雷梵章，陳曼，梅書(shū)燕，方雅婷，2，朱波峰

1.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院 廣州市法醫(yī)多組學(xué)精準(zhǔn)鑒識(shí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510515；2.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230031

作為地球上最為豐富多樣的生物資源之一，從土壤、水體到火山和冰川，從植物根際到人類體內(nèi)腔道，微生物無(wú)處不在。微生物群落（microbiota）是原核生物與真核生物界中不同微生物的集合，其活動(dòng)行為影響著微生物結(jié)構(gòu)、代謝物、可移動(dòng)遺傳元件以及棲息地環(huán)境中的游離DNA[1]，同時(shí)通過(guò)微生物-環(huán)境-宿主之間獨(dú)特的相互作用組成了動(dòng)態(tài)多樣的微生態(tài)環(huán)境。自2007年人類微生物組計(jì)劃（The Human Microbiome Project，HMP）啟動(dòng)以來(lái)，各個(gè)國(guó)家和國(guó)際組織也相繼響應(yīng)，如地球微生物組計(jì)劃（Earth Microbiome Project，EMP）、美國(guó)國(guó)家微生物組計(jì)劃（National Microbiome Initiative，NMI）以及我國(guó)的中國(guó)科學(xué)院人類微生物組計(jì)劃等。同時(shí)，DNA 測(cè)序技術(shù)和數(shù)據(jù)分析技術(shù)的快速發(fā)展提高了研究人員對(duì)不同環(huán)境中復(fù)雜微生物群落組成結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化的認(rèn)識(shí)[2]，這使得微生物組（microbiome）這一概念在被提出后逐漸成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3]。

盡管微生物組通常被定義為“微生物群的基因和基因組，以及微生物群與宿主環(huán)境的產(chǎn)物”[4]，然而這一定義并不能概括當(dāng)前所有領(lǐng)域中的微生物組研究。根據(jù)2020 年MicrobiomeSupport 研討會(huì)的意見(jiàn)[1]，微生物組的定義被重新修訂為“具有獨(dú)特理化性質(zhì)和合理明確棲息地的特征性微生物群落”，同時(shí)微生物組的含義還包括了這些微生物的活動(dòng)影響范圍及生態(tài)位。由此可見(jiàn)，微生物組及周?chē)h(huán)境所組成的動(dòng)態(tài)微生態(tài)系統(tǒng)是微生物組學(xué)的主要研究對(duì)象，而微生態(tài)系統(tǒng)中的微生物群落演替模式則可在一定程度上反映環(huán)境-宿主影響因素的變化。這些反映人類微生物群落演替規(guī)律的相關(guān)影響因素可為明確犯罪嫌疑人和被調(diào)查對(duì)象的種族、性別、年齡、健康狀況、地理位置、飲食習(xí)慣、生活習(xí)慣、職業(yè)情況等信息提供重要依據(jù)，而環(huán)境微生物組的群落結(jié)構(gòu)可用于對(duì)樣本所處的地理環(huán)境情況進(jìn)行推斷?；谏鲜鎏攸c(diǎn)，微生物組學(xué)可應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)同一認(rèn)定、地域特征鑒識(shí)、組織或體液來(lái)源鑒定、死因分析、死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI）推斷、死后淹沒(méi)時(shí)間（postmortem submersion interval，PMSI）推斷等研究中。本文通過(guò)介紹微生物組學(xué)分析技術(shù)、法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域相關(guān)的微生物組學(xué)及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用等方面，系統(tǒng)闡述了微生物組學(xué)在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展，并對(duì)其在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中所面臨的問(wèn)題和前景進(jìn)行總結(jié)。

1 微生物組學(xué)主流分析技術(shù)

1.1 標(biāo)記基因分析

標(biāo)記基因分析是一種對(duì)特定基因區(qū)域周?chē)谋Ｊ貐^(qū)設(shè)計(jì)引物以獲得標(biāo)記基因的擴(kuò)增子，從而進(jìn)行微生物組分析的方法[5]。常用的標(biāo)記基因包括細(xì)菌和古細(xì)菌的16S rRNA 基因以及真菌的18S rRNA 基因和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）。在對(duì)上述標(biāo)記基因進(jìn)行擴(kuò)增后，一般按照97%的序列相似性的閾值對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行聚類并分組，得到細(xì)菌的分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU）[6]，最后根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)已知信息將每個(gè)OTU 所代表的序列進(jìn)行分類學(xué)注釋。這種方法通過(guò)97%的相似性將多個(gè)序列模糊成抽象一致的單個(gè)序列，雖然在分子生物學(xué)技術(shù)的早期發(fā)展階段可以一定程度上減少PCR 和測(cè)序錯(cuò)誤的影響，但其分類學(xué)注釋水平也隨之降低。近年來(lái)隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，有學(xué)者認(rèn)為上述閾值存在一定的局限性，以16S rDNA 全長(zhǎng)和V4 高變區(qū)為例，理論上最優(yōu)的OTU 聚類閾值應(yīng)分別為99%和100%[7]。此外，目前新興的擴(kuò)增子序列變異（ampli?con sequence variant，ASV）分析則從根本上提高了物種分類注釋水平[8]。該方法首先對(duì)目標(biāo)區(qū)域的基因進(jìn)行精準(zhǔn)測(cè)序，再使用如DADA2 等概率模型對(duì)測(cè)序及擴(kuò)增錯(cuò)誤所產(chǎn)生的序列進(jìn)行過(guò)濾[9]，隨后將位于相同基因區(qū)域的ASV 作為最小分類單元直接與參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，從而實(shí)現(xiàn)種水平以上的物種分類。然而，應(yīng)用ASV 或使用較高的聚類閾值可能會(huì)將單個(gè)原先的代表性微生物類群也分成多個(gè)類群[8]，從而降低研究結(jié)果的可解釋性。因此，在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中應(yīng)結(jié)合研究目的和實(shí)際情況選擇分類方法，以獲得更具研究意義的微生物類群結(jié)果。

標(biāo)記基因分析法的優(yōu)點(diǎn)：（1）效率高、成本低；（2）適用于低生物量或宿主DNA 污染程度較高的樣品[5]；（3）文庫(kù)構(gòu)建簡(jiǎn)便，已有大量公共數(shù)據(jù)集可供參考；（4）與基因組含量的相關(guān)性較高，易于定量[10]。然而，該方法的缺點(diǎn)：（1）分辨率較低，限制在屬水平，可獲得的功能信息有限[11]；（2）不能區(qū)分DNA 是否來(lái)源于活體；（3）無(wú)法同時(shí)研究細(xì)菌、真菌以及病毒等物種[12]；（4）引物和可變區(qū)的選擇對(duì)結(jié)果影響較大，同時(shí)易受到PCR 擴(kuò)增偏倚的影響[13]。

