仝宇晴，楊夢楠，霍美蓉，殷婷婕

(中國藥科大學藥學院藥劑系，江蘇 南京 211198)

胰腺癌極具侵襲力是最致命的惡性腫瘤之一，5年生存率至今不足10%[1]。胰腺癌腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)不但支持胰腺癌的發(fā)生、進展和轉移過程，也是導致胰腺癌耐藥的重要原因。胰腺癌纖維結締組織過度增生，基質成分占瘤體積的90%以上，是胰腺癌TME最顯著的特征[2]。胰腺癌相關成纖維細胞(pancreatic cancer-associated fibroblasts,PCAFs)是胰腺癌TME中最主要的細胞成分之一，能大量分泌膠原蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖和透明質酸等細胞外基質(extracellular matrix,ECM)成分，是胰腺癌纖維結締組織過度增生的主要貢獻者[3]。致密增生的腫瘤基質不僅限制藥物瘤內的遞送和滲透，亦具有生物活性，可直接支持腫瘤細胞的存活、增殖和轉移[3-4]。此外，PCAFs也能通過旁分泌多種可溶性細胞因子和趨化因子增強腫瘤細胞活性和治療抗性，并調節(jié)多種免疫細胞的功能和瘤內浸潤，促進免疫抑制性TME的形成和維持[5]。鑒于PCAFs的多功能性，針對PCAFs進行靶向調控有望介導TME的整體重塑，并提升現(xiàn)有療法對胰腺癌的治療效果。

1 PCAFs概述

由于特異性生物標志物的缺乏，PCAFs尚無明確定義。PCAFs通常指存在于胰腺腫瘤組織中的，具有細長形態(tài)，不表達上皮細胞、內皮細胞和白細胞的標志物，也沒有胰腺癌細胞所具有的基因突變的一類細胞[6]。

1.1 PCAFs的特點 PCAFs具有多種來源，胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cells,PSCs)、間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)和胰腺組織中的正常成纖維細胞均能在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中活化或分化為PCAFs[5]。其中，PSCs是胰腺癌TME中含量最豐富的細胞，約占細胞總數的50%，能在胰腺癌TME刺激下激活呈PCAFs表型，是PCAFs的主要來源[7]。PCAFs也是一個具有高度異質性的細胞群體，主要包括肌成纖維性PCAFs(myofibroblastic PCAFs,myPCAFs)、炎性PCAFs (inflammatory PCAFs,iPCAFs)、抗原呈遞性PCAFs(antigen-presenting PCAFs,apPCAFs)和高代謝性PCAFs(highly activated metabolic state PCAFs,mePCAFs)[5,8]。不同表型的PCAFs在胰腺癌TME中空間分布不同，且具有不同的生理特性：myPCAFs緊鄰腫瘤細胞，表達高水平α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)；iPCAFs遠離腫瘤細胞，α-SMA表達水平低，但大量分泌IL-6等炎性細胞因子；apPCAFs表達MHC II和CD74，具有抗原呈遞作用；mePCAFs具有高度活躍的糖酵解作用，其代謝中間體能為瘤內腫瘤細胞和免疫細胞的氧化磷酸化提供碳源。此外，PCAFs還具有可塑性，能受其在胰腺癌TME中的空間分布和環(huán)境刺激發(fā)生不同表型之間的轉化[6]。

1.2 PCAFs在胰腺癌中的多重作用 胰腺癌細胞分泌的以轉化生長因子-β(TGF-β)為代表的多種細胞因子，以及TME缺氧、酸性及氧化應激條件均能促進靜息態(tài)PSCs、MSCs和正常成纖維細胞激活為PCAFs[7]。PCAFs激活后，又能通過分泌細胞因子(胰島素樣生長因子、表皮生長因子和白血病抑制因子等)、趨化因子(CXCL12等)、丙氨酸和外泌體等來增強胰腺癌細胞的增殖、侵襲能力，并促進癌細胞干性的產生[5]。PCAFs也與胰腺癌對化療和放療的抗性相關：PCAFs通過表達富含半胱氨酸的血管生成誘導劑 61(CYR 61)上調核苷轉運蛋白hENT1和hCNT3，增加自身對胰腺癌一線化療藥物吉西他濱的攝取，減少胰腺癌細胞攝取吉西他濱；PCAFs高表達骨膜蛋白，骨膜蛋白能通過調控蛋白激酶B(Akt)和細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)信號通路降低胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性；PCAFs通過產生ECM激活胰腺癌細胞的整合素β1-黏著斑激酶信號通路，保護癌細胞免受放療傷害[7,9]。

