李熙顏，李江飛，陳 詩，吳俊文，蔡年輝,，許玉蘭,*

(1.西南林業(yè)大學(xué) 云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué) 西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650224)

林木的表型性狀是遺傳改良與種苗繁育的重要指標，通過研究表型性狀可以提高良種選育及種質(zhì)復(fù)壯的效率，在林木種苗培育過程中，生長性狀、生物量等指標是直接影響苗木生長的關(guān)鍵因素[1]，能較好反映苗木質(zhì)量，其中，植物各器官生物量的高低反映了光合產(chǎn)物在各功能部分積累的多少[2]，表征著苗木對外界環(huán)境的適應(yīng)能力，其大小可反映苗木的光合面積、根系大小和莖的大小，綜合體現(xiàn)苗木的競爭能力，常被作為苗木評價的主要指標[3-4]。生物量分配的研究是分析植物結(jié)構(gòu)功能最有效的工具，是研究植物碳分配的基礎(chǔ)，各器官生物量會隨著物種、生境和個體大小等的變化而改變[5]。

一般而言，在數(shù)據(jù)的測定過程中，選取的樣本容量越大，樣本的代表性就越好，得出的結(jié)果也越能代表整體，但工作量會相應(yīng)增加。相反，樣本量過小，結(jié)果可能不能滿足要求，抽樣調(diào)查既可保證一定精度，又可減少工作量?，F(xiàn)今已有的研究表明樣本量會對數(shù)據(jù)的準確性產(chǎn)生影響，諸如樣本量會對濕地松(Pinuselliottii)的遺傳力估算值[6]、白樺(Betulaplatyphylla)的多態(tài)位點百分率產(chǎn)生影響[7]。云南松(P.yunnanensis)為松科松屬常綠喬木，分布范圍較廣，主要分布于我國西南地區(qū)，是西南地區(qū)的鄉(xiāng)土樹種及荒山綠化造林先鋒樹種，也是云南省主要森林植被樹種[8-10]。有大量研究表明，植物地上與地下部分生物量大小能反映植物對土壤養(yǎng)分或光照的需求和競爭能力[11]，地上、地下生物量比作為描述植物形態(tài)的指標之一，在探討苗木質(zhì)量、林木生長特點、碳循環(huán)分配等問題中十分重要。而不同器官間生物量分配比例的不同不僅會影響各器官生物量的累積，還會一定程度地影響苗木形態(tài)特征，最終影響苗木的生產(chǎn)力[12-14]。目前人們對云南松幼苗生物量的測定主要依靠整株收獲法，極其耗時、耗力且破壞性大。研究樣本量對云南松幼苗生物量特征的影響，在一定程度上能夠減小工作量并得到較為準確的數(shù)據(jù)。從已有的關(guān)于云南松苗木生物量的研究來看，研究多在異速生長[15]、苗木分級[16]、苗木生物量估測模型[17]等方面，在樣本量對云南松苗木生物量積累、分配的研究方面鮮有論及。鑒于此，本研究通過家系樣本量和單株樣本量2種不同的抽樣方式設(shè)計不同的樣本量梯度，探明樣本量對云南松苗木生物量積累、分配的影響，確定得到準確性較高的生物量所需的臨界樣本量，期望為云南松生物量的測定提供一定參考和策略，同時為林木相關(guān)研究提供案例。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗地設(shè)置在西南林業(yè)大學(xué)苗圃，位于25°04′00″N，102°45′41″E，海拔1 945 m，屬北亞熱帶半濕潤高原季風氣候，年平均氣溫14.5 ℃，年降水量700～1 100 mm。