1.2 宏基因組分析

由于傳統(tǒng)研究無(wú)法對(duì)多種微生物進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)以及測(cè)序，因此HANDELSMAN 等[14]在對(duì)土壤微生物進(jìn)行研究時(shí)首次提出了將環(huán)境中全部微生物遺傳物質(zhì)作為研究對(duì)象的概念——宏基因組學(xué)。與標(biāo)記基因分析相比，宏基因組分析可對(duì)樣品中存在的所有DNA 進(jìn)行測(cè)序分析，包括真核生物DNA 和病毒等。

宏基因組分析法的優(yōu)點(diǎn)：（1）分辨率高，可對(duì)微生物群落進(jìn)行種、株水平的分類[15]；（2）可直接獲得功能基因的相對(duì)豐度；（3）較少受到擴(kuò)增偏倚的影響。缺點(diǎn)[5]：（1）成本較高，樣本處理方法復(fù)雜；（2）對(duì)測(cè)序通量有一定要求，數(shù)據(jù)分析難度大；（3）無(wú)法區(qū)分DNA是否來(lái)源于活體，無(wú)法獲得表達(dá)信息；（4）易受宿主DNA 及其細(xì)胞器的污染；（5）組裝中產(chǎn)生的錯(cuò)誤會(huì)降低群體平均微生物基因組的準(zhǔn)確率。

1.3 宏轉(zhuǎn)錄組分析

上述兩種方法僅對(duì)DNA 序列進(jìn)行分析，而對(duì)DNA 來(lái)源生物體的存活與否并未加以區(qū)分，因此，在探究微生物功能時(shí)具有一定的局限性。宏轉(zhuǎn)錄組以活體中才能穩(wěn)定表達(dá)的RNA 為研究對(duì)象，可通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)直接獲取微生物群落的基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性等信息。

宏轉(zhuǎn)錄組分析的優(yōu)點(diǎn)：（1）當(dāng)與標(biāo)記基因分析結(jié)合使用時(shí)，可以對(duì)群落中的微生物轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行推斷；（2）可對(duì)活動(dòng)生物進(jìn)行分析并直接評(píng)估其轉(zhuǎn)錄情況[16]；（3）可捕捉細(xì)胞內(nèi)部的動(dòng)態(tài)變化[17]。缺點(diǎn)：（1）費(fèi)用最高，樣本處理和建庫(kù)難度高，數(shù)據(jù)分析復(fù)雜[18]；（2）必須排除宿主mRNA和rRNA的污染[13]；（3）RNA不穩(wěn)定，樣本的收集和存儲(chǔ)難度高；（4）轉(zhuǎn)錄活性高的生物體可造成數(shù)據(jù)結(jié)果的偏倚。由于成本和技術(shù)限制，目前微生物宏轉(zhuǎn)錄組分析較少應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)研究。

1.4 法醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域中微生物組學(xué)分析技術(shù)的對(duì)比

為了研究微生物組學(xué)分析技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展，筆者在PubMed 文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）中以[（forensic[Title/Abstract]）AND（（microbiome[Title/Abstract]）OR（microbiota[Title/Ab?stract]）OR（microbial[Title/Abstract]））NOT（Corri?gendum[Title/Abstract]）NOT（Review）]檢索2020 年以來(lái)的法醫(yī)微生物組相關(guān)文獻(xiàn)。隨后對(duì)檢索到的89 條結(jié)果根據(jù)其與法醫(yī)微生物組學(xué)的相關(guān)性進(jìn)行篩選，最終得到39 篇法醫(yī)微生物組學(xué)文獻(xiàn)。篩選標(biāo)準(zhǔn)：（1）被科學(xué)引文索引收錄；（2）研究對(duì)象為微生物組本身；（3）研究?jī)?nèi)容不以實(shí)驗(yàn)方法改進(jìn)為主；（4）研究結(jié)果具有較高的法醫(yī)學(xué)意義。在上述39 篇文獻(xiàn)中摘選出在主要法醫(yī)微生物組學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域中具有不同分析技術(shù)的代表性研究（表1）。此外，根據(jù)不同分析和測(cè)序方法及其應(yīng)用領(lǐng)域、物種分類方法、主要機(jī)器學(xué)習(xí)模型等維度，使用Matplotlib v3.5.1[19]對(duì)上述39 篇法醫(yī)微生物組學(xué)文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并繪制了復(fù)合環(huán)形圖（圖1）。其中標(biāo)記基因分析（74.35%）和OTU（46.15%）分別是最常見(jiàn)的分析方法和物種分類方法，而基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass-spectrometer，MALDITOF-MS）技術(shù)在分析如微生物群落的代謝產(chǎn)物等微生態(tài)生化環(huán)境時(shí)則較為常用。值得一提的是，近兩年法醫(yī)微生物組學(xué)研究中所使用的機(jī)器學(xué)習(xí)模型種類較多，其中以隨機(jī)森林模型（25.64%）最常見(jiàn)，而人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型（5.13%）的相關(guān)研究亦時(shí)有出現(xiàn)。

圖1 近3 年來(lái)法醫(yī)微生物組學(xué)在不同應(yīng)用領(lǐng)域研究中所使用的分析方法復(fù)合環(huán)形圖Fig.1 Composite ring chart of analytical methods used in forensic microbiomics studies for different applications in the last 3 years

表1 法醫(yī)微生物組學(xué)主要研究應(yīng)用領(lǐng)域中的分析技術(shù)Tab.1 Analytical techniques in major application fields of forensic microbiomics

2 微生物組學(xué)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用新進(jìn)展

2.1 人類微生物組

人類微生物組結(jié)構(gòu)具有高度的個(gè)體特異性，早期研究[35]結(jié)果表明，同卵雙生子之間腸道微生物組結(jié)構(gòu)的相似性與異卵雙生子接近，說(shuō)明微生物群落受到環(huán)境因素的影響可能比宿主遺傳因素更大。DAVID 等[36]對(duì)受試者的口腔、皮膚和糞便樣本進(jìn)行長(zhǎng)期采樣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不但個(gè)體間微生物組結(jié)構(gòu)不同，而且同一個(gè)體的微生物組在不同部位及時(shí)間段中也存在差異，但其群落特征仍具有一定的時(shí)間穩(wěn)定性。值得一提的是，晝夜變化也可能是影響微生物組的因素之一。WILKINS等[37]發(fā)現(xiàn)晝夜不同時(shí)段所采集的同一受試者皮膚、家庭物品以及公共設(shè)施表面樣本之間有160個(gè)微生物類群存在顯著豐度差異，認(rèn)為這種晝夜差異可能與人類曉行夜宿的生活習(xí)性有關(guān)，并通過(guò)構(gòu)建動(dòng)態(tài)貝葉斯網(wǎng)絡(luò)（dynamic Bayesian networks，DBN）初步驗(yàn)證了上述假設(shè)，但仍無(wú)法排除如洗澡和生理狀況等因素的影響。