除了與胰腺癌細胞發(fā)生雙向串擾外，PCAFs還能與多種免疫細胞發(fā)生串擾，促進免疫抑制型TME的形成和維持：通過分泌CXCL12促進調節(jié)性T細胞向瘤內募集；通過分泌M-CSF、IL-4和IL-13促進巨噬細胞向具有免疫抑制作用的M2型極化；分泌IL-6、M-CSF等細胞因子促進髓源性抑制細胞的產生；分泌TGF-β等細胞因子抑制樹突狀細胞的激活[5,7]。

2 可抑制PCAFs活性的藥物

PCAFs調控策略主要可分為：PCAFs耗竭；抑制PCAFs活性；抑制PCAFs的某些特定功能。PCAFs耗竭策略已在臨床實驗中被證實會加速腫瘤生長和進展[10]；抑制PCAFs的某些特定功能(如沉默PCAFs的膠原分泌相關基因等)則效果有限[11]；相較而言，通過阻斷促PCAFs活化信號、阻斷PCAFs胞內信號傳導等方式抑制PCAFs活性，最有望用于增效胰腺癌治療。因此，本節(jié)僅對PCAFs可抑制PCAFs活性的藥物進行整理。

靶向調控TGF-β相關信號通路是應用最廣的PCAFs活性抑制策略。雷公藤內酯的水溶性前藥Minnelide[12]、吡非尼酮[13]、α-倒捻子素[14]、梣酮[15]、松弛素[16]、一氧化氮[17]和miRNA-29[18]等能抑制PCAFs中的TGF-β/Smads信號通路的轉導；LY2109761[19]、galunisertib[20]和vactosertib[21]等能抑制PSCs上的TGF-β受體表達；二甲雙胍則能通過下調胰腺癌細胞中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路來抑制TGF-β的表達[22]。以上藥物均可有效抑制PCAFs活化或誘導PCAFs失活。

除TGF-β信號通路外，TNF-α、IL-6、IL-1、CTGF和Hedgehog等細胞因子相關信號通路的激活也是誘導PCAFs活化的重要因素[5]。腫瘤疫苗GV1001能通過減少TNF-α、IL-6和IL-1β的產生來抑制PSCs活化[23]。靶向CTGF的單克隆抗體FG-3019及IL-1受體拮抗劑Anakinra也均具有抑制PSCs活化的能力[24,25]。

胰腺癌瘤內有氧含量匱乏亦是導致PSCs活化的重要刺激因素之一[7]。缺氧刺激下，細胞內miR-210表達上升，miR-210能通過調節(jié)多條信號通路促進細胞適應缺氧微環(huán)境，利用miRNA抑制劑(anti-miR-210)沉默PSCs中的miR-210可以成功誘導PSCs的失活[26]。

靜息態(tài)的PSCs富含維生素A，同時也是人類、大鼠和小鼠胰腺組織中唯一富含維生素A的細胞，但在活化過程中會發(fā)生維生素A丟失[27]。全反式維A酸(ATRA)是一種維生素A的衍生物，能通過抑制視黃酸受體-β/肌動球蛋白-2、Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路以及引起G1期細胞周期阻滯等多種機制靜息PSCs，恢復PSCs的維生素A貯存能力并減少結締組織的分泌[28-29]。

維生素D受體(VDR)表達水平低或體循環(huán)維生素D水平低(<20 ng·mL-1)均與胰腺癌的不良預后相關[30]。VDR是介導PSCs靜息的主要轉錄調節(jié)因子，帕立骨化醇、骨化三醇和卡泊三醇等維生素D類似物能通過持續(xù)激活維生素D受體來誘導PSCs靜息，減輕瘤內纖維化并抑制PSCs與腫瘤干細胞之間的串擾，增效胰腺癌化療效果[30-32]。