1.2 材料

于2014年12月在云南省昆明市宜良縣進行種子采集，選取生長正常、無明顯病蟲害的成年云南松植株，采集發(fā)育正常且成熟的飽滿球果。將采摘的球果做好標記，分類帶回實驗室晾曬風干，取出球果中的種子。2015年3月將所采20個家系的云南松種子用0.5%高錳酸鉀溶液浸泡0.5 h，之后用清水洗凈，浸泡48 h，每隔12 h換1次水。在西南林業(yè)大學(xué)苗圃用點播的方式，以5 cm×10 cm的株行距進行播種，采用完全隨機設(shè)計，每個家系播種40株，重復(fù)3次。播種后蓋薄膜小拱棚，出苗整齊后，不定期對云南松進行澆水、施肥、噴藥等管理。于2016年12月底生長停止后，采用整株收獲法，將20個家系獲得的完整植株615株用于分析，稱量每株根、莖、葉各組分的鮮重，分別裝入紙袋，在105 ℃的烘箱中殺青30 min后，降至80 ℃烘干至恒重，稱量根、莖、葉各組分的干重，即為生物量，精確至0.001 g。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本量確定 利用編寫好的計算機完全隨機抽樣程序?qū)?0個云南松家系的數(shù)據(jù)進行抽取，設(shè)計2種抽取方式。

1.3.1.1 家系樣本量 采用不同樣本量對20個云南松家系進行抽樣，設(shè)置家系樣本量分別為2、4、6、8、10、12、14、16、18、20，共10個樣本量梯度(F1、F2、…、F10)，重復(fù)抽樣10次，F(xiàn)10代表全體20個云南松家系。

1.3.1.2 單株樣本量 采用不同樣本量對615株云南松進行抽樣，設(shè)置單株樣本量分別為60、120、180、240、300、360、420、480、540、600，共10個樣本量梯度(S1、S2、…、S10)，重復(fù)10次。

1.3.2 數(shù)據(jù)處理 利用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用SPSS 20.0對不同樣本量的各指標進行方差分析及Duncan多重比較，計算10次重復(fù)間變異系數(shù)。

1.3.3 臨界樣本量確定 以生物量計算值隨樣本量的增加不發(fā)生顯著變化時的樣本容量作為臨界樣本量，參考文獻[18]設(shè)計的方法，從不同角度計算后綜合分析得出臨界樣本量。

1.3.3.1 方法一 計算每個梯度與相鄰梯度指標差的絕對值，對所有結(jié)果取平均值，得到所有梯度指標估算值的平均絕對差值(MAD，公式中用MAD表示)：

(1)

正整數(shù)m的確定方法為：從最后2個梯度開始判斷，若這2個梯度不能滿足上述條件，則記m=n，即梯度n所含的家系樣本量為臨界樣本量；若滿足上述條件，則再往前推一個梯度，判斷n-2和n-1是否滿足該條件，不滿足記m=n-1，滿足則繼續(xù)依次進行判斷，直至不滿足為止。

1.3.3.2 方法二 計算所有梯度生物量值的標準差(SD)，再確定1個正整數(shù)m，使得相鄰梯度間遺傳力滿足條件mAV-k×SD≤Wi≤mAV+k×SD(其中，k為隨機比例因子，如0.1或0.2，mAV為最后n-m+1個梯度的生物量的平均值)。正整數(shù)m的確定方法同方法一。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣本量對云南松幼苗生物量的影響

2.1.1 不同家系樣本量對云南松幼苗生物量特征的影響 由不同家系樣本量下的各生物量均值(表1)可知，不同樣本量下的苗木各器官及單株生物量存在相同的變化規(guī)律由大到小為：葉生物量、莖生物量、根生物量。云南松苗木的葉鮮重、地上部分鮮重、單株鮮重及葉干重在家系樣本量間差異顯著(P<0.05)，其他指標在不同家系樣本量間無顯著差異。梯度1顯著大于其他梯度。比較性狀間的變異系數(shù)，能看出性狀間的變異系數(shù)較相近，根鮮重、莖鮮重、根干重、莖干重的變異系數(shù)要略高于其他性狀。家系樣本量小于6個時，各生物量指標有波動，當樣本量增加到6個家系后，根、莖、葉各指標的生物量值、變異系數(shù)都逐漸趨于平穩(wěn)。然而，家系樣本量小于8個時，各生物量指標的標準誤較高，隨家系量的增加標準誤降低，在家系數(shù)量增加到10個后趨于平穩(wěn)。家系量較少時，生物量值具有很大的偶然性，穩(wěn)定性不高，不能有效代表該群體生物量的準確值。