微生物群落的差異也體現(xiàn)在同一個(gè)體之中。不同器官或身體部位中所定植的微生物之間其種類和特征具有顯著差異，從而形成了各自的“核心微生物群”（core microbiota），如口腔中的乳桿菌屬（lactoba?cillus）、嗜血桿菌屬（haemophilus）等，皮膚上的丙酸桿菌屬（propionibacterium）、棒桿菌屬（corynebacterium）、微球菌屬（micrococcus）等，腸道中的梭菌屬（clos?tridium）、擬桿菌門(mén)（bacteroidetes）等。同一個(gè)器官或腔道內(nèi)的微生物群落之間亦存在差異，如不同部位的皮膚微生物在組成和結(jié)構(gòu)上有顯著差異，這可能是不同部位皮膚的形態(tài)特征差異所導(dǎo)致的[38]。人類與環(huán)境的相互作用是影響微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的重要因素[38]，這些環(huán)境因素或作為免疫刺激物，通過(guò)炎癥反應(yīng)等方式影響微生物群，或帶來(lái)了定植在個(gè)體中的微生物。此外，影響群落演替的因素還包括性別、年齡、種族、飲食、地域、疾病、體型、生活方式等，這些特點(diǎn)使得微生物組分析可應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)同一認(rèn)定、組織或體液來(lái)源鑒定、地域特征推斷及PMI 推斷等，為案件偵查提供指向性線索。

2.1.1 同一認(rèn)定研究

微生物組成具有一定的個(gè)體特異性，可應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)同一個(gè)體認(rèn)定。早期相關(guān)研究[39]主要描述人體口腔和唾液微生物群落特征和時(shí)空穩(wěn)定性，為微生物組學(xué)的未來(lái)發(fā)展帶來(lái)深遠(yuǎn)影響。2016 年，OH 等[40]利用鳥(niǎo)槍法測(cè)序進(jìn)一步對(duì)種、亞種分類階元水平的人類皮膚微生物組進(jìn)行分析，該研究隨后公開(kāi)了近3 年間采集的594 份皮膚樣本中所測(cè)得共720 kGbp 的測(cè)序數(shù)據(jù)，為后續(xù)的皮膚微生物組學(xué)研究提供了重要的數(shù)據(jù)資源。SCHMEDES 等[41]則基于OH 等[40]公開(kāi)的宏基因微生物組測(cè)序數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)了一種將皮膚微生物組與受試者進(jìn)行配對(duì)的新方法，通過(guò)有監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)模型從12 個(gè)微生物進(jìn)化支上篩選出如瘡皰丙酸桿菌（pro?pionibacterium acnes）等個(gè)體特異性皮膚微生物類群及其核苷酸多態(tài)性標(biāo)記。隨后SCHMEDES 等[42]在先前研究的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了一個(gè)法醫(yī)皮膚微生物組個(gè)體識(shí)別的hidSkinPlex 體系，該體系可對(duì)22 個(gè)不同微生物進(jìn)化支上從屬到亞種水平的286 個(gè)皮膚標(biāo)志性微生物類群進(jìn)行靶向測(cè)序。該團(tuán)隊(duì)先后使用最鄰近分類[43]、支持向量機(jī)[21]和LASSO 算法[22]以驗(yàn)證該體系在法醫(yī)個(gè)體識(shí)別中的效能，并進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了更為精簡(jiǎn)穩(wěn)定的hidSkinPlex+體系[22]。值得一提的是，SHERIER等[22]在上述研究中還計(jì)算了來(lái)自不同個(gè)體間皮膚微生物類群的直系同源SNP 的固定指數(shù)（fixation index，F(xiàn)ST），可以直觀地對(duì)不同微生物類群的遺傳距離進(jìn)行區(qū)分，同時(shí)提高了皮膚微生物組與其人類宿主的匹配準(zhǔn)確性。

與STR 等主流DNA 遺傳標(biāo)記相比，利用微生物組分析技術(shù)所進(jìn)行個(gè)體同一認(rèn)定準(zhǔn)確率雖然較低，但通過(guò)微生物組學(xué)分析技術(shù)可在具有相同基因組信息的同卵雙生子的同一認(rèn)定中起到輔助甄別的作用。STAHRINGER 等[44]首次對(duì)全同胞兄弟姐妹和雙生子使用口腔微生物組進(jìn)行同一認(rèn)定的可能性進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)同卵和異卵雙生子之間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但雙生子之間的相似性在成年獨(dú)居后有下降趨勢(shì)。SUNDSTR?M 等[45]對(duì)同一家族成員的唾液樣本微生物群進(jìn)行16S rRNA 基因測(cè)序分析，結(jié)果顯示，13%的個(gè)體細(xì)菌群落差異可以用家族關(guān)系來(lái)解釋，母親比父親與成年子女共有的OTU 更多，但這種相似性隨著成年子女離家獨(dú)居逐漸減弱。然而，目前研究大多根據(jù)事先設(shè)定好的閾值（cut-off value）將雙生子分為兩個(gè)相斥的類別，這可能會(huì)帶來(lái)潛在問(wèn)題——即根據(jù)二分類結(jié)果進(jìn)行同一認(rèn)定時(shí)存在的“懸崖效應(yīng)”。BOZZA 等[46]通過(guò)貝葉斯因子對(duì)Jaccard 距離進(jìn)行量化，不僅實(shí)現(xiàn)了同卵雙生子的有效區(qū)分，同時(shí)避免了通過(guò)閾值進(jìn)行同一認(rèn)定時(shí)潛在的上述問(wèn)題。

LEE 等[47]使用16S rRNA 擴(kuò)增子對(duì)4 份STR 分型失敗的案件樣本直接進(jìn)行二次分析，其中2 份樣本成功進(jìn)行了同一認(rèn)定?？偠灾?，人類微生物組在個(gè)體中不僅具有長(zhǎng)期的時(shí)間穩(wěn)定性和較高的個(gè)體特異性，還能在二次分析中仍可獲得足夠的微生物學(xué)證據(jù)，可在同一認(rèn)定領(lǐng)域中作為法醫(yī)學(xué)DNA 分析的有力補(bǔ)充工具。

2.1.2 組織或體液來(lái)源鑒定

基于“核心微生物組”理論，微生物組分析可為法醫(yī)案件中的體液鑒定提供新方法。早期研究[48-49]首先對(duì)唾液和皮膚微生物組進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)唾液與手指皮膚的微生物組具備組織和體液來(lái)源特異性，同時(shí)在兩種檢材的混合樣本中皮膚微生物群落仍占顯著優(yōu)勢(shì)。DOBAY 等[50]將研究對(duì)象進(jìn)一步擴(kuò)展到除皮膚、唾液外的精液、陰道分泌液、月經(jīng)血、外周血等檢材，16S rDNA 擴(kuò)增子測(cè)序分析結(jié)果顯示，除了外周血樣本擴(kuò)增失敗外，其他樣本在室內(nèi)環(huán)境中保存30 d 后仍保留其身體部位來(lái)源的細(xì)菌表征。YAO 等[51]對(duì)皮膚樣本、唾液樣本以及兩者之間的不同混合模式進(jìn)行16S rDNA 擴(kuò)增子分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微生物群落的特征可用于混合樣本的體液鑒定。DíEZ LóPEZ 等[24]則對(duì)女性泌尿生殖道、鼻腔、皮膚和靜脈血樣本進(jìn)行大規(guī)模16S rDNA擴(kuò)增子分析，通過(guò)所訓(xùn)練深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)了高準(zhǔn)確度的組織或體液來(lái)源鑒定，預(yù)測(cè)模型在不同樣本中的曲線下面積（area under curve，AUC）均在0.97 以上。為進(jìn)一步分析不同測(cè)序方法對(duì)微生物組織或體液來(lái)源鑒定的影響，MEI 等[23]基于二代測(cè)序和單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)分別對(duì)16S rDNA V3～V4 高變區(qū)與基因全長(zhǎng)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，陰道分泌液和月經(jīng)血樣本的微生物組成相似，而前兩者與唾液、外周血之間則存在顯著差異。值得注意的是，該研究在線性判別效應(yīng)大小（linear discriminant analysis ef?fect size，LEfSe）分析中發(fā)現(xiàn)，同一體液中的微生物組在二代測(cè)序和單分子實(shí)時(shí)測(cè)序中存在群落結(jié)構(gòu)差異，其中全長(zhǎng)測(cè)序的序列注釋率更高，適合屬水平以下的微生物組研究。