血管緊張素Ⅱ(ATⅡ)具有促進PSCs增殖、遷移及誘導ECM產生的能力，奧美沙坦和氯沙坦等ATⅡ抑制劑能通過阻斷ATⅡ的Ⅰ型受體所介導的促纖維信號(如TGF-β1、CTGF和內皮素等)來抑制PSCs的活性，并減少ECM的產生[33-34]。

血小板源性生長因子-BB(PDGF-BB)在與其受體結合后，能通過激活內源性酪氨酸磷酸化，進而上調ERK和Akt信號通路來促進PSCs增殖和遷移[35]。PSCs所分泌的單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)具有促進巨噬細胞向腫瘤組織募集的作用，在免疫抑制性TME的形成中扮演著重要角色，也能誘導成纖維細胞分泌ECM[36-37]。天然多酚化合物鞣花酸通過多種機制抑制PSCs的功能：不但能抑制PDGF-BB誘導的PSCs增殖和遷移，還能抑制IL-1β和TNF-α誘導的MCP-1的產生，以及下調α-SMA和膠原編碼基因的表達[38]。

PSCs與單核-巨噬細胞譜系(MML)的細胞有許多共同特征，如都具有吞噬活性，并表達多種Toll 樣受體，還具備MML細胞特異性標志物α-萘基丁酸酯酶(ANBE)活性[39-40]。Gonzalez-Villasana等[40]發(fā)現(xiàn)MML抑制劑雙膦酸鹽(帕米膦酸鹽或唑來膦酸)可以抑制 PSCs的增殖、活化、MCP-1的釋放、Ⅰ型膠原蛋白的表達，以及促進PSCs凋亡并誘導PSCs的細胞周期停滯于G1期。

3 可提高PCAFs藥物靶向遞送效率的策略

基于納米技術的藥物遞送系統(tǒng)(drug delivery systems,DDS)在臨床及臨床前研究中已被廣泛用于改善藥物的溶解度、生物利用度、靶向效率和毒副作用等。用于遞送PCAFs調控藥物的DDS需要充分結合胰腺癌的生理病理特征合理設計，才能實現(xiàn)針對PCAFs的高效靶向調控，進而增效抗胰腺癌療法。

3.1 促進藥物靶向蓄積于PCAFs周圍 PCAFs靶向調控劑首先可被遞送至PCAFs周圍以利于藥物接觸靶細胞。具有腫瘤基質主動靶向能力、主動跨血管能力和腫瘤深層滲透能力的DDS，以及消融過度增生的ECM均能有望通過提升瘤內局部藥物濃度，增加PCAFs對藥物的可及性來提升其調控作用。

靶向腫瘤基質中高表達的特異性生物分子(如蛋白聚糖、纖連蛋白等)能促進藥物蓄積在PCAFs周圍，增加PCAFs的藥物攝取概率。KRAS是一種參與細胞增殖和存活的重要原癌基因，KRAS突變會引起細胞失去生長增殖限制，導致腫瘤發(fā)生。超過90%的胰腺癌病例攜帶KRAS突變，靶向KRAS已成為胰腺癌治療的研究熱點。Pei等[15]通過CGKRK修飾型聚乙二醇-聚乳酸共聚物負載抗纖維化藥物梣酮(Frax)，制備了納米藥物Frax-NP-CGKRK，還通過以載脂蛋白E3(ApoE3)作為靶頭的脂質磷酸鈣納米粒荷載siKRAS，制備了仿生納米粒siKras-LCP-ApoE3。CGKRK賦予Frax-NP-CGKRK主動靶向胰腺癌內過表達的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的能力，高效抑制TGF-β信號通路，抑制PCAFs活性。ApoE3能與胰腺癌細胞中過表達的低密度脂蛋白受體和低密度脂蛋白受體相關蛋白1特異性結合，促進胰腺癌細胞攝取siKras-LCP-ApoE3，進而高效沉默胰腺癌細胞中的KRAS表達。體內藥效學研究顯示，F(xiàn)rax-NP-CGKRK具有削弱致密基質屏障及增強腫瘤血液灌注的效果，與具有KRAS沉默作用的仿生納米粒siKras-LCP-ApoE3序貫給藥，可使得荷瘤小鼠中位生存期較單用吉西他濱延長77.5%。

