張朝正，李 意，趙 華*

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

殼聚糖因其具有多種生物活性和用途而受到許多研究者的關(guān)注[1-3]，但殼聚糖在中性pH條件下的溶解性很差，這可能限制其應(yīng)用。殼寡糖是殼聚糖水解后的產(chǎn)物，平均分子質(zhì)量＜3 900 Da，聚合度＜20[4]。與殼聚糖不同，殼寡糖在水中具有很大的溶解度。此外，殼寡糖還具有抗糖尿病[5-6]、抗氧化[4，7-8]、抗炎[4，9]、抗癌[9]、抗腫瘤[10]、抗菌等生物活性[11-12]。殼聚糖是一種由β-1,4連接的D-氨基葡萄糖和不同數(shù)量（低于50%）的N-乙酰-D-氨基葡萄糖組成的聚合物[13]。在很多細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、真菌和植物中都可以觀察到殼聚糖酶的活性[14]，它們以胞外或者胞內(nèi)的形式存在。除了一類接合菌的真菌（例如犁頭霉菌（Absidia orchidis）[15]、魯氏毛霉（Mucor rouxii）[16]、卷枝毛霉（Mucor circinelloides））[17]外，大多數(shù)細(xì)菌和真菌所產(chǎn)殼聚糖酶屬于胞外殼聚糖酶。另外還有一些胞內(nèi)殼聚糖酶在植物中被發(fā)現(xiàn)。殼聚糖酶的特性取決于酶的來源。殼聚糖酶的分子質(zhì)量在10～75 kDa，但是，Aspergillus fumigatusKH-94的殼聚糖酶分子質(zhì)量可達(dá)到108 kDa[14]。殼聚糖酶的最適pH為4～8，溫度為30～60 ℃，且與產(chǎn)酶的菌株生長條件密切相關(guān)。已經(jīng)有一些研究報道了殼聚糖酶的熱穩(wěn)定性[18-20]。

由殼聚糖化學(xué)轉(zhuǎn)化得到的殼寡糖產(chǎn)率低、鏈短、分離成本高、環(huán)境污染嚴(yán)重。酶法轉(zhuǎn)化殼聚糖具有環(huán)境友好、成本低、重現(xiàn)性好、條件溫和、可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。殼聚糖酶生產(chǎn)的重要來源主要是細(xì)菌，例如芽孢桿菌（Bacillus）[21-25]和鏈霉菌（Streptomyces）[26]。殼聚糖降解酶在近年來備受關(guān)注，并且在醫(yī)學(xué)[27-29]、生物技術(shù)[30-31]、農(nóng)業(yè)[32]和食品領(lǐng)域[33-35]有多種應(yīng)用。然而，酶的生產(chǎn)成本高限制了它的大規(guī)模應(yīng)用。因此，需要一種廉價高效的生產(chǎn)殼聚糖酶和將殼聚糖轉(zhuǎn)化為生物活性殼寡糖的方法。

本研究以經(jīng)過常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變的蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）菌株作為研究對象，對其發(fā)酵培養(yǎng)基的組分進(jìn)行優(yōu)化。首先通過單因素試驗(yàn)確定酵母浸粉、葡萄糖、Tween-80、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4和NaCl的最佳添加量，然后通過Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)和Design-Expert 10.0.4軟件分析顯著性因素，然后再進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)、Box-Behnken（BB）試驗(yàn)分析顯著因素的最佳濃度，獲得發(fā)酵培養(yǎng)基成分的最佳配比，旨在提高聚糖酶酶活，為工業(yè)化生產(chǎn)殼聚糖酶奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

本研究所用的突變菌株為經(jīng)過ARTP誘變的蠟狀芽孢桿菌TCCC 150072R，該突變菌株保藏在天津科技大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑

酵母浸粉（生化試劑）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、NaCl、K2HPO4（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；KH2PO4、MgSO4（均為分析純）：天津市化學(xué)試劑一廠；Tween-80（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸粉16 g/L、葡萄糖11.5 g/L、NaCl 5 g/L、K2HPO41.4 g/L、KH2PO40.6 g/L、Tween-80 1.2 g/L和MgSO4·7H2O 1.2 g/L，pH為6.5，121 ℃滅菌20 min。

活化培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化鈉5 g/L，葡萄糖10 g/L，瓊脂20 g/L，pH 為6.5，121 ℃滅菌20 min。