生殖器部位的微生物組分析在性侵案件中同樣具有潛在法醫(yī)學(xué)價(jià)值。QUAAK[52]使用微陣列技術(shù)對(duì)手、足、腹股溝以及陰莖等部位的皮膚微生物組進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)手、足等皮膚核心微生物組在陰莖微生物組中并不具有代表性，兩者的群落結(jié)構(gòu)存在差異?；谏称髋c其他皮膚部位的微生物群落差異，WILLIAMS 等[53]進(jìn)一步通過(guò)基于貝葉斯模型的SourceTracker 軟件包對(duì)43 位受試者的陰阜拭子與陰毛樣本進(jìn)行16S rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)陰阜微生物組具有長(zhǎng)達(dá)6 個(gè)月的穩(wěn)定性，其中超過(guò)77%的樣本以棒桿菌屬、金黃色葡萄球菌（staphylococcus au?reus）、丙酸桿菌屬、乳桿菌屬為主，男性和女性的優(yōu)勢(shì)菌屬則分別為棒桿菌屬和乳桿菌屬。為了獲得分類階元更高的微生物多樣性圖譜，GHEMRAWI等[25]分別對(duì)陰莖與陰道微生物組進(jìn)行宏基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰道中的乳桿菌屬、加德納菌屬（gardnerella）和陰莖上的厭氧球菌（anaerococcus）、芬溝德菌屬（fi?negoldia）、嗜蛋白胨菌屬（peptoniphilus）等類群可分別作為對(duì)應(yīng)部位的候選標(biāo)志物。

2.1.3 地域特征鑒識(shí)

微生物群落生態(tài)在不同地域人群中的差異可能與其所處的地理位置、工業(yè)化程度以及生活習(xí)慣有關(guān)。早在2013 年，NAGASAWA 等[54]便發(fā)現(xiàn)幽門(mén)螺桿菌（helicobacter pylori）的基因型與其宿主的地理來(lái)源之間存在特異性，從而開(kāi)發(fā)了一種在日本、韓國(guó)和中國(guó)人群中推斷尸體地理來(lái)源的方法。LI 等[55]對(duì)德國(guó)、非洲和阿拉斯加人群從更大的地理尺度上進(jìn)行唾液微生物組分析：其中德國(guó)人群有著最高的微生物群落α 多樣性，這可能與其人口密度高、飲食結(jié)構(gòu)多樣有關(guān)；而在地理分布上較為分散且飲食結(jié)構(gòu)單一的非洲人群則微生物群落的β 多樣性較高。ESCOBAR 等[56]將哥倫比亞成年人腸道菌群與北美、歐洲、日本和韓國(guó)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)腸道菌群在人群之間具有顯著差異，其中放線菌門(mén)（actinobacteria）和疣微菌門(mén)（verru?comicrobia）等微生物類群表現(xiàn)出良好的地域特異性。雖然唾液和腸道微生物組的確展現(xiàn)出一定的地域特征鑒識(shí)應(yīng)用潛力，然而這些微生物組與消化系統(tǒng)緊密相關(guān)，其群落結(jié)構(gòu)受到不同地域飲食習(xí)慣特征的影響可能比地域環(huán)境本身更大。為了減少上述混淆因素的影響，BRINKAC 等[57]選取了來(lái)自美國(guó)3 個(gè)州的成年人的頭發(fā)和陰毛微生物組進(jìn)行分析，其中馬里蘭州和加利福尼亞州個(gè)體樣本中的嗜蛋白胨菌屬、葡萄球菌在豐度上有差異，而頭發(fā)在環(huán)境暴露的條件下更容易具備地域特征鑒識(shí)的應(yīng)用潛力。

2.1.4 其他應(yīng)用

人類皮膚微生物與物品之間的接觸可能會(huì)將微生物群落轉(zhuǎn)移到個(gè)人物品之上[40]，通過(guò)微生物組分析將物品與個(gè)體進(jìn)行聯(lián)系有潛在的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。NECKOVIC 等[58]對(duì)個(gè)體微生物組能否轉(zhuǎn)移到另一個(gè)物體表面或其他介質(zhì)上進(jìn)行了研究，并指示受試者按照兩種轉(zhuǎn)移模式（兩兩握手-觸摸介質(zhì)，觸摸介質(zhì)-交換介質(zhì)-觸摸交換后的介質(zhì)）進(jìn)行接觸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論介質(zhì)的類型或轉(zhuǎn)移模式如何，同組受試者之間的皮膚微生物組均發(fā)生了轉(zhuǎn)移。KODAMA 等[59]對(duì)不同犯罪現(xiàn)場(chǎng)中的26種物證進(jìn)行分析，隨后將死后皮膚微生物組與現(xiàn)場(chǎng)物證進(jìn)行匹配，其平均準(zhǔn)確率可達(dá)到75%。