僅依賴實體瘤組織增強的滲透性和滯留(EPR)效應所實現(xiàn)的納米藥物腫瘤蓄積效果有限，設計具有主動跨腫瘤血管作用的DDS對于提升瘤內局部藥物濃度具有重要意義。白蛋白能通過腫瘤血管內皮細胞表面高表達的gp60受體所介導的轉胞吞作用進入腫瘤，并與瘤內高表達的富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARC)相結合而蓄積在腫瘤基質中[41]。Desai等[42]發(fā)現(xiàn)Abraxane?介導的紫杉醇瘤內蓄積量較Taxol?高33%。臨床實驗證實Abraxane?與吉西他濱聯(lián)合給藥方案相比于吉西他濱單藥療法能顯著延長晚期胰腺癌患者的中位生存期(8.5個月vs 6.7個月)，此聯(lián)用方案已成為晚期胰腺癌的一線療法[43]。腫瘤穿透肽也具有主動跨血管作用，Liu等[44]設計了一種iRGD修飾的介孔硅納米粒負載伊立替康用于治療胰腺癌，此DDS較非iRGD修飾的介孔硅納米粒瘤內蓄積量提升50%以上，且蓄積量與腫瘤血管表面的神經纖毛蛋白(NRP-1)的豐度呈正相關。

直徑100 nm左右的納米粒具有較好的長循環(huán)能力，卻不能在基質致密增生型腫瘤中實現(xiàn)有效內滲[45]。Zhao等[21]構建了一種尺寸可變的APTEDB-NS-TAX@Lipo-VAC納米粒，由PEG-PLGA納米球封裝于靶向纖連蛋白的脂質體中構建而成，用于共遞TGF-β受體抑制劑vactosertib(VAC)和化療藥物紫杉醇(TAX)治療胰腺癌。VAC和TAX分別被封裝于脂質體的疏水層及PEG-PLGA納米球中。APTEDB-NS-TAX@Lipo-VAC能與纖連蛋白剪接的胞外域B結合并蓄積在腫瘤基質中，逐漸釋放VAC，進而抑制PSCs產生ECM，減小基質密度。在脂質體塌陷后，負載TAX的40 nm PEG-LPGA納米球能滲透入腫瘤深處，有利于TAX殺傷深處腫瘤細胞。體內藥效學研究表明APTEDB-NS-TAX@Lipo-VAC高效削弱致密的腫瘤基質，促進納米粒和小分子的瘤內滲透，腫瘤抑制率高達67.5%。

帶陽離子的DDS能通過吸附誘導的轉胞吞作用同時實現(xiàn)藥物的跨腫瘤血管穿透和瘤內深層滲透。然而，由于生理環(huán)境中存在大量帶負電荷的物質，陽離子DDS在血液循環(huán)中極不穩(wěn)定。Zhou等[46]利用血管內皮細胞和腫瘤細胞表面高表達γ-谷氨酰轉肽酶(GGT)的特點，設計了一種可響應于GGT發(fā)生電荷反轉的兩性離子聚合物-喜樹堿偶聯(lián)物(PBEAGA-CPT)。PBEAGA末端為谷氨酸，生理條件下帶負電荷，在GGT催化下會脫去谷氨酸并暴露出一個伯氨基末端，此伯氨基可在腫瘤弱酸性微環(huán)境中質子化而帶正電荷。因此，PBEAGA-CPT偶聯(lián)物在體循環(huán)中帶負電荷，在與腫瘤血管內皮細胞或腫瘤細胞接觸時，PBEAGA-CPT中的伯氨基在GGT催化下發(fā)生質子化，電荷反轉為正，引發(fā)轉胞吞作用，成功實現(xiàn)藥物的跨腫瘤血管和瘤內深層滲透，顯著增強了CPT對大體積(～ 500 mm3)肝癌和胰腺癌的治療效果。

