表1 青牧1號(hào)老芒麥田長(zhǎng)期施肥處理Table 1 The longer fertilizer treatments of E.sibiricus（kg·hm-2）

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

在老芒麥開花期（7月底—8月初），采用KONICA MINOLTA，INC公司的SPAD（soil and plant analyzer development）分析儀，從旗葉開始依次向下測(cè)定3片葉子的葉綠素相對(duì)含量，每個(gè)處理隨機(jī)選取10株健康植株測(cè)定。老芒麥葉片光合特性選取旗葉進(jìn)行測(cè)量，隨機(jī)選取5株健康植株測(cè)定，選擇天氣晴朗早上10：30—11：30進(jìn)行，采用LI-COR公司的LI-6400XT便攜式光合作用測(cè)量系統(tǒng)測(cè)量。青藏高原地區(qū)1齡老芒麥普遍不進(jìn)行生殖生長(zhǎng)，對(duì)1齡老芒麥不進(jìn)行光合測(cè)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Microsoft Office Excel 2016整理作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 老芒麥1～6齡不同部位葉片葉綠素相對(duì)含量變化情況及旗葉光合特征

隨著老芒麥種植年齡的增加，老芒麥葉片葉綠素相對(duì)含量呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，在1齡和2齡時(shí)葉片葉綠素相對(duì)含量較高，從3齡開始葉片葉綠素相對(duì)含量開始下降，從1齡到6齡，可以劃分為3個(gè)階段：1～2齡，3～4齡和5～6齡，這3個(gè)階段間葉綠素相對(duì)含量存在顯著差異。在6齡時(shí)老芒麥葉片出現(xiàn)了逆向衰老現(xiàn)象（圖1A）。

圖1 青牧1號(hào)老芒麥1～6齡田（A），6齡田（B）和連續(xù)施肥6齡田（C）的不同部位葉片葉綠素相對(duì)含量Fig.1 The leaf chlorophyll content in different part leaf of plant fr om one year s old to six field（A），six years old field（B）and six years old in continuous fertilizer field（C）of E.sibiricus

從2齡到6齡，隨著老芒麥年齡增加，旗葉凈光合速率持續(xù)降低（15.08～6.92μmol·m—2·s—1），4齡和5齡間差異不顯著，其他年齡之間存在顯著差異（圖2A）。老芒麥旗葉胞間二氧化碳濃度隨著年齡的增加呈增加趨勢(shì)，6齡顯著高于2，3齡（圖2B）。氣孔導(dǎo)度從3齡開始顯著降低，2齡老芒麥旗葉氣孔導(dǎo)度（0.1374μmol·m—2·s—1）顯著高于其他高齡老芒麥（圖2C）。2齡老芒麥葉片蒸騰速率（4.25 mmol·m—2·s—1）顯著高于其他高齡老芒麥，3～6齡之間旗葉蒸騰速率差異不顯著（2.54～2.75 mmol·m—2·s—1）（圖2D）。

圖2 老芒麥田2齡到6齡葉片凈光合速率，葉片胞間二氧化碳濃度，葉片氣孔導(dǎo)度和葉片蒸騰速率Fig.2 The leaf net photosynthesis rate，the leaf intercellular CO 2 concentration，the leaf stomatal conductance and the leaf transpiration rate from two to six years old of E.sibiricus

2.2 高齡老芒麥（6齡）不同部位葉片葉綠素相對(duì)含量對(duì)養(yǎng)分添加的響應(yīng)及旗葉光合特征

施肥普遍提高6齡田老芒麥葉片葉綠素相對(duì)含量，且不同部位葉片葉綠素相對(duì)含量（33.30%～48.23%）均顯著高于不施肥處理（27.05%～30.72%）。第1片（旗葉）葉片在N75處理下葉綠素相對(duì)含量與N60處理差異不顯著，但顯著高于其他施肥和對(duì)照處理；P90和P75處理下，旗葉葉綠素相對(duì)含量顯著高于P60和對(duì)照。第2葉片葉綠素相對(duì)含量在N75處理下與N60處理差異不顯著，但顯著高于其他處理，N60處理下顯著高于磷肥處理和對(duì)照。第3葉片葉綠素相對(duì)含量在氮肥處理下都顯著高于磷肥處理和對(duì)照。在P90和P75處理下，葉片葉綠素相對(duì)含量顯著高于P60和對(duì)照。葉片逆向衰老現(xiàn)象在高氮處理下得到緩解，對(duì)照和低磷P60，低氮N45處理下仍然存在葉片逆向衰老現(xiàn)象（圖1B）。