通過(guò)微生物組分析以獲取飲食習(xí)慣、體重指數(shù)、生活方式等信息也可以為法醫(yī)案件偵查提供更多線索。飲食是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因素之一，如HUANG 等[60]發(fā)現(xiàn)食物中的脂肪酸通過(guò)影響口腔微生態(tài)改變口腔內(nèi)微生物膜的表征，從而一定程度上抑制口腔細(xì)菌的生長(zhǎng)。相比于附著在口腔內(nèi)的微生物膜，唾液中的微生物群落表征則呈現(xiàn)出不同特點(diǎn)，DE FILIPPIS 等[61]對(duì)雜食、乳蛋素食以及純素食者的唾液進(jìn)行微生物組和代謝組學(xué)分析，雖然唾液代謝組特征可用于區(qū)分飲食習(xí)慣，但其微生物群落受到飲食因素的影響并不顯著。此外，體重指數(shù)影響著腸道微生物群落的組成結(jié)構(gòu)，WANG 等[62]發(fā)現(xiàn)在屬水平上有44 個(gè)微生物類群在不同BMI 組中具有豐度差異，并使用線性判別分析對(duì)事先按照體重指數(shù)劃分的不同體型組別成功分類，準(zhǔn)確率達(dá)94.4%。該團(tuán)隊(duì)隨后使用嶺回歸分析和線性回歸分析對(duì)測(cè)試集樣本進(jìn)行體型預(yù)測(cè)，準(zhǔn)確率分別達(dá)72%和74%。生活方式也是影響微生物結(jié)構(gòu)的重要因素之一；YU 等[63]對(duì)吸煙者和非吸煙者進(jìn)行了調(diào)查，相比于非吸煙者，吸煙者頰黏膜中的微生物多樣性和組成顯著不同，同時(shí)α 多樣性較低；AL-ZYOUD 等[64]發(fā)現(xiàn)吸煙行為對(duì)男性和女性均產(chǎn)生了唾液微生物組的變化，從而有可能通過(guò)LEfSe 分析在屬的水平上對(duì)吸煙者和非吸煙者進(jìn)行分類。此外，如運(yùn)動(dòng)、職業(yè)、睡眠、飼養(yǎng)寵物和夫妻間的身體互動(dòng)等生活方式相關(guān)因素對(duì)微生物結(jié)構(gòu)也有一定影響[65-69]。

2.2 死亡微生物組

當(dāng)宿主死亡時(shí)，其體內(nèi)數(shù)以億萬(wàn)的微生物會(huì)進(jìn)行典范轉(zhuǎn)移（paradigm shift）[70]。由于宿主死亡，其內(nèi)環(huán)境發(fā)生缺氧并觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)因子的釋放，導(dǎo)致細(xì)胞自溶并向周?chē)M織釋放營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[71]。隨著尸體內(nèi)缺氧情況的加劇，尸體分解從有氧發(fā)酵轉(zhuǎn)變?yōu)閰捬醢l(fā)酵，從而使環(huán)境中充滿了如二氧化硫、硫化氫等腐敗氣體。隨后外源微生物、昆蟲(chóng)、食腐動(dòng)物在尸體中的活動(dòng)會(huì)進(jìn)一步改變微生物所處的環(huán)境，使得人體死后的微生物組發(fā)生巨大變化[70]。

為了對(duì)微生物因宿主死亡而發(fā)生演替的群落表征進(jìn)行描述，死后生物組（necrobiome）、死后細(xì)菌群落（epinecrotic bacterial community）等概念于2013 年和2014年被先后提出[72-73]，前者的定義是“參與分解如動(dòng)物腐肉和人類尸體等異養(yǎng)型生物遺骸的所有物種群落的總和”，后者則意為“在尸體分解時(shí)定植或遷徙到其表皮或腔道黏膜上的細(xì)菌”，屬于死后生物組概念的子集。為進(jìn)一步將死后生物組中的微生物作為主要研究對(duì)象，CAN 等[74]在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步提出“死亡微生物組”（thanatomicrobiome），即宿主死后在其尸體內(nèi)部存在的微生物群。許多生物因素以及非生物因素影響著死亡微生物組的群落演替變化[70]，如時(shí)間、溫度、濕度、日照、氧氣、pH 值、埋葬位置等非生物因素，以及宿主生前狀況、昆蟲(chóng)、食腐動(dòng)物等生物因素。此外，死亡微生物組在保存條件下還具有一定的時(shí)間穩(wěn)定性，SGUAZZI 等[75]對(duì)存儲(chǔ)在-20 ℃下5～16 年的18 份案件樣本進(jìn)行微生物組分析后發(fā)現(xiàn)，在長(zhǎng)期冷凍的陳舊DNA 提取物中沒(méi)有微生物特征受到污染的跡象，其微生物群落對(duì)比冷凍前也未發(fā)生顯著變化，表明保存良好的陳舊人類DNA 提取物或可成為微生物群落樣本的可靠來(lái)源?；谏鲜鲋T多特點(diǎn)，微生物組分析技術(shù)具有推斷PMI 和PMSI 以及死因分析等法醫(yī)學(xué)應(yīng)用潛力。

2.2.1 PMI 推斷

目前的PMI 推斷方法主要依賴于傳統(tǒng)的主觀形態(tài)學(xué)檢查，其結(jié)果易受到環(huán)境因素的影響?；诳陀^測(cè)序數(shù)據(jù)的微生物組分析可為PMI 推斷提供新方法[76]。研究[77]表明，死亡微生物組群落演替規(guī)律與尸體分解所處的時(shí)間階段聯(lián)系密切，如早期腐敗期開(kāi)始時(shí)以兼性厭氧菌為主，隨后則以專性厭氧菌占優(yōu)勢(shì)[74]，晚期腐敗期主要以土壤微生物為主，而在白骨化期時(shí)則以孢子形成的微生物群為主[77]。這種演替時(shí)間規(guī)律性為死亡微生物組在PMI 推斷中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

2013 年，METCALF 等[78]在小鼠模型中首次確認(rèn)了死后微生物群落演替與PMI 的高度相關(guān)性。同年，HYDE 等[79]發(fā)現(xiàn)人類死后近端結(jié)腸樣本中擬桿菌門(mén)和副擬桿菌屬（parabacteroides）的豐度與PMI 存在顯著負(fù)相關(guān)，梭菌屬則是PMI 推測(cè)的可選標(biāo)志物。經(jīng)大量研究[80-83]發(fā)現(xiàn)，此類標(biāo)志物在死亡微生物組學(xué)中被進(jìn)一步歸納為“死后梭菌屬效應(yīng)”（postmortem clos?tridium effect，PCE），對(duì)PMI 推斷有著重要意義。相較于近端結(jié)腸，HU 等[84]從死后5～192 h 的人類遺體中收集闌尾和橫結(jié)腸的微生物群落樣本，闌尾中ASV的豐度、數(shù)量以及α 多樣性均高于橫結(jié)腸，表明闌尾可能是死后腸道微生物組的更佳采樣部位。該團(tuán)隊(duì)隨后基于人類闌尾微生物群根據(jù)隨機(jī)森林算法構(gòu)建了PMI預(yù)測(cè)模型，其平均絕對(duì)誤差為（25.79±0.43）h。LIU等[85]通過(guò)分層聚類分析對(duì)分解時(shí)間為15 d 的小鼠盲腸分解模型進(jìn)行死后腸道微生物組研究，并通過(guò)乳桿菌屬、杜博斯菌屬（dubosiella）、腸球菌屬（enterococ?cus）和毛螺菌科（lachnospiraceae）等核心類群構(gòu)建了基于隨機(jī)森林的PMI 推斷模型，平均絕對(duì)誤差為20.01 h。除了死后腸道微生物組外，死后遺骨中的微生物組也可用于白骨化尸體的晚期PMI 推斷。DEEL等[29]根據(jù)肋骨微生物組的16S rRNA 和18S rRNA 基因分析結(jié)果開(kāi)發(fā)了一個(gè)基于隨機(jī)森林用于預(yù)測(cè)PMI的模型，在歷經(jīng)1～9 個(gè)月分解時(shí)間的尸體樣本中，該模型PMI 預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度可達(dá)±34 d，其中夏季樣本和16S rRNA 方法的平均絕對(duì)誤差分別低于春季樣本和18S rRNA 方法。