表1 不同家系樣本量云南松苗木生物量基本情況

2.1.2 不同單株樣本量對云南松幼苗生物量積累特征的影響 由不同單株樣本量下的各生物量均值(表2)可知，云南松苗木的莖鮮重、葉鮮重、地上部分鮮重、單株鮮重及莖干重、葉干重、地上部分干重、單株干重在樣本量間差異顯著(P<0.05)，根生物量在不同單株樣本量間無顯著差異。所有指標的最小值均出現(xiàn)在60株、最大值在180株時，大于240株后根、莖、葉生物量各梯度均值平穩(wěn)，說明當單株樣本量較少時，各器官的生物量積累穩(wěn)定性較差，有偶然性，不具代表性；比較性狀間的變異系數(shù)，能看出根鮮重、莖鮮重、根干重、莖干重的變異系數(shù)要略高于其他性狀，各性狀的標準誤和變異系數(shù)大小則隨樣本容量的增加逐漸降低，樣本量小于300株時，二者波動較大，當樣本容量增加到300以后，標準誤、變異系數(shù)逐漸減小并趨于平穩(wěn)狀。

表2 不同單株樣本量云南松苗木生物量基本情況

2.2 樣本量對云南松幼苗生物量分配的影響

2.2.1 不同家系樣本量對云南松幼苗生物量分配的影響 由表3可知，不同家系樣本量下云南松幼苗的鮮重和干重各器官生物量分配比例在不同家系樣本量間均無顯著性(P>0.05)。從不同家系樣本量云南松幼苗鮮重分配的分析結(jié)果來看，根、莖和葉鮮重分配間存在差異，最大葉鮮重達59.17%，最小為58.48%；最大莖鮮重達28.15%，最小為27.42%；最大根鮮重達13.63%，最小為13.31%；地上部分鮮重最大為86.69%，最小為86.37%。

表3 家系樣本量對云南松幼苗生物量分配的影響

而從不同家系樣本量云南松幼苗干重分配的分析結(jié)果來看，最大葉生物量達57.16%，最小為56.35%；最大莖生物量達28.65%，最小為27.68%；最大根生物量達15.27%，最小為14.82%。各器官生物量分配由大到小均表現(xiàn)為：葉生物量、莖生物量、根生物量，云南松幼苗將主要生物量分配給葉。隨參試家系樣本量越接近總樣本數(shù)量(F10=20)，其鮮重和干重分配比例的標準誤越穩(wěn)定。

對不同家系樣本量云南松幼苗各部分器官及單株鮮重、干重的變異系數(shù)進行分析(圖1、圖2)，鮮重和干重的變異系數(shù)隨家系量的增加而降低，都表現(xiàn)為家系數(shù)量小于10個時，變異系數(shù)呈快速下降趨勢，當家系數(shù)量大于12個時，變異系數(shù)雖有波動，但變化趨勢較為平穩(wěn)。最大家系樣本量(F10=20)時為總樣本量，苗木鮮重和干重分配比例的標準差為0，因此變異系數(shù)也為0。

2.2.2 不同單株樣本量對云南松幼苗生物量分配的影響 由表4表明，不同單株樣本量下云南松幼苗的莖鮮重分配比例在不同樣本容量梯度間存在顯著差異(P<0.05)，其他部位的生物量分配比例在不同單株樣本量間不存在顯著差異(P>0.05)。其中，從不同單株樣本量下云南松幼苗鮮重分配的分析結(jié)果來看，根和葉鮮重分配比例依次為13.42%～13.68%、58.66%～59.23%。樣本量為180株時，莖鮮重分配比最大，達到27.88%；在60個樣本容量時最小，為27.09%，且地上部分生物量占單株生物量的80%以上，莖、葉生物量雖然發(fā)生變化但并未改變地上生物量分配比。

表4 不同單株樣本量對云南松幼苗生物量分配比例的影響

而從不同單株樣本量云南松幼苗干重分配的分析結(jié)果來看，葉、莖和根干重分配比例依次為56.40%～56.95%、27.83%～28.52%、15.08%～15.25%，地上部分生物量占單株生物量的84%以上，各器官生物量分配由大到小均表現(xiàn)為：葉生物量、莖生物量、根生物量，云南松幼苗將主要生物量分配給葉。參與估算的樣本量越接近總樣本數(shù)量，其鮮重和干重分配比例的標準誤越小，說明重復(fù)間的數(shù)據(jù)變化越小，數(shù)據(jù)更加準確。