6齡老芒麥田氮肥和磷肥添加處理下，除了P60處理與對(duì)照差異不顯著，其他處理下青牧1號(hào)老芒麥葉片凈光合速率均顯著高于對(duì)照。N60處理下葉片凈光合速率最高（10.77μmol·m—2·s—1）；當(dāng)?shù)适┤胍恢聲r(shí)，隨著磷素施入量的增加，高磷P90施入處理下，老芒麥葉片凈光合速率顯著高于中度和低度磷肥處理。P90處理下老芒麥葉片凈光合速率除與N45和N75差異不顯著以外，氮肥處理均顯著高于P60和P75（圖3A）。氣孔導(dǎo)度在中高氮（N60，N75）（0.1581，0.1582μmol·m—2·s—1）和中高磷（P75，P90）（0.1117，0.1602μmol·m—2·s—1）處理下顯著高于對(duì)照（0.0573μmol·m—2·s—1）（圖3B）。胞間二氧化碳濃度在中高氮處理（N60，N75）和中高磷（P75，P90）處理下顯著高于對(duì)照（圖3C）。N45（3.45 mmol·m—2·s—1）和N60（3.21 mmol·m—2·s—1）處理下葉片蒸騰速率顯著高于對(duì)照（圖3D）。

圖3 青牧1號(hào)老芒麥6齡田施肥處理對(duì)葉片凈光合速率、葉片胞間二氧化碳濃度、葉片氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率的影響Fig.3 The leaf net photosynthesis r ate，the leaf stomatal conductance，the leaf inter cellular CO 2 concentration and the leaf transpiration rate of E.sibiricus cv.Qinghai No.1 in six years old under different fertilizer treatments

2.3 老芒麥長(zhǎng)期施肥不同部位葉片葉綠素相對(duì)含量對(duì)養(yǎng)分添加的響應(yīng)及旗葉光合特征

在連續(xù)施肥6年處理下，老芒麥旗葉葉片葉綠素相對(duì)含量在N0P60，N0P75處理下與對(duì)照差異不顯著，其他氮磷交互施肥處理下，旗葉葉綠素相對(duì)含量均顯著高于不施肥處理，氮肥的連續(xù)施入可有效提高老芒麥旗葉葉綠素相對(duì)含量；N75P0（47.94%），N60P60（47.61%）和N45P90（45.58%）處理下，旗葉葉綠素相對(duì)含量較高；在低氮N45處理下，旗葉葉綠素相對(duì)含量隨著磷肥量增加，呈逐漸增加的趨勢(shì)。在N60這一水平處理，N60P60顯著高于其他處理。N75處理水平下，N75P0處理葉綠素相對(duì)含量在N75處理下顯著高于其他磷肥處理（圖1C）。

連續(xù)施肥可有效提高6齡老芒麥凈光合速率（4.07～12.27μmol·m—2·s—1）。其中N60P0（12.27μmol·m—2·s—1）和N60P75（11.97μmol·m—2·s—1）施肥處理顯著提高老芒麥葉片凈光合速率。單獨(dú)磷素的添加可以提高老芒麥葉片凈光合速率，尤其是高濃度磷P90顯著高于其他單獨(dú)磷肥處理；單獨(dú)氮肥處理下，低度和中度氮肥處理（N45，N60）下葉片凈光合速率顯著高于不施氮肥和高濃度氮肥處理；氮磷配合施入處理下，總體表現(xiàn)出中度氮肥N60結(jié)合磷肥可較好地提高老芒麥葉片凈光合速率（圖4A）。

圖4 青牧1號(hào)老芒麥連續(xù)施肥6齡田中施肥處理對(duì)葉片凈光合速率，氣孔導(dǎo)度，胞間二氧化碳濃度和蒸騰速率的影響Fig.4 The leaf net photosynthesis rate，the leaf stomatal conductance，the leaf intercellular CO 2 concentration and the leaf transpiration r ate of E.sibiricus cv.Qinghai No.1 in six year s old in continuous fertilizer field

