陸秋琴 張琳琳 賈維

肺癌目前居全球范圍內(nèi)癌癥死因的首位，占總癌癥死亡的25%；其5年生存率相當(dāng)?shù)?，不?0%[1-2]。目前臨床中診斷肺癌的輔助檢查有多種方法：X線、低劑量螺旋CT、胸腔穿刺活檢、支氣管鏡檢查、痰脫落細(xì)胞學(xué)檢查及PET-CT等。盡管CT的敏感性高但其特異性仍比較低，會造成較高的假陽性[3]；而胸腔穿刺活檢并不是對每個(gè)患者都適用，其發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)15%[4]；由此可見，這些輔助檢查尚未能滿足臨床的需求。手術(shù)是目前治療肺癌預(yù)后最佳的手段，但大多數(shù)肺癌患者被確診時(shí)已是晚期，錯(cuò)過了手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)，可供選擇的治療方案相當(dāng)有限，導(dǎo)致了晚期肺癌患者的5年生存率只有4%[1]。因此，亟須找出一種具有特異性的標(biāo)志物來輔助肺癌的診斷。

外泌體是一種由腫瘤細(xì)胞(tumor cell, TC)、免疫細(xì)胞、干細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌的納米級的細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)。它可以通過在鄰近細(xì)胞間或遠(yuǎn)處受體細(xì)胞間傳遞蛋白分子、DNA、miRNAs這些物質(zhì)來轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，從而對細(xì)胞間的通訊起著重要的調(diào)控作用[2]。許多研究(見表1、2)證明了外泌體所含的蛋白及核酸有望成為診斷肺癌的可靠標(biāo)志物，它的穩(wěn)定性[5]和特異性[6]為其奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。因此，本文旨在對近年來外泌體在診斷肺癌方面的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

表1 外泌體蛋白作為肺癌標(biāo)志物

外泌體的概述

外泌體是1983年Johnstone 等在研究綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟和分化的過程中發(fā)現(xiàn)的一種微小囊泡，隨后將其命名“exosome”，它是一種直徑為30-150nm的“茶托狀”扁平球體[7-9]。腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、干細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞均能產(chǎn)生外泌體。它通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用和出芽形成[8]，存在于血液、尿液、胸腔積液以及唾液、腹水、腦脊液等各種體液中。目前提取外泌體的方法有：聚合物沉淀法、超速離心法、過濾離心法、尺寸排阻色譜法、免疫磁珠法等。外泌體由多種蛋白質(zhì)，核酸，脂質(zhì)等生物大分子構(gòu)成，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)。它作為細(xì)胞間的通訊工具，主要通過以下三種方式介導(dǎo)細(xì)胞間的交流[2,10-11](見圖1)：第一，外泌體通過特異性表面分子與靶細(xì)胞進(jìn)行識別并融合，即受體-配體的相互作用將其內(nèi)所含的物質(zhì)釋放至靶細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄；第二，外泌體與靶細(xì)胞的細(xì)胞膜融合使內(nèi)容物釋放到靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，從而實(shí)現(xiàn)分子之間的轉(zhuǎn)運(yùn)；第三，通過類似胞吞作用的機(jī)制傳遞信息到靶細(xì)胞。外泌體的特異性及靶細(xì)胞攝取外泌體的不同方式使其在細(xì)胞間通訊中的功能復(fù)雜化，目前尚不清楚不同的方式是否會造成外泌體的定位、降解或功能的差異[2]。