種子液培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化鈉5 g/L，葡萄糖10 g/L，pH 為6.5，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；LRH-150-HS恒溫恒濕培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；ELX800酶標(biāo)儀：基因有限公司；ZWYR-D2401恒溫?fù)u床：上海智能分析儀器制造有限公司；TG16 臺式高速離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

將保藏的突變菌種先在活化培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，然后挑選生長茁壯的菌株接種到種子培養(yǎng)基中制成種子液。

1.3.2 殼聚糖酶發(fā)酵液的制備

在250 mL搖瓶中裝100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后按照2%（V/V）接種量接種種子液進(jìn)行殼聚糖酶的生產(chǎn)，發(fā)酵條件為30 ℃、160 r/min的旋轉(zhuǎn)搖床中培養(yǎng)30 h。發(fā)酵結(jié)束后，在10 000×g條件下離心20 min，將上清液作為粗制殼聚糖酶進(jìn)行酶活測定。

1.3.3 殼聚糖酶酶活的測定

根據(jù)殼聚糖酶酶活定義[36]來進(jìn)行殼聚糖酶活測定，其測定方法參考文獻(xiàn)[37]。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)

分別考察發(fā)酵培養(yǎng)基配方中的成分：酵母浸粉（4 g/L、8 g/L、12 g/L、16 g/L和20 g/L）、葡萄糖（7.0 g/L、11.5 g/L、16.0 g/L、20.5 g/L和25.0 g/L）、NaCl（2 g/L、5 g/L、8 g/L、11 g/L和14 g/L）、K2HPO4（0.2 g/L、0.8 g/L、1.4 g/L、2.0 g/L和2.6 g/L）、KH2PO4（0.2 g/L、0.6 g/L、1.0 g/L、1.4 g/L和1.8 g/L）、Tween-80（0.4 g/L、1.2 g/L、2.0 g/L、2.8 g/L和3.6 g/L）和MgSO4·7H2O（0.4 g/L、1.2 g/L、2.0 g/L、2.8 g/L和3.6 g/L）對蠟狀芽孢桿菌突變菌株產(chǎn)殼聚糖酶酶活的影響。

1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

（1）P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)

殼聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基的七個變量分別為：酵母浸粉（A）、葡萄糖（B）、NaCl（C）、K2HPO4（D）、KH2PO4（E）、Tween-80（F）和MgSO4·7H2O（G），使用Design-Expert 10.0.4軟件從這七個變量中篩選出對殼聚糖酶產(chǎn)量具有較大影響的因素，每個因素測試兩個水平，表示為1和-1，PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of PB experimental design

（2）最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)上述PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出對殼聚糖酶顯著影響的因素，然后使用最陡爬坡試驗(yàn)的上升試驗(yàn)，進(jìn)一步分析和優(yōu)化具有顯著影響的因素對殼聚糖酶酶活力的影響，通過此試驗(yàn)確定各顯著影響因素的合適范圍。

（3）響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)初步得到酵母浸粉（X1）、葡萄糖（X2）和MgSO4·7H2O（X3）合適濃度范圍，然后利用Box-Behnken進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基配方，BB試驗(yàn)因素與水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酵母浸粉添加量對誘變菌株產(chǎn)殼聚糖酶酶活的影響

不同酵母浸粉添加量對誘變菌株產(chǎn)殼聚糖酶酶活的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，誘變菌株殼聚糖酶酶活隨著酵母浸粉的添加量在4～16 g/L范圍內(nèi)的不斷增加逐漸上升；當(dāng)酵母浸粉添加量達(dá)到16 g/L，誘變菌株殼聚糖酶酶活最高，為9.455 4 U/mL；隨著酵母浸粉添加量在16～20 g/L范圍內(nèi)的繼續(xù)增加，殼聚糖酶酶活不升反降。推測可能是因?yàn)榻湍附厶砑恿窟^大，導(dǎo)致過度發(fā)酵，致使?jié)B透壓變得過大，影響菌株生長。因此，選擇酵母浸粉最適添加量為16 g/L。

圖1 酵母浸粉添加量對誘變菌株酶活的影響Fig.1 Effect of yeast extract powder addition on the enzyme activity of mutant strains