此外，亦有學(xué)者應(yīng)用真菌微生物組進(jìn)行PMI 的報(bào)道，如FU 等[86]利用宏條形碼（meta barcoding）技術(shù)發(fā)現(xiàn)，環(huán)境土壤和尸體土壤真菌區(qū)系之間存在顯著差異，并認(rèn)為晚期腐敗尸體的真菌群落表征具有一定PMI 推斷潛力；PROCOPIO 等[76]則首次對(duì)深埋尸體進(jìn)行研究，進(jìn)一步調(diào)查真菌群落在尸體長(zhǎng)時(shí)間分解周期中的作用，發(fā)現(xiàn)真菌群落表征存在與PMI 相關(guān)的分類趨勢(shì)，如被孢霉門(mén)（mortierellomycota）的豐度在尸體分解4～6個(gè)月后增加，子囊菌門(mén)（ascomycota）在2個(gè)月后增加，而擔(dān)子菌門(mén)（basidiomycota）的豐度則始終減少。

2.2.2 PMSI 推斷

由于水體環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)的復(fù)雜性，PMSI 推斷易受如水溫、鹽度、潮汐、水深、尸體水中移動(dòng)、水體化學(xué)成分、水生微生物以及食腐動(dòng)物等因素影響[31]，因此PMSI 推斷具有一定挑戰(zhàn)性。累積日度（accumu?lated degree days，ADD）法是目前主流的PMI 和PMSI尸體分解評(píng)分模型，具體方法是將死者從死亡到其尸體被發(fā)現(xiàn)時(shí)所歷經(jīng)的天數(shù)按0 ℃以上的日均溫度進(jìn)行累加，其意義在于綜合溫度和時(shí)間兩個(gè)因素進(jìn)行PMSI 推斷[87]。鑒于該方法的局限性，利用微生物組分析進(jìn)行PMSI 推斷逐漸成為研究熱點(diǎn)。DICKSON等[88]是最早對(duì)豬尸體中淡水水生微生物組進(jìn)行研究的團(tuán)隊(duì)之一，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)變形菌門(mén)（proteobacteria）、厚壁菌門(mén)（firmicutes）、梭菌屬（clostridium）、擬桿菌門(mén)和放線菌等為門(mén)水平的優(yōu)勢(shì)類群，而微生物群落隨淹沒(méi)時(shí)間和季節(jié)改變會(huì)發(fā)生演替。在此基礎(chǔ)上，BENBOW等[89]對(duì)放置于夏季和冬季淡水河流中的脊椎動(dòng)物遺骸上的微生物組進(jìn)行高通量測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，其微生物組在門(mén)水平上仍以變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)等為主，但屬水平上的微生物群落在季節(jié)和天數(shù)之間則存在顯著差異。CARTOZZO 等[31]將200 份豬白骨化尸體在淡水河中浸沒(méi)353 d，并對(duì)死亡微生物組的長(zhǎng)期變化和演替模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)梭菌屬、全噬菌科（holophagaceae）和伽瑪變形菌綱門(mén)（gammaproteobacteria）等類群的豐度與PMSI相關(guān)，基于肋骨和肩胛骨微生物組所構(gòu)建的線性回歸預(yù)測(cè)模型其均方根誤差（root mean square error，RMSE）分別為472.31 h 和 498.47 h。

2.2.3 死因分析

對(duì)尸體解剖中未發(fā)現(xiàn)明確死因的猝死者進(jìn)行死因鑒定是法醫(yī)工作者經(jīng)常面臨的挑戰(zhàn)。鑒于微生物組能夠反映其宿主生前的健康情況，利用死亡微生物組學(xué)分析進(jìn)行死亡方式和（或）死亡原因鑒定可為此類難題提供新思路。ZANEVELD 等[90]提出了“安娜·卡列尼娜原則”（Anna Karenina principle，AKP），即長(zhǎng)時(shí)間暴露在任意應(yīng)激原下的個(gè)體，其微生物群落會(huì)比健康個(gè)體更易發(fā)生改變，且這些個(gè)體之間的微生物群落結(jié)構(gòu)也具有一定差異。臨床研究[91]表明，腸道、口腔微生物的群落結(jié)構(gòu)和演替變化與宿主的局部疾病、系統(tǒng)性疾病以及精神疾病等具有顯著關(guān)系，如存在肥胖史、感染史、吸煙史的個(gè)體的β 多樣性增加[90]，而自殺人群則有著更高的OTU 多態(tài)性[92]。ZHANG等[93]將微生物OTU 與死者的年齡、性別、民族等數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)合，通過(guò)構(gòu)建機(jī)器學(xué)習(xí)模型以對(duì)死亡方式和（或）死亡原因進(jìn)行分類，正確率達(dá)到70.6%～87.6%。KASZUBINSKI 等[34]對(duì)已知死亡方式和（或）死亡原因的188 例尸檢案件中尸體上多個(gè)部位微生物群落的β多樣性進(jìn)行分析，開(kāi)發(fā)了一項(xiàng)基于隨機(jī)森林和logis?tics 回歸分類模型的用于推斷死者生前健康狀況和死因鑒定的方法。微生物-腸-腦軸是腸道微生物調(diào)節(jié)腦干5-羥色胺系統(tǒng)的重要途徑，而生命早期腸道菌群的建立時(shí)期也是易發(fā)生嬰兒猝死綜合征（sudden infant death syndrome，SIDS）的階段，同時(shí)腸道微生物對(duì)嬰兒在睡眠相關(guān)不良自主事件中是否能夠成功地自動(dòng)蘇醒起到關(guān)鍵作用[94]。HIGHET 等[95]對(duì)52 例SIDS 嬰兒的腸內(nèi)容物進(jìn)行微生物組分析，發(fā)現(xiàn)艱難梭菌（clostridium difficile）、無(wú)害梭菌（clostridium in?nocuum）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（clostridium perfringens）在SIDS 樣本中更常見(jiàn)，而在經(jīng)常俯臥位睡眠的SIDS 嬰兒中，金黃色葡萄球菌的定植更常見(jiàn)，同時(shí)存在該菌種轉(zhuǎn)移至無(wú)菌部位的現(xiàn)象。