對不同單株樣本量云南松幼苗各部分器官及單株鮮重、干重的變異系數(shù)進行分析(圖3、圖4)，鮮重和干重都表現(xiàn)為樣本量小于360株時，變異系數(shù)有劇烈波動且無明顯規(guī)律，樣本量為240時，變異系數(shù)增加，說明數(shù)據(jù)較少時，變異系數(shù)不穩(wěn)定；當樣本量大于360時，變異系數(shù)雖有波動，但總體變化趨勢較為平穩(wěn)。

2.3 臨界樣本量的確定

通過確定臨界樣本量的2種方法進行分析判定計算云南松幼苗所需的臨界樣本量(表5)。

通過2種方法判定的計算生物量積累所用臨界樣本量結(jié)果顯示(表5)：方法一中鮮重分配比確定的臨界樣本量為14～20個家系，干重分配比確定為12～14個家系，此時各部位生物量分配比均值波動較小，標準差逐漸減??；方法二中，當k=0.2時各指標所要求的臨界樣本量為14～18，對于不同的家系樣本量，干重分配比例確定的臨界樣本量較鮮重確定的要更穩(wěn)定一些。結(jié)合前述生物量積累和分配在不同家系樣本量中的均值及標準誤，對于本測定群體而言，樣本量梯度為S6=12時，積累和分配均值已平穩(wěn)，標準誤快速降低。方法一認為每相鄰2個梯度沒有大的差異時即為穩(wěn)定的，對于本研究中家系樣本量而言，各生物量分配比在不同家系樣本量的波動都較小，臨界樣本量為14～20時，雖然得到的誤差與變異系數(shù)小，但確定的臨界樣本量接近全樣本量，對研究及生產(chǎn)意義不大。方法二中比例因子k值用于判定臨界樣本量要求的生物量分配值變化趨于平穩(wěn)的程度，其值越小，所要求的生物量分配比例值波動越小，其是將波動幅度與標準差相比較，而標準差在12個家系后已經(jīng)穩(wěn)定，綜上所述，在家系樣本量大于12個家系時，既能保證生物量測定值穩(wěn)定，標準差小，又能保證實際生產(chǎn)要求，本量大于此梯度后，標準誤下降緩慢，精度無明顯增加。

表5 2種方法計算各指標所需的臨界樣本量與生物量分配比趨于平穩(wěn)后的平均值

對于不同單株樣本容量而言，方法一確定的臨界樣本量為240～480株，此時各生物量分配比均值平穩(wěn)，標準誤逐漸降低。方法二當比例因子k=0.2時，所需的臨界樣本量為360～480株。2種方法確定的樣本量在360株以前標準誤及變異系數(shù)都有波動，在420株時已達到穩(wěn)定狀態(tài)，綜合前文各部分生物量積累與分配的計算結(jié)果，對于本研究的云南松群體而言，要獲得穩(wěn)定性較高的生物量積累與分配計算值，需要測定云南松家系應(yīng)該大于12個，測量的單株數(shù)大于360株。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

從家系樣本量和單株樣本量對615株20個云南松家系的幼苗生物量進行分析，結(jié)果表明，云南松苗木生物量的分配由大到小均表現(xiàn)為：葉生物量、莖生物量、根生物量，根生物量分配比差異不顯著，莖、葉分配比有變化但地上生物量變化不大；615株云南松幼苗的生物量積累和分配在不同樣本量中有差異；分析不同家系樣本量和單株樣本量的標準誤與變異系數(shù)隨樣本量的增加呈下降趨勢，并結(jié)合2種確定臨界樣本量的方法，得出測定的云南松家系樣本量應(yīng)大于12個，或者測量的單株數(shù)大于360株，此時得到的結(jié)果與總樣本量所得結(jié)果差異很小，具有代表性。