2.1.2 葡萄糖添加量對誘變菌株產(chǎn)殼聚糖酶酶活的影響

不同葡萄糖添加量對誘變菌株產(chǎn)殼聚糖酶酶活的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，誘變菌株殼聚糖酶酶活隨著葡萄糖添加量在7.0～11.5 g/L范圍內(nèi)的不斷增加逐漸上升；當(dāng)葡萄糖添加量達(dá)到11.5 g/L，菌株殼聚糖酶酶活最高，為9.374 6 U/mL；隨著葡萄糖添加量在11.5～25.0 g/L范圍的繼續(xù)增加，殼聚糖酶酶活不升反降，推測可能是因?yàn)槠咸烟翘砑恿窟^大，導(dǎo)致細(xì)胞失水發(fā)生質(zhì)壁分離，從而抑制了菌株的生長。因此，選擇葡萄糖最適添加量為11.5 g/L。

圖2 葡萄糖添加量對誘變菌株酶活的影響Fig.2 Effect of glucose addition on the enzyme activity of mutant strains

2.1.3 NaCl添加量對誘變菌株產(chǎn)殼聚糖酶酶活的影響

不同NaCl添加量對誘變菌株產(chǎn)殼聚糖酶酶活的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，誘變菌株殼聚糖酶酶活隨著NaCl添加量在2～5 g/L范圍內(nèi)的不斷增加逐漸上升；當(dāng)NaCl添加量達(dá)到5 g/L，菌株殼聚糖酶酶活最高，為9.459 3 U/mL；隨著NaCl添加量在5～14 g/L范圍內(nèi)的繼續(xù)增加，殼聚糖酶酶活不升反降，推測可能是因?yàn)镹aCl添加量過大，導(dǎo)致滲透壓過大，從而抑制了菌株生長。因此，選擇NaCl最適添加量為5 g/L。

圖3 NaCl添加量對誘變菌株酶活的影響Fig.3 Effect of NaCl addition on the enzyme activity of mutant strains

2.1.4 K2HPO4添加量對誘變菌株產(chǎn)殼聚糖酶酶活的影響

不同K2HPO4添加量對誘變菌株產(chǎn)殼聚糖酶酶活的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，誘變菌株殼聚糖酶酶活隨著K2HPO4添加量在0.2～1.4 g/L范圍內(nèi)不斷增加逐漸上升；當(dāng)K2HPO4添加量達(dá)到1.4 g/L，菌株殼聚糖酶酶活最高，為9.461 0 U/mL，隨著K2HPO4添加量在1.4～2.6 g/L范圍內(nèi)繼續(xù)增加，殼聚糖酶酶活不升反降，推測可能是因?yàn)镵2HPO4添加量過大，導(dǎo)致培養(yǎng)基pH過大，從而影響菌株生長。因此，選擇K2HPO4最適添加量為1.4 g/L。

圖4 K2HPO4添加量對誘變菌株酶活的影響Fig.4 Effect of K2HPO4 addition on the enzyme activity of mutant strains

2.1.5 KH2PO4添加量對誘變菌株產(chǎn)殼聚糖酶酶活的影響

不同KH2PO4添加量對誘變菌株產(chǎn)殼聚糖酶酶活的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，誘變菌株殼聚糖酶酶活隨著KH2PO4添加量在0.2～0.6 g/L范圍內(nèi)不斷增加逐漸上升；當(dāng)KH2PO4添加量達(dá)到0.6 g/L，菌株殼聚糖酶酶活最高，為9.459 8 U/mL；隨著KH2PO4添加量在0.6～1.8 g/L范圍內(nèi)繼續(xù)增加，殼聚糖酶酶活不升反降，推測可能是因?yàn)镵H2PO4添加量過大，導(dǎo)致培養(yǎng)基pH過低，影響菌株生長。因此，選擇KH2PO4最適添加量為0.6 g/L。

圖5 KH2PO4添加量對誘變菌株酶活的影響Fig.5 Effect of KH2PO4 addition on the enzyme activity of mutant strains