2.3 環(huán)境微生物組

由于環(huán)境微生物的群落結(jié)構(gòu)易受溫度、pH 值、鹽濃度、氮濃度、有機(jī)碳濃度以及昆蟲(chóng)的活動(dòng)等因素的影響，因此微生物在不同地區(qū)甚至是同一地區(qū)不同地點(diǎn)的環(huán)境中其種類和構(gòu)成均不相同，其表征在一定程度上反映了樣本土壤所在地理位置的氣候、緯度、地貌、植被以及人類活動(dòng)等信息。劉文麗等[96]使用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)我國(guó)黑龍江省、青海省和西藏自治區(qū)的土壤樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同省份的土壤微生物OTU及其豐度有顯著差異。此外，在處于同一地域下的小尺度空間內(nèi)，兩個(gè)土壤微生物群落之間的相似性則隨著彼此空間距離的增加呈衰減關(guān)系[97]。這種小尺度空間土壤來(lái)源的精細(xì)區(qū)分往往更具有法醫(yī)學(xué)意義，如JESMOK 等[98]在10 種生態(tài)環(huán)境類型的土壤設(shè)立中心采樣點(diǎn)，隨后對(duì)采樣點(diǎn)不同垂直距離（0～152.4 cm）和水平距離（0～30.5 m）的土壤樣本進(jìn)行微生物組分析并基于k-近鄰模型構(gòu)建了一個(gè)不同生態(tài)環(huán)境土壤推斷方法，其中不同垂直和水平距離的土壤識(shí)別正確率分別達(dá)100%和94.4%以上。KARADAY? 等[99]則對(duì)模擬兇殺案中12 份土壤樣本的細(xì)菌和真菌微生物群落進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)可以在屬和種水平上區(qū)分證據(jù)樣本、犯罪現(xiàn)場(chǎng)樣本和對(duì)照樣本，同時(shí)主坐標(biāo)分析表明，證據(jù)樣本與犯罪現(xiàn)場(chǎng)參考樣本之間更相似，說(shuō)明微生物組分析可通過(guò)土壤樣本初步推斷案件與犯罪現(xiàn)場(chǎng)之間的關(guān)系。

水生生態(tài)系統(tǒng)中的微生物則主要以生物膜的形式存在，其附著的如巖石、沉木、水中尸體等表面決定了生物膜的類型，水體微生物組亦隨之改變[100]。水體微生物組同樣具有地理位置多樣性，如海洋和淡水水系中的微生物群落之間便具有較大差異[77]，其中海水以發(fā)光桿菌屬（photobacterium）和弧菌屬（vibrio）為主，淡水則主要為嗜水氣單胞菌（aeromonas hy?drophila）。溺死診斷也是重要的法醫(yī)日常工作之一，在肺及其他內(nèi)部器官中發(fā)現(xiàn)硅藻通常是溺死的重要診斷依據(jù)，但體積較大的硅藻有時(shí)會(huì)因無(wú)法穿過(guò)氣血屏障而造成誤判，因此體積更小的水生微生物或可成為溺死的標(biāo)志物。UCHIYAMA 等[101]使用TaqMan 探針對(duì)溺死尸體中8 種常見(jiàn)的浮游微生物進(jìn)行檢測(cè)，嗜水氣單胞菌在淡水溺水者中最常見(jiàn)，海中溺水者通?？蓹z測(cè)到發(fā)光桿菌屬和弧菌，而河中溺水者中則同時(shí)存在海水與淡水微生物類群。RUTTY 等[102]則借助UCHIYAMA 等[101]開(kāi)發(fā)的方法，對(duì)淡水、海水、淡海水中的尸體進(jìn)行分析，認(rèn)為PCR 探針?lè)勺鳛榭焖佟⒏咝У哪缢涝\斷方法。

城市中的建筑環(huán)境微生物組也同樣具備一定的法醫(yī)應(yīng)用潛力。MetaSUB 國(guó)際聯(lián)盟根據(jù)在60 座城市公共交通系統(tǒng)中采集到的設(shè)施表面樣本，首次繪制了城市微生物宏基因組的高分辨率可視化交互式圖譜[103]，圖譜中含有微生物功能特征、抗生素耐藥性基因、遺傳元件以及地理位置注釋等信息。通過(guò)Meta?SUB CAP 分析流程，發(fā)現(xiàn)雖然所有城市中存在一致的核心城市微生物類群，但不同城市的微生物群落結(jié)構(gòu)及其抗生素耐藥性基因組仍具有一定地域差異，這種差異可歸因于不同城市之間氣候、緯度、地表類型、人口數(shù)量等因素的影響。HUANG 等[104]則通過(guò)Meta?SUB 國(guó)際聯(lián)盟在大數(shù)據(jù)分析關(guān)鍵評(píng)估（critical assess?ment of massive data analysis，CAMDA）挑戰(zhàn)賽中提供的全球16 個(gè)已知城市和8 個(gè)未知城市的微生物組數(shù)據(jù)分別作為訓(xùn)練集與測(cè)試集樣本，利用微生物群落的相似性作為采樣城市的生物坐標(biāo)，并將其在地圖上進(jìn)行仿射變換，從而根據(jù)克里金插值法構(gòu)建了一個(gè)L2 正則化logistics 回歸模型，該模型地域特征推斷的準(zhǔn)確率在測(cè)試集中達(dá)到86%。

3 挑戰(zhàn)與展望

微生物不僅具有相對(duì)的時(shí)間穩(wěn)定性和地域特征差異，其群落演替也與環(huán)境、宿主相關(guān)的各種生物及非生物因素有著緊密聯(lián)系。然而法醫(yī)微生物組分析技術(shù)在擁有一定應(yīng)用潛力的同時(shí)，仍然面臨著許多困難和挑戰(zhàn)。

（1）樣本之間的交叉污染和宿主DNA 污染。有研究[105]報(bào)道，由于新一代測(cè)序分析技術(shù)高度的敏感性，在嚴(yán)格質(zhì)量控制的前提下仍有超過(guò)60 種污染性O(shè)TU 出現(xiàn)在空白對(duì)照和陰性對(duì)照中。此外，樣本間的交叉污染會(huì)產(chǎn)生條形碼分析結(jié)果中的“標(biāo)簽交換”（tag switching）和“索引跳變”（index hopping）等現(xiàn)象[106-107]，給法醫(yī)微生物組分析帶來(lái)難題。當(dāng)下迫切需要采用統(tǒng)一、嚴(yán)格的技術(shù)操作標(biāo)準(zhǔn)，盡可能避免低生物量微生物組樣本受到污染性DNA 和交叉污染等混雜因素的影響[105]。

（2）標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)流程和指南的缺乏。不同研究中數(shù)據(jù)分析方法的差異通常會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)之間缺乏直接可比性，如MetaPhlAn2 和Kraken2 兩種宏基因組物種定量方法之間存在較大差異，且結(jié)果不可互相轉(zhuǎn)換[108]。此外，近年來(lái)越來(lái)越多復(fù)雜的人工智能機(jī)器學(xué)習(xí)模型被應(yīng)用于法醫(yī)微生物組學(xué)中，這一方面使微生物組學(xué)的數(shù)據(jù)分析水平得到不斷提高，另一方面在法醫(yī)實(shí)踐應(yīng)用中也存在一定潛在風(fēng)險(xiǎn)。由于如神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等復(fù)雜機(jī)器學(xué)習(xí)算法中存在的“黑箱”（black-box）現(xiàn)象，研究者們往往難以解釋這些預(yù)測(cè)模型是如何得出結(jié)果的，這一定程度上降低了微生物組學(xué)相關(guān)應(yīng)用的可解釋性。因此，除了使用LIME 等軟件對(duì)黑箱現(xiàn)象進(jìn)行可視化外，在機(jī)器學(xué)習(xí)模型的分類效能和可解釋性之間的權(quán)衡依然顯得十分關(guān)鍵[109]。上述問(wèn)題提醒我們需要謹(jǐn)慎地選擇研究框架和數(shù)據(jù)分析手段。目前的首要任務(wù)就是制定分析流程標(biāo)準(zhǔn)和參考指南，以提高法醫(yī)微生物組學(xué)證據(jù)在法庭審判中的可信度和可解釋性。