3.2 討論

植物各器官生物量的相對高低反映光合產(chǎn)物在各功能部分積累的多少[19]，生物量在各器官中的分配是植物對環(huán)境長期適應(yīng)的結(jié)果，其分配格局的差異是植物生理和形態(tài)因素共同作用的結(jié)果，會受到個體大小的影響，且不同時期具有不同的分配中心[5,20]。研究表明苗期云南松生物量的分配規(guī)律為地上部分生物量遠大于地下部分，呈異速生長趨勢[21]，本研究中設(shè)置不同的單株樣本量或不同家系量，云南松苗木生物量的分配由大到小均表現(xiàn)為：葉生物量、莖生物量、根生物量，楊志玲等[22]研究的厚樸(Magnoliaofficinalis)生物量分配格局中也有類似的研究結(jié)果。X.Wangetal[23]對東北地區(qū)針闊混交林的地上和地下生物量研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地上生物量和地下生物量分配比例分別為74.63%～86.21%和13.79%～25.37%，與本研究中莖、葉生物量雖然發(fā)生變化但并未改變地上生物量分配比，根生物量分配較其他部位相對穩(wěn)定的結(jié)果相似，不同樣本量中云南松根生物量分配比差異不顯著，不會隨著苗木樣本量的變化而產(chǎn)生較大的變化。

研究表明，抽樣方式不影響調(diào)查的準確性，抽樣的樣本數(shù)是影響調(diào)查準確性的主要因素[24]。樣本量影響著抽樣精度，如果抽取樣本量少，對生物量總體估計量的代表性就差，抽樣精度就低，反之樣本量較大時，估計的精度高[25]。在計算結(jié)果時，樣本量較小，計算結(jié)果標準誤較大，數(shù)據(jù)間差異較大，存在偶然性；樣本容量越大，樣本的代表性會越好，但生物量的測定十分復(fù)雜，耗費的人力、物力也會越多[26]，選擇合適的樣本量能夠減少測定的工作量，得到正確可靠的分析結(jié)果。因此，本研究從單株樣本量和家系樣本量2個方面來探究不同樣本量對云南松生物量積累和分配的影響，并增加重復(fù)試驗次數(shù)，克服試驗中隨機因素帶來的誤差，增加抽樣技術(shù)的穩(wěn)定性[27-28]。本研究中不同家系梯度抽取家系植株數(shù)大多大于30株，不同家系間植株數(shù)量雖有一定波動，但梯度間沒有顯著差異。因此當家系樣本量大小達到6個家系、單株樣本量在240個后，均值較穩(wěn)定，但標準誤、變異系數(shù)則在12個家系、360株之前出現(xiàn)明顯波動，在樣本多于此值后下降緩慢。同時也發(fā)現(xiàn)，當樣本容量增加到12個家系、360株，不同重復(fù)間的差異變小。

單株樣本量或家系樣本量較低時生物量分配值會有一定波動的差異，且其標準誤具有不穩(wěn)定性，隨樣本量的增加精度和準確度會增加，所以臨界樣本量的確定要參考結(jié)合生物量計算值與標準誤，在生物量值趨于平穩(wěn)，標準誤較小時確定臨界樣本量的大小。因此，在測量生物量時應(yīng)考慮采用一定數(shù)量的樣本測量，以確保精確度。這與張慶瀅等[29]研究發(fā)現(xiàn)野生大麻(Cannabissativa)的遺傳多樣性水平在小樣本量時隨樣本量的增加呈急速增加趨勢，當抽樣群體樣本量大于25個個體時，遺傳多樣性水平增加趨勢明顯變緩，且包含了野生大麻居群90%以上的遺傳變異；張帥楠等[6]通過對濕地松61個自由授粉家系測定林的研究表明，隨著測量樣本容量或家系數(shù)的增加，測量結(jié)果的精度與準確性均提高的結(jié)果相似。本研究中，第1種方法是每相鄰2個梯度之間生物量值之差與平均差值相比較，將值開始平緩變化時的樣本量定為臨界樣本量[18]，所以對于各梯度均值波動不大的指標中，所得的臨界樣本量會較小，不同指標得出的樣本量會有較大差異。第2種方法是將波動幅度與標準差相比較，因子k的取值取決于對穩(wěn)定性的嚴格程度，綜合2種方法與前文的結(jié)果，對于本研究的測定群體而言，第1種方法直觀明確，并且客觀，要得到較準確的生物量計算值，所需測定的云南松家系樣本量應(yīng)大于12個，或者測量的單株數(shù)大于360株，此時得到的結(jié)果與總樣本量所得結(jié)果差異很小，具有代表性。