使用酶(透明質酸酶、膠原酶等)直接消融腫瘤ECM有利于增加藥物于胰腺癌內的蓄積。Zinger等[47]證實了瘤內膠原蛋白的消融能增加后續(xù)納米藥物的瘤內蓄積，增強納米藥物的抗胰腺癌效果：荷瘤小鼠在予以膠原酶脂質體治療后，瘤內膠原含量下降且組織網孔密度降低，多種納米粒(30 nm膠束、100 nm金納米粒及脂質體)瘤內蓄積增加。類似地，Zhou等[48]通過將透明質酸酶直接嵌入納米粒外殼成功提升了納米粒的腫瘤蓄積量。

3.2 增加PCAFs對藥物的靶向攝取 由于PCAFs靶向調節(jié)劑的作用靶點幾乎都在胞內，因此除促進藥物蓄積于PCAFs周圍外，促進藥物靶向入胞是進一步提升PCAFs靶向調控效率的必要條件。

轉鐵蛋白受體1(CD71)在胰腺癌細胞及PSCs表面均高表達，Liu等[49]將具有CD71靶向性的核酸適體“XQ-2d”、磷酸化酪氨酸識別和結合能力的SH2超結合子“SH2 CM”及細胞穿透肽“(Arg)9”相偶聯(lián)，制備了XQ-2d-His-SH2 CM-(Arg)9偶聯(lián)物，XQ-2d賦予該偶聯(lián)物精確靶向胰腺癌細胞和PSCs的能力，(Arg)9則能增加偶聯(lián)物的入胞效率，“SH2 CM”則具有阻斷胞內磷酸化酪氨酸相關信號通路的能力。體外藥效學研究表明，XQ-2d-His-SH2 CM-(Arg)9偶聯(lián)物既能高效阻斷人胰腺癌細胞PANC-1和BxPC-3胞內EGFR、VEGFR2、IGF-1R、Src、AKT和ERK1/2等多條磷酸化酪氨酸相關的信號通路，有效抑制胰腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移，又能通過降低PSCs胞內STAT3、Smad2/3和ERK1/2的磷酸化水平，誘導PSCs靜息，減少α-SMA、纖連蛋白和I型膠原蛋白等ECM分泌。XQ-2d-His-SH2 CM-(Arg)9偶聯(lián)物在體內研究中顯示了較非靶向組更優(yōu)越的抑癌能力。

Huang等[17]構建了一種胰腺癌基質靶向納米凝膠LQT-TRAIL-NO@Nanogel，該納米凝膠具有“核-殼”結構，內核由蠶絲蛋白荷載腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)而成，外殼為PLGA-脂質雜化物，NO供體被包裹于PLGA層中，最外部修飾了由噬菌體展示技術篩選出的PSCs靶向肽LQT。LQT-TRAIL-NO@Nanogel能將NO供體及TRAIL特異性地靶向遞送至胰腺腫瘤中，在削弱胰腺癌致密基質的同時，克服胰腺癌對TRAIL的耐藥性：LQT增強PSCs的攝取效率，使NO供體發(fā)揮了高效的PSCs重塑能力，有效減輕胰腺癌結締組織增生，促進TRAIL瘤內滲透，NO還可通過下調腫瘤細胞中Bcl-2的表達來阻斷其抗凋亡特性，增強TRAIL誘導的腫瘤細胞凋亡，協(xié)同TRAIL的抗胰腺癌作用。體內藥效學評價顯示，LQT-TRAIL-NO@Nanogel在小鼠胰腺癌原位同種移植模型(AK4.4及KPC001)和人胰腺癌原位異種移植模型(AsPC-1)中均顯著削弱癌基質，并在AK4.4模型中增強了TRAIL的療效。