2.1.6 Tween-80添加量對誘變菌株產(chǎn)殼聚糖酶酶活的影響

不同Tween-80添加量對誘變菌株產(chǎn)殼聚糖酶酶活的影響結(jié)果見圖6。由圖6可知，誘變菌株殼聚糖酶酶活隨著Tween-80添加量在0.4～1.2 g/L范圍內(nèi)的不斷增加逐漸上升；當(dāng)Tween-80添加量達(dá)到1.2 g/L，菌株殼聚糖酶酶活達(dá)到最高9.462 1 U/mL；隨著Tween-80添加量在1.2～2.8 g/L范圍內(nèi)的繼續(xù)增加，殼聚糖酶酶活不升反降，少量Tween-80是刺激因子，含量過多會抑制菌株生長。因此，選擇Tween-80最適添加量為1.2 g/L。

圖6 Tween-80添加量對誘變菌株酶活的影響Fig.6 Effect of Tween-80 addition on enzyme activity of mutant strains

2.1.7 MgSO4·7H2O添加量對誘變菌株產(chǎn)殼聚糖酶酶活的影響

不同MgSO4·7H2O添加量對誘變菌株產(chǎn)殼聚糖酶酶活的影響結(jié)果見圖7。由圖7可知，誘變菌株殼聚糖酶酶活隨著MgSO4·7H2O添加量在0.4～1.2 g/L范圍內(nèi)的不斷增加逐漸上升；當(dāng)MgSO4·7H2O添加量達(dá)到1.2 g/L，菌株殼聚糖酶酶活達(dá)到最高9.460 7 U/mL；隨著MgSO4·7H2O添加量在1.2～3.6 g/L范圍內(nèi)的繼續(xù)增加，殼聚糖酶酶活不升反降，推測可能是因?yàn)镸gSO4·7H2O添加量過大，導(dǎo)致細(xì)胞滲透壓增大，可能導(dǎo)致部分菌株死亡。因此，選擇MgSO4·7H2O最適添加量為1.2 g/L。

圖7 MgSO4·7H2O添加量對誘變菌株酶活的影響Fig.7 Effect of MgSO4·7H2O addition on the enzyme activity of mutant strains

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 PB試驗(yàn)

使用Design-Expert10.0.4軟件列出了12組PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，每組試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行3個平行試驗(yàn)，將每組試驗(yàn)殼聚糖酶活力的平均值（R）作為響應(yīng)值，如表3所示，殼聚糖酶活力在6.236 7～10.131 3 U/mL。PB試驗(yàn)的回歸分析結(jié)果見表4。

表3 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of PB experiments

由表4可知，該模型的P值為0.016 7，模型顯著（P＜0.05），該模型擬合較好。在這七個變量中，對殼聚糖酶活力影響顯著性從大到小為：酵母浸粉（A）＞葡萄糖（B）＞MgSO4·7H2O（F）＞NaCl（C）＞KH2PO4（E）＞K2HPO4（D）＞吐溫-80（G）。其中，酵母浸粉（A）對殼聚糖酶的酶活力有極其顯著性影響（P＜0.01），葡萄糖（B）和MgSO4·7H2O（F）對殼聚糖酶酶活力有顯著性影響（P＜0.05），其他4個因素對殼聚糖酶酶活沒有顯著性影響（P＞0.05）。所以選擇這3個具有顯著性影響的因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。

表4 PB試驗(yàn)回歸分析結(jié)果Table 4 Regression analysis results of PB experiments

2.2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)上述回歸分析選擇的3個影響顯著的因素，通過梯度增加酵母浸粉、葡萄糖和MgSO4·7H2O的添加量，采用最陡爬坡試驗(yàn)的上升試驗(yàn)確定3個因素的最佳水平范圍，最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of the steepest climbing experiments

由表5可知，當(dāng)固定MgSO4·7H2O的添加量為1.2 g/L時，得出酵母浸粉的添加量為16～17 g/L以及葡萄糖的添加量為10～11 g/L。當(dāng)固定葡萄糖添加量為11.5 g/L時，得出酵母浸粉的添加量為16～17 g/L以及MgSO4·7H2O的添加量為1.2～1.6 g/L。當(dāng)固定酵母浸粉添加量為16 g/L時，得出葡萄糖的添加量為10～11 g/L以及MgSO4·7H2O的添加量為1.2～1.6 g/L。最終得出酵母浸粉的添加量為16～17 g/L、葡萄糖的添加量為10～11 g/L以及MgSO4·7H2O的添加量為1.2～1.6 g/L。

2.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基條件

在上述的最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 10.0.4軟件，酵母浸粉（X1）、葡萄糖（X2）和MgSO4·7H2O（X3）對殼聚糖酶活力（Y）的影響進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，并對結(jié)果進(jìn)行方差分析，BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表6，方差分析見表7。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