（3）數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)有待完善?，F(xiàn)有的數(shù)據(jù)以發(fā)達(dá)國(guó)家及地區(qū)人群為主，對(duì)于具有不同種族、社會(huì)、文化、經(jīng)濟(jì)等背景的發(fā)展中國(guó)家及地區(qū)人群則鮮有相關(guān)研究，造成了人群上的選擇偏倚。而現(xiàn)有的主流數(shù)據(jù)庫(kù)只采集了性別、年齡、地理區(qū)域等基本信息，并未涉及受試者的社會(huì)-文化-經(jīng)濟(jì)情況、生活方式、健康狀況等與微生物群落組成相關(guān)的重要信息，而微生物群落結(jié)構(gòu)恰恰會(huì)受到上述因素的影響。雖然專門(mén)面向法醫(yī)研究者的法醫(yī)微生物組數(shù)據(jù)庫(kù)已于2021 年問(wèn)世（http://fmd.jcvi.org/index.php），但該數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)主要從現(xiàn)有公開(kāi)數(shù)據(jù)集和文獻(xiàn)中收集，這些公開(kāi)數(shù)據(jù)集中的樣本相關(guān)數(shù)據(jù)仍未進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，有時(shí)甚至出現(xiàn)被錯(cuò)誤注釋的情況[110]，在實(shí)際應(yīng)用中仍面臨分析方法不一、詳細(xì)信息缺失等問(wèn)題。此外，由于死亡微生物組在推斷PMI、PMSI 和死因鑒定等法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有重要價(jià)值，故有必要建立詳細(xì)記錄尸體分解過(guò)程相關(guān)環(huán)境和時(shí)間信息的死亡微生物組數(shù)據(jù)庫(kù)，以全面細(xì)致地對(duì)不同情況下死亡微生物群落的演替變化進(jìn)行研究。

（4）微生物組研究存在相關(guān)倫理問(wèn)題。如性別、年齡、種族、地理來(lái)源、健康狀況、生活習(xí)慣等相關(guān)信息的采集和推斷不僅具有侵犯?jìng)€(gè)人隱私的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)應(yīng)用這些信息進(jìn)行刑事調(diào)查時(shí)可能會(huì)使社會(huì)對(duì)與嫌疑人具有共同地理區(qū)域、習(xí)慣習(xí)俗、經(jīng)濟(jì)水平等背景的人群產(chǎn)生不利影響。根據(jù)微生物組學(xué)基礎(chǔ)研究的最新進(jìn)展[111-113]，目前可從如公共交通系統(tǒng)等城市建筑環(huán)境中的物體表面、空氣和灰塵中獲得大量微生物組信息，這些無(wú)需對(duì)人體進(jìn)行采樣便能收集到的微生物信息一旦結(jié)合現(xiàn)場(chǎng)遺留的如指紋和接觸性DNA 等檢材，便能通過(guò)橫跨不同生物界的宏基因組分析技術(shù)以獲得樣本中所蘊(yùn)藏的包括性別、年齡、體型、居住環(huán)境、生活習(xí)慣等至少10 多種個(gè)人信息[114]。因此，目前仍需要完善相關(guān)研究的知情同意和法律法規(guī)以規(guī)避倫理風(fēng)險(xiǎn)。

（5）實(shí)踐適用性有待提高。雖然法醫(yī)微生物組學(xué)在法醫(yī)許多應(yīng)用領(lǐng)域中皆展現(xiàn)出一定潛力，然而以下問(wèn)題使得該技術(shù)目前難以成為法醫(yī)工作中的常規(guī)工具手段：①數(shù)據(jù)分析復(fù)雜。從原始測(cè)序數(shù)據(jù)到有參考價(jià)值的可視化結(jié)果，每一步操作都需要不同平臺(tái)生物信息軟件的分析處理，這不僅要求操作者熟悉計(jì)算機(jī)語(yǔ)言，同時(shí)其結(jié)果解讀亦需要具備統(tǒng)計(jì)學(xué)和機(jī)器學(xué)習(xí)的背景知識(shí)。②成本較高。即便是最具性價(jià)比的標(biāo)記基因分析也通常依賴于二代測(cè)序平臺(tái)。同時(shí)由于微生物檢材易受到污染，因此對(duì)保存和提取要求較高，導(dǎo)致法醫(yī)微生物組分析的費(fèi)用和人工成本較高。③分析精度不高。當(dāng)下主要使用如16S rRNA 基因測(cè)序方法以獲取微生物組學(xué)數(shù)據(jù)。這種方法雖然利于控制成本，但其物種注釋只能在屬水平以上進(jìn)行，無(wú)法深入到更具個(gè)體特異性的種、株分類階元，而有限的微生物群落多樣性實(shí)際上難以滿足法醫(yī)個(gè)體識(shí)別的要求。綜合上述原因，可見(jiàn)法醫(yī)微生物組學(xué)離實(shí)現(xiàn)應(yīng)用落地和基層推廣仍然尚有一段距離。

如今，隨著數(shù)據(jù)庫(kù)的日益完善和單分子實(shí)時(shí)測(cè)序等三代測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，細(xì)菌種、株水平下的微生物組研究在微生物組的群落結(jié)構(gòu)、代謝特征、系統(tǒng)進(jìn)化、環(huán)境-宿主間作用機(jī)制等研究中取得了一系列進(jìn)展[115]，這些進(jìn)展有望為法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域相關(guān)研究帶來(lái)長(zhǎng)足進(jìn)步和深遠(yuǎn)影響。目前，仍集中在微生物基因組水平的主流微生物組學(xué)研究?jī)H能通過(guò)樣本中微生物種類和豐度等信息進(jìn)行“橫斷面研究”，并不足以剖析動(dòng)態(tài)而復(fù)雜的人類微生物組[116]。實(shí)際上，微生物群落結(jié)構(gòu)差異并不是由某些特定的優(yōu)勢(shì)微生物完全主導(dǎo)，宿主和環(huán)境等因素影響下微生物類群功能生態(tài)位的變化才是微生物群落結(jié)構(gòu)差異的驅(qū)動(dòng)力[117]。因此，未來(lái)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組的微生物多組學(xué)研究，通過(guò)探索微生物-環(huán)境-宿主所構(gòu)建的動(dòng)態(tài)微生物系統(tǒng)，為相關(guān)法醫(yī)學(xué)問(wèn)題提供更為深入全面的見(jiàn)解，進(jìn)一步促進(jìn)法醫(yī)微生物組學(xué)的應(yīng)用推廣。