長(zhǎng)期施肥，6齡老芒麥旗葉氣孔導(dǎo)度為0.0447～0.1425μmol·m—2·s—1。N0P90，N45P0，N60P0，N60P60，N60P75施肥處理老芒麥葉片氣孔導(dǎo)度分別為0.1425，0.1217，0.1407，0.1335，0.1181μmol·m—2·s—1，普遍高于其他處理。氮磷配合施入總體表現(xiàn)出在低氮和中氮條件下，老芒麥葉片氣孔導(dǎo)度隨著磷濃度的增加而降低，N45P0處理顯著高于N45P60，N45P75和N45P90處理。在N60處理下，N60P0，N60P60和N60P75的氣孔導(dǎo)度之間差異不顯著，但均顯著高于N60P90處理。高氮施入處理下，老芒麥葉片氣孔導(dǎo)度隨著磷濃度增加，呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，N75P90處理下氣孔導(dǎo)度顯著高于N75P0處理（圖4B）。

6齡老芒麥旗葉葉片胞間二氧化碳濃度為190.57～282.60μmol·mol—1。N0P90，N45P0，N60P60施肥處理老芒麥葉片胞間二氧化碳濃度分別為277.35，258.28，282.60μmol·mol—1，普遍高于其他處理。中氮N60條件下，P75和P90施入下葉片胞間二氧化碳顯著低于N60P0和N60P60。中氮和低磷組合處理下植物葉片胞間二氧化碳濃度最高（圖4C）。

6齡老芒麥旗葉葉片蒸騰速率在長(zhǎng)期施肥N60P75，N60P0，N0P90，N75P90處理下分別為4.12，4.09，3.70和3.94 mmol·m—2·s—1，普遍高于其他處理，不施肥處理下（1.35 mmol·m—2·s—1）最低。N45施入時(shí)，施入磷肥后普遍降低了葉片蒸騰速率。N60和磷肥配合施用使葉片蒸騰速率普遍高于其他施肥處理。高氮處理?xiàng)l件下，老芒麥葉片蒸騰速率隨著磷肥濃度的增加而增加，N75P90和N75P75均顯著高于對(duì)照（圖4D）。

3 討論

植物葉片葉綠素的衰減和含量降低是植物衰老過程中最顯著的表型變化之一［23］。根據(jù)基因調(diào)控假說，植物葉片衰老是基因在特定環(huán)境條件下順序性表達(dá)所引起的一系列生理生化代謝的過程。營(yíng)養(yǎng)失調(diào)假說認(rèn)為葉片衰老是由于植物個(gè)體的生殖器官對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求量加大，主要的養(yǎng)分生產(chǎn)器官葉片供應(yīng)能力不足，代謝功能失調(diào)而導(dǎo)致衰老［15］。本研究中也發(fā)現(xiàn)青牧1號(hào)老芒麥在3齡后出現(xiàn)了明顯衰老的趨勢(shì)，主要表現(xiàn)在葉綠素含量的降低，光合效率的減弱，同化物的合成降低，老芒麥整體出現(xiàn)衰老變化。

3.1 葉綠素及光合特征

在多數(shù)作物研究中，植物葉片葉綠素含量隨著葉位自下而上順序性降低；光合速率自下而上逐漸增大，且光合速率下降開始的時(shí)間以旗葉最晚；蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度始終維持旗葉＞倒二葉的規(guī)律［11］。本研究中，青牧1號(hào)老芒麥在生長(zhǎng)早中期1～3齡葉綠素含量表現(xiàn)出同樣的規(guī)律，在后期6齡出現(xiàn)了逆向衰老現(xiàn)象。在小麥生長(zhǎng)后期，旗葉葉綠素首先降低，光合速率的衰減滯后于葉綠素的變化［11］，也出現(xiàn)逆向衰老現(xiàn)象。1～3齡的全葉馬蘭（Kalimeris integrifolia）研究中，到秋季3齡全葉馬蘭凈光合速率和蒸騰速率顯著低于1和2齡［18］。在一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)內(nèi)，多年生豆科紅三葉在衰老過程中，葉綠素明顯下降［19］，多年生植物南荻隨著葉片衰老程度加深，葉綠素含量顯著降低［21］。毛竹雖為多年生常綠植物，但其葉片有著明顯的老幼更替過程，其葉片的光合效率和葉綠素含量在衰老過程中均顯著降低［20］。本研究中老芒麥葉綠素相對(duì)含量降低和光合效率的衰減表明1～6齡的老芒麥葉片存在衰老漸進(jìn)特征。在跨年際的研究中，對(duì)6齡，30齡和＞100齡的油茶一年生葉片和二年生葉片進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，＞100齡的古樹二年生葉片葉綠素含量最高，古樹中超氧化物歧化酶，過氧化物酶和過氧化氫酶活性強(qiáng)于30齡和6齡［16］。本研究及多數(shù)研究中葉綠素含量在衰老過程中降低的結(jié)論與此不一致，這可能是木本植物和草本植物生活策略存在差異以及油茶較大的年齡跨度引起的。

