金玉琴 張 遠 呂浩東 李貴鳳 季 駿

目前關于力學刺激對牙周膜成纖維細胞（periodontal ligament fibroblasts，PDLFs）的生物學反應的研究多數(shù)局限于體外研究[1，2]，而關于體內正畸牙移動過程中PDLFs對正畸力的生物學反應及相關的力學信號轉導機制的研究報道較少，有待深入探索。近年來，隨著細胞生物力學的發(fā)展，學者們開始關注機械力刺激對PDLFs生物學行為的影響，包括細胞增殖和分化，細胞因子的表達等，并取得了較多進展[3]。其中，血小板衍生生長因子-BB（platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB）是多功能生長因子，它對成纖維細胞、周細胞、干細胞等具有促增殖和趨化性，在體內創(chuàng)傷愈合和組織修復過程中發(fā)揮至關重要的作用[4，5]。PDGF-BB也可以刺激骨祖細胞或間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）等成骨分化，從而促進骨再生。目前已經知道PDGF-BB主要通過結合其受體PDGFRα或β來激活下游信號通路，從而發(fā)揮促細胞增殖、成骨分化等重要的生物學功能[6]。PDGF-BB/PDGFRs是成纖維細胞、周細胞和平滑肌細胞的重要調節(jié)因子。而PDGFRβ在成纖維細胞中廣泛表達，但是在正畸牙移動過程中，在正畸應力刺激下牙周膜中成纖維細胞是否對PDGF-BB有反應以及PDGFRβ表達是否上調，有待深入研究。

為此，本課題首先構建大鼠上頜正畸牙移動模型，檢測在正畸應力刺激下張應力側新骨形成情況，并研究在牙周膜中PDGF-BB、PDGFRβ表達水平是否發(fā)生變化，以期為促進骨改建、加速臨床正畸治療提供新的思路。

資料和方法

1.主要材料

鎳鈦螺旋拉簧（3M Unitek Monrovia，美國），正畸結扎絲（杭州奧杰醫(yī)療器械有限公司，中國），鹽酸四環(huán)素、茜素紅（Sigma，美國），BSA（Servicebio，中國）、α-SMA抗體、PDGF-BB、PDGFR-β（Abacam，美國）、DAB顯色試劑盒（DAKO，丹麥）。

2.動物實驗分組

本部分實驗共32只雄性SD大鼠，所有大鼠左側構建正畸牙移動模型，右側不加力，設為對照。其中，隨機選取16只大鼠于術后7天、14天進行序列熒光標記，術后28天時處死取材觀察新骨沉積情況，實驗分組為2組，分別為張應力組（Tension）、壓應力組（Pressure）；另外16只大鼠，分別于術后7天（n＝8）、14天（n＝8）處死取材進行免疫組化染色或者免疫熒光雙染，實驗分組為：不加力組（control組）、加力7天組（day7）、加力14天組（day14）。所有動物實驗程序均經南京大學實驗動物福利倫理審查委員會批準，倫理批準文號為2019NL-009（KS）。所有涉及大鼠的實驗都是按照相關指南和規(guī)定進行[7]。

3.大鼠正畸牙移動實驗

首先建立標準的大鼠正畸牙移動模型[8]。手術在SPF級動物房中操作，首先75%酒精消毒腹部，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠。待麻醉后，將大鼠仰臥位固定，在大鼠上頜兩個中切牙的近、遠中頸緣處磨出深約0.15～0.25 mm的槽溝以防結扎絲的滑脫，增加其固位。然后左側用0.20 mm正畸不銹鋼結扎絲穿過第一、二磨牙鄰接點下方，將結扎絲包繞第一磨牙牙頸部結扎固定，并于鎳鈦拉簧的一端連接固定，使拉簧固定于左側上頜第一磨牙與上頜切牙之間，力值為50 g左右。上頜右側第一磨牙不加力，設為對照側（圖1）。

圖1 大鼠正畸牙移動模型的建立

4.序列熒光標記實驗

隨機選取16只大鼠，于正畸牙移動術后7天、14天，分別按照25 mg/kg、30 mg/kg的劑量腹腔注射鹽酸四環(huán)素（Tetracycline，TE）、茜素紅（Alizarin，AL）等鈣離子螯合劑以對牙周張應力側新骨進行標記，檢測新骨形成和礦化的速率[9]。

5.組織學檢測

術后28天，處死上述16只大鼠，獲取大鼠上頜骨，固定于10%福爾馬林。標本梯度脫水，純二甲苯透明，包埋至固化，用Lecia-SP硬組織切片機將硬化的標本沿橫斷面（n＝8）或矢狀面（n＝8）連續(xù)切片，切片厚度約為150μm，手工磨片、拋光至30～40 μm。將上述沿橫斷面切的切片置于激光共聚焦顯微鏡下進行觀察序列標記的綠色、紅色熒光標記情況。兩種熒光的激發(fā)/發(fā)射波長分別為405/580 nm（TE，綠）、543/617 nm（AL，紅色）。并采用圖像分析軟件Image Pro Plus根據(jù)切片上熒光條帶之間的距離計算骨礦化沉積速度（mineral apposition rate，MAR，um/day）[9]。