圖1 外泌體介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的三種方式

外泌體在腫瘤中的作用

目前研究表明了癌細(xì)胞分泌的外泌體遠(yuǎn)比正常細(xì)胞分泌的多，它能夠調(diào)制腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成、免疫逃逸等過程[12-13]；還可作為抗腫瘤藥物的有效載體，也可介導(dǎo)抗腫瘤藥物的耐受性[10](見圖2)。肺癌的發(fā)生與發(fā)展與腫瘤微環(huán)境之間復(fù)雜的相互作用息息相關(guān)。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞賴以生存的內(nèi)環(huán)境，由腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，干細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，免疫細(xì)胞等及細(xì)胞外基質(zhì)和物理因素如缺氧等組成。缺氧是TME的前提。Zhang等[14]的研究表明，缺氧的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體通過STAT3誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)極大地提高了腫瘤細(xì)胞的侵襲力，促進(jìn)了腫瘤的轉(zhuǎn)移。此外，肺癌細(xì)胞分泌的外泌體中的miRNAs可在腫瘤細(xì)胞間傳遞遺傳信息，且其內(nèi)含的蛋白質(zhì)可以直接激活宿主細(xì)胞中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的生長和增殖。研究[15]發(fā)現(xiàn)，外泌體 miR-1260b通過抑制分泌型卷曲相關(guān)蛋白(secreted frizzled related protein 1, sFRP1)和Smad4蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein)來調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549的侵襲轉(zhuǎn)移。外泌體還可以通過刺激腫瘤血管生成來促使腫瘤的發(fā)展。相關(guān)研究表明，肺癌來源的外泌體的miR-210，可以通過激活JAK2/STAT3信號通路上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)、FGF2和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等促血管生成因子的表達(dá)從而促進(jìn)肺癌血管的生成[16]。在肺部TME中，腫瘤來源的外泌體攜帶免疫抑制分子，并將這些分子轉(zhuǎn)移到免疫細(xì)胞使之受到抑制。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)可以捕獲這些外泌體分化為耐受DC，使原始的CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，從而抑制腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的功能，以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[12]。實(shí)驗(yàn)還證明了外泌體是一種理想的藥物載體，Akhil等[17]的研究表明由外泌體介導(dǎo)的阿霉素傳遞，對TC表現(xiàn)出優(yōu)先的細(xì)胞毒作用，減低了正常組織的毒性且療效更佳。腫瘤來源的外泌體可以介導(dǎo)抗腫瘤治療的抵抗，其機(jī)制尚未明了。EGFR突變的TC通過內(nèi)吞作用將外泌體內(nèi)化，進(jìn)而激活PI3K/AKT和MAPK信號通路下游的外泌體野生型EGFR蛋白，從而引起對奧希替尼的耐藥性[18]。Li等[19]的實(shí)驗(yàn)表明，exo-miR-613通過下調(diào)TC中的GJA1、TBP和eIF-4E的表達(dá)從而逆轉(zhuǎn)了NSCLC細(xì)胞對順鉑的耐藥性。外由此可見，外泌體的相關(guān)研究將為肺癌的診斷與治療帶來新希望。

表2 外泌體miRNA作為肺癌標(biāo)志物

圖2 外泌體在腫瘤中的作用.即能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲遷移、血管生成、免疫逃逸等；可作為抗腫瘤藥物的有效載體，也可介導(dǎo)抗腫瘤耐藥。

外泌體作為診斷肺癌的標(biāo)志物

一、外泌體中蛋白質(zhì)作為肺癌標(biāo)志物

近年來許多研究表明外泌體中含有大量蛋白質(zhì)，且外泌體蛋白參與肺癌的發(fā)生發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)，因此具有成為新的診斷肺癌工具的巨大潛力。Sandfeld-Paulsen等[3]采用細(xì)胞外囊泡陣列芯片對580例患者(431 例肺癌患者和150 例對照者)分離出的血漿外泌體蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)CD151、CD171 和 TSPAN8 這三種外泌體蛋白在肺癌中的高表達(dá)，區(qū)分了肺癌患者與非肺癌患者且能區(qū)分肺癌的各組織亞型；其中CD151對肺癌的診斷價(jià)值最大，受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve, ROC)下方的面積(Area Under Curve, AUC)為0.68；三者聯(lián)合檢測特異性更高，AUC值為0.938。Niu等[20]采用超速離心法將46例健康對照者和125例非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者的血清分離出外泌體，再用質(zhì)譜法對這兩組外泌體進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)NSCLC患者的外泌體中α-2-HS-糖蛋白(alpha2-HS-glycoprotein, AHSG)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1(extracellular matrix 1, ECM1)的表達(dá)水平明顯高于健康對照組。AHSG對NSCLC的診斷價(jià)值最大，AUC為0.736(P<0.0001)；AHSG、ECM1與癌胚抗原結(jié)合診斷NSCLC，AUC值為0.938，對診斷NSCLC具有巨大的潛力。Sun等[21]的研究表明了唾液EVs含有信息豐富的蛋白質(zhì)，利用質(zhì)譜法對正常人和肺癌患者唾液EVs蛋白圖譜進(jìn)行了系統(tǒng)比較。選其中6種相關(guān)外泌體蛋白徹底鑒定后，發(fā)現(xiàn)四種外泌體蛋白(BPIFA1、CRNN、MUC5B和IQGAP)具有腫瘤特異性，可用于檢測肺癌。探究體液中循環(huán)中外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)差異，將為癌癥診斷的特異性和敏感性方面開辟新的領(lǐng)域。