3.3 進一步優(yōu)化靶向釋藥行為 DDS蓄積在PCAFs周圍或被攝入胞內后，需進一步實現(xiàn)高效的藥物釋放才能充分發(fā)揮PCAFs靶向調控作用。結合外源性刺激(熱、磁場和超聲波等)或TME內特殊的生理刺激(如酶、酸、ROS、GSH和ATP等)，在前述藥物遞送策略基礎上進一步引入響應型控釋設計，優(yōu)化釋藥行為，有利于更高效的PCAFs靶向調控。

基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)在正常組織表達量很低，但在腫瘤基質、PSCs和腫瘤細胞中過度表達。Ji等[13]通過MMP-2響應性的脂質體負載吡非尼酮制備了一種能同時調控PSCs及胰腺癌細胞的納米粒MRPL，MRPL可響應于腫瘤基質、PSCs和腫瘤細胞中過表達的MMP-2釋放PFD，下調PSCs所表達的纖連蛋白、Ⅰ型膠原蛋白、生腱蛋白C和蛋白聚糖等多種ECM成分。體內藥效學研究顯示，腫瘤經MRPL治療后，基質致密程度減弱，小分子瘤內滲透深度達到對照組的9.2倍，吉西他濱的瘤內蓄積量達到對照組的3倍，腫瘤凋亡面積達到對照組的2.9倍，吉西他濱的抗胰腺癌作用得到顯著增強。

Duan等[32]設計了一種能被膜型基質金屬蛋白酶-1(MT1-MMP)激活的智能脂質體MR-T-PD，分別向腫瘤血管內皮細胞遞送低密度cRGDfK，向胰腺癌細胞遞送阿霉素(DOX)，以及向PSCs遞送磷酸化卡泊三醇(PCAL)。MR-T-PD能被腫瘤內皮細胞表面的MT1-MMP選擇性激活并釋放低密度cRGDfK，特異性促進血管生成，從而增強MR-T-PD于乏血供胰腺癌的瘤內遞送量；MR-T-PD則能在腫瘤局部加熱條件下釋放DOX誘導腫瘤細胞凋亡；而PCAL在PSCs表面的堿性磷酸酶作用下轉化為卡泊三醇(CAL)，CAL進而誘導PSCs靜息，增效DOX的抗腫瘤功效。最終，MR-T-PD在BxPC-3/HPaSteC腫瘤球以及體內模型中顯示出高效的PSCs靜息能力和細胞凋亡誘導能力。

溶酶體中存在大量的組織蛋白酶B，Li等[50]利用組織蛋白酶B敏感性二肽接頭纈氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)將膽固醇與短肽(HHHKKHHHKK)相偶聯(lián)，繼而荷載干擾膠原合成的siPCBP2，開發(fā)了一種組織蛋白酶B敏感型納米復合體cholesterol-peptides/PCBP2 siRNA。該納米復合體能在PSCs溶酶體內響應于組織蛋白酶B的刺激而解聚，快速釋放siPCBP2，進而通過高效沉默PCBP2表達來降低胰腺癌基質中I型膠原的沉積，在富含基質的PANC-1/NIH3T3腫瘤球模型中顯著增強小分子藥物滲透，并在體內模型中成功削弱腫瘤基質并提升吉西他濱的療效。

4 總結與展望

PCAFs靶向調控策略已展示出了其在改善抗腫瘤藥物遞送和增效多種抗胰腺癌療法方面的巨大潛力。由于PCAFs具有不同的起源、表型及生物學作用，不同機制的PCAFs調控藥物可能會使胰腺癌TME發(fā)生不同的改變，因此在靶向調控PCAFs時需明確所施用藥物的藥理機制。除直接靶向調控PCAFs外，針對PCAFs與胰腺癌TME中其他組分之間串擾的調控策略也應受到充分的關注。此外，針對PCAFs靶向調控的藥物遞送策略仍具有較大的優(yōu)化空間：應充分考慮胰腺癌的生理病理特性，盡可能地克服藥物的瘤內蓄積、攝取和釋放障礙；PCAFs的表型多樣性和可塑性對其靶向調控藥物的精確時空遞送具有更高的要求。