3.2 土壤養(yǎng)分添加

氮素是植物生長(zhǎng)的必要元素，青藏高原地區(qū)老芒麥一年種植，多年利用，除了種植當(dāng)年養(yǎng)分添加外，以后幾乎沒有養(yǎng)分添加，多年生老芒麥種子田的退化和土壤養(yǎng)分密切相關(guān)。紅樹（Rhizophora apiculata）葉片在衰老中N，P含量降低［24］。植株缺氮時(shí)葉片中葉綠素的合成受阻，從而導(dǎo)致葉部分功能降低［22］。

在以往的研究中，適宜施氮量可提高小麥葉片葉綠素含量［25］，羊草葉片葉綠素含量在施氮后，從上到下呈先增加后減小的變化；低濃度施氮處理顯著提高2茬沙地羊草葉片葉綠素含量，同時(shí)提高葉片中POD活性和MDA含量顯著降低，推遲羊草衰老［22］。李京濤等［26］利用連續(xù)28年長(zhǎng)期定位施肥試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，有機(jī)肥和一定量的氮肥配合施用能顯著抑制小麥根系細(xì)胞膜脂過氧化過程，提高了小麥根系SOD活性、降低了MDA含量，從而延緩植株衰老進(jìn)程。本研究中養(yǎng)分添加老齡化施肥和連續(xù)的定點(diǎn)施肥結(jié)果與前期研究一致［22，25—26］，氮磷添加均有效提高6齡老芒麥葉綠素含量和光合速率，連續(xù)施肥處理下低氮即可持續(xù)保持老芒麥較高的葉綠素相對(duì)含量，本研究中磷素對(duì)保持老芒麥葉片葉綠素相對(duì)含量效果不顯著；中度氮肥長(zhǎng)期施入，同時(shí)配合磷肥添加，可有效維持高齡老芒麥葉片光合效率，可作為老芒麥?zhǔn)┓实膮⒖肌６嗄晟敛莘N植過程中土壤養(yǎng)分的逐漸流失，可能是導(dǎo)致其衰老的關(guān)鍵因素。

3.3 光合和氮素

葉片衰老在植物養(yǎng)分循環(huán)，尤其是氮素的循環(huán)中扮演重要的角色［18］，進(jìn)入衰老程序的葉片器官內(nèi)氮素調(diào)動(dòng)引起葉綠素含量降低，光合作用減弱。外源氮素的添加有利于維持衰老后期根系的活力，減少衰老葉片氮素輸出，可以緩解這一過程［27］。本研究中老芒麥在高齡階段出現(xiàn)的逆向衰老現(xiàn)象符合衰老過程中養(yǎng)分轉(zhuǎn)移這一規(guī)律，同時(shí)外援氮素的添加，可以明顯緩解逆向衰老。氮素是葉綠素的主要成分，它能促進(jìn)葉綠體基粒面積增大，葉綠素含量提高，提高Rubisco酶活性，增加胞間CO2濃度。同時(shí)氮素能減少細(xì)胞內(nèi)活性氧等物質(zhì)的產(chǎn)生，提高活性氧清除酶的活性［28］，緩解光合能力的下降，延長(zhǎng)和提高了植物葉片的光能功能期和光合效率，放緩了植物整體的衰老進(jìn)程［29］。

4 結(jié)論

隨著青牧1號(hào)老芒麥年齡的增加，葉片葉綠素相對(duì)含量顯著降低，可以作為老芒麥田衰老的一個(gè)表征指數(shù)。本研究初步按照老芒麥葉片葉綠素的相對(duì)含量，將老芒麥年際間的生長(zhǎng)分為3個(gè)階段，＞45%，35%～45%，＜35%，依次為生長(zhǎng)早期，中期平穩(wěn)期和后期衰老期。

高齡青牧1號(hào)老芒麥，在中、高氮磷添加下可有效提高葉片葉綠素相對(duì)含量和光合效率，有效緩解逆向衰老。在老芒麥連續(xù)生長(zhǎng)過程中，結(jié)合葉綠素相對(duì)含量，葉片葉綠素相對(duì)含量為35%～45%時(shí)，可以進(jìn)行外援養(yǎng)分尤其是氮素的添加。