二、外泌體miRNAs作為肺癌標(biāo)志物

miRNA是一種短的單鏈非編碼RNA，通過促進(jìn)靶mRNA的切割或抑制其翻譯在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)[8]。相關(guān)研究已經(jīng)證明了外泌體miRNAs在介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。且外泌體的結(jié)構(gòu)是其成為標(biāo)志物的重要因素，它的雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，包裹著miRNAs使其不被酶解，穩(wěn)定攜帶細(xì)胞來源的各種生物活性物質(zhì)在體液中循環(huán)。因此，它們能夠成為腫瘤的診斷標(biāo)志物。Sun等[5]對72 例肺癌患者和72例健康者，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，來檢測血清中外泌體miR-106b在NSCLC細(xì)胞系SPC-A-1、H 358、A 549和H 1229以及正常肺上皮細(xì)胞系Beas-2B中的表達(dá)，結(jié)果顯示肺癌患者和癌細(xì)胞系中血清外泌體miR-106b顯著升高。Han等[22]通過從56例LLC和40例HC的血漿外泌體中的 14 個(gè)miRNAs 的表達(dá)進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，患者的循環(huán)外體miR-342-5p和miR-574-5p的表達(dá)顯著高于健康對照者，AUC值分別為0.733，0.780。因此循環(huán)外體miR-342-5p和miR-574-5p有可能作為早期肺腺癌的新的診斷生物標(biāo)志物。研究[23]發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血漿中分離的外泌體中，miR-619-5p的表達(dá)高于正常，血漿外泌體miR-619-5p的表達(dá)，抑制了靶點(diǎn)RCAN1.4從而了促進(jìn)NSCLC的生長和轉(zhuǎn)移。這些 miRNAs 具有診斷的肺癌的高敏感性及特異性，有望成為輔助診斷篩查肺癌的生物標(biāo)志物。

三、外泌體DNA作為肺癌的生物標(biāo)志物

目前從NSCLC細(xì)胞的外泌體雙鏈DNA(double-stranded DNA, dsDNA)中成功檢測EGFR突變，以及肺癌中的KRAS和p53突變，這使得外泌體中分離出的dsDNA作為診斷標(biāo)記物將為肺癌的診斷開辟新的可能性。然而目前還未研發(fā)出能從人體中分離外泌體dsDNA的技術(shù)[24]。雖然腫瘤外泌體DNA檢測在肺癌的診斷中起著至關(guān)重要的作用，但測序儀器的可及性、數(shù)據(jù)分析和高昂的成本都是目前無法解決的限制因素。

結(jié) 語

隨著當(dāng)代醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，液體活檢正在成為診斷肺癌的微創(chuàng)方法，外泌體的發(fā)現(xiàn)和研究為肺癌的早期診斷開辟了新的途徑。外泌體作為無創(chuàng)或微創(chuàng)的肺癌標(biāo)志物，可降低一些有創(chuàng)活檢引起的病情惡化風(fēng)險(xiǎn)，而且有望能有效延長患者生存期。然而要實(shí)現(xiàn)將外泌體領(lǐng)域的研究轉(zhuǎn)化為未來的臨床實(shí)踐，我們?nèi)悦媾R著一些問題：首先是對外泌體在肺癌中的作用的進(jìn)一步研究，以及靶細(xì)胞攝取外泌體的不同的方式，是否會導(dǎo)致外泌體不同的定位、降解或功能，以更好地闡明它們的作用及其作用機(jī)制；其次，解決外泌體的分離純化技術(shù)問題及尋找外泌體的靶基因；再次，目前外泌體作為標(biāo)志物的研究仍缺乏大量臨床樣本驗(yàn)證其有效性等問題。只有解決這些問題，外泌體才能夠廣泛應(yīng)用于臨床?？偠灾?，外泌體的研究有著廣闊的前景，基于外泌體與肺癌的研究，有望能研發(fā)出可應(yīng)用于臨床的肺癌診斷標(biāo)志物，以達(dá)到提高肺癌患者5年生存率，延長肺癌患者生存時(shí)間的目的，造福更多的患者。