表7 回歸方程方差分析Table 7 Variance analysis of regression equation

通過Design Expert 10.0.4軟件對表6數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸分析，得到擬合試驗(yàn)因素的回歸方程：Y=-22.153 0+2.059 6X1+2.429 1X2+3.841 2X3-0.041 3X1X2+0.225 2X1X3-0.139 1X2X3-0.056 4X12-0.075 8X22-2.574 6X32

由表7可知，該模型的P值為0.002 5，模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)影響不顯著（P=0.414 8＞0.05），表明該模型擬合較好。模型的決定系數(shù)R2為0.932 2，校正決定系數(shù)R2為0.845 0，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為7.690%，表示該模型有7.690%的變異不能由該模型解釋，信噪比為9.66 2，說明試驗(yàn)操作和模型均可信。該模型顯著性由大到小為：X32＞X22＞X12＞X2＞X1X2＞X1X3＞X2X3＞X3＞X1。在該模型中，二次項(xiàng)X22和X32對殼聚糖酶活力影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)X2、交互項(xiàng)X1X2和二次項(xiàng)X12對殼聚糖酶活力影響顯著（P＜0.05），一次項(xiàng)X1、X3、交互項(xiàng)X1X3和X2X3對殼聚糖酶活力影響不顯著（P＞0.05）。

2.2.4 響應(yīng)面分析

根據(jù)上述的試驗(yàn)結(jié)果與分析表示，該模型可以用于解釋和預(yù)測試驗(yàn)的結(jié)果，根據(jù)回歸分析和回歸方程的擬合，利用Design-Expert10.0.4軟件得到各因素相互作用的響應(yīng)面見圖8。

圖8 各因素交互作用對殼聚糖酶活性影響的響應(yīng)面及等高線Fig.8 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on chitosanase activity

由圖8可知，各因素交互作用對殼聚糖酶活影響的響應(yīng)面曲線呈現(xiàn)拋物線狀，說明所擬合的回歸模型有極大值點(diǎn)。酵母浸粉添加量與葡萄糖添加量的交互作用對殼聚糖酶活影響顯著（P＜0.05），而其余兩兩因素間的交互作用較小，與方差分析結(jié)果一致。

通過Design-Expert10.0.4軟件所預(yù)測得最佳試驗(yàn)條件：酵母浸粉添加量為16.872 g/L，葡萄糖添加量為10.324 g/L和MgSO4·7H2O添加量為1.205 g/L時，在此條件下發(fā)酵液殼聚糖酶活性理論值為10.104 U/mL。

為了驗(yàn)證Design-Expert10.0.4軟件所預(yù)測的最佳試驗(yàn)條件，在所提供的最佳發(fā)酵條件下，并考慮到現(xiàn)實(shí)操作條件，調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為：酵母浸粉16.9 g/L、葡萄糖10.3 g/L、NaCl 5 g/L、K2HPO41.4 g/L、KH2PO40.6 g/L、MgSO4·7H2O 1.2 g/L和Tween-80 1.2 g/L。在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，殼聚糖酶活性實(shí)際值為10.574 U/mL，比未優(yōu)化酶活提高了11.769%。

3 結(jié)論

不同聚合度的殼寡糖具有不同的生物活性，利用殼聚糖酶水解殼聚糖是綠色、安全、高效生產(chǎn)殼寡糖的主要工藝。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以響應(yīng)面法優(yōu)化生產(chǎn)殼聚糖酶誘變菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基配方。在進(jìn)行單因素試驗(yàn)后，先用PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出了三個顯著因素。然后進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，得出顯著因素的合理濃度范圍。最后進(jìn)行響應(yīng)面法試驗(yàn)，得到最佳的培養(yǎng)基為：酵母浸粉16.9 g/L、葡萄糖10.3 g/L、NaCl 5 g/L、K2HPO41.4 g/L、KH2PO40.6 g/L、MgSO4·7H2O 1.2 g/L和Tween-80 1.2 g/L。在此最佳培養(yǎng)基下，殼聚糖酶活性為10.574 U/mL，比未優(yōu)化培養(yǎng)基酶活提高了11.769%。在食品和制藥等行業(yè)生產(chǎn)殼聚糖酶具有潛在的應(yīng)用價值。