6.免疫組織化學染色

剩余的16只大鼠分別于術后7天（n＝8）、14天（n＝8）處死，獲取上頜骨，福爾馬林固定24小時，然后放入10%EDTA中4℃下進行脫鈣6周左右，直至針尖可以輕易穿透牙齒。標本梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，用切片機沿磨牙長軸方向（矢狀向）進行切片，制備4μm的連續(xù)石蠟切片，然后將切片置于60℃烤箱中烤片2小時，后續(xù)實驗備用。

將石蠟切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇下行水化，抗原修復，用3%雙氧水阻斷內源性過氧化物酶，血清封閉，油性筆圈定區(qū)域后分別滴加抗α-SMA（1:200）、PDGF-BB（1:100）及PDGFR-β（1:100）一抗，置于濕盒中4℃孵育過夜。次日復溫后PBS沖洗3次，加二抗37℃孵育30分鐘，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明膠，中性樹膠封片，3D數(shù)字切片掃描儀掃描片子，用Case Viewer 2.3軟件打開片子進行觀察并拍照記錄。最后的免疫組化評分是用強度評分和百分比評分相乘來計算[10]。

7.組織免疫熒光雙染

石蠟切片脫蠟，梯度乙醇下行水化，抗原修復，3%BSA封閉，油性筆圈定區(qū)域后同一張切片上滴加抗α-SMA（1:300）、PDGFR-β（1:200）的一抗混合液，濕盒中4℃孵育過夜，次日復溫，PBS沖洗3次，每次3分鐘，甩干后滴加FITC標記山羊抗兔IgG和TRITC標記山羊抗鼠IgG混合熒光二抗（1:500），37℃孵育，PBS沖洗3次，滴加DAPI溶液（1μL DAPI+1mL PBS）染細胞核，滴加防熒光淬滅封片劑封片，晾干，激光共聚焦顯微鏡下觀察，綠色熒光（激發(fā)光405 nm）、紅色熒光（激發(fā)光543 nm）為陽性表達，核呈藍色熒光（激發(fā)光359 nm）。每張切片隨機選取3個不重疊的高倍視野進行觀察、拍照。

8.統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差方式表示，應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件處理。采用完全隨機設計的單因素方差分析和Student-Newman-Keuls（SNK）進行統(tǒng)計分析。P＜0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.大鼠正畸牙移動模型建立

實驗發(fā)現(xiàn)上頜左側第一磨牙在螺旋拉簧的機械作用力下均發(fā)生了向近中的移動，左側第一磨牙和第二磨牙之間出現(xiàn)肉眼可見的間隙，而右側對照側無明顯間隙，表明大鼠正畸牙移動模型建立成功（圖2）。

圖2 第7天正畸牙近中移動的典型圖像

2.序列熒光標記檢測結果

分別于正畸牙移動第7天、14天對第一磨牙牙槽骨新骨礦化沉積活動進行四環(huán)素（綠色）、茜素紅（紅色）熒光標記，然后于第28天取材后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。實驗檢測結果如圖3A所示，張應力側可見綠色熒光條帶沉積，紅色熒光沉積更明顯、面積更大，而壓應力側無明顯綠色熒光顯現(xiàn)，只有少量紅色熒光。張力側熒光面積明顯大于壓力側，說明壓力側無明顯骨化沉積活動，相反，張應力側有大量新骨增生、沉積。而紅色、綠色熒光帶之間的寬度表示新骨的寬度，通過兩種顏色標記條帶之間的距離計算新骨礦化沉積速率（mineral apposition rate，MAR），結果分析發(fā)現(xiàn)張應力側骨礦化沉積顯著快于壓應力側（圖3B），具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。

圖3 正畸牙移動28天后，序列熒光標記觀察加力側新生骨組織（A）及定量分析新骨礦化速率（B）

3.張應力側牙周膜免疫組化染色結果

在正畸牙移動模型中，通過免疫組化檢測在張應力刺激下張應力側PDLFs的α-SMA、PDGF-BB、PDGFRβ表達是否上調。結果圖4所示，對照組PDLFs表達α-SMA，呈淺褐色，而在加力7天后張應力區(qū)廣泛表達α-SMA，且顏色加深，呈棕褐色。表明張應力刺激下PDLFsα-SMA高表達，在7天時達到峰值，與對照組相比具有顯著差異（P＜0.01）。隨后在第14天時，α-SMA的表達有所下降，但仍然強于對照組（P＜0.01）。對照組牙周膜中只有少量PDGF-BB表達，而在張應力刺激下第7天PDGFBB表達升高，在第14天PDGF-BB表達稍下降，呈淺褐色，相比對照組均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。PDGFRβ在對照組牙周膜中只有零星細胞呈弱陽性表達，隨后在張應力刺激下，PDGFRβ表達逐漸增強，7天時染色最深，呈棕色，之后逐漸減弱，14天時仍有陽性表達。加力組PDGFRβ陽性細胞數(shù)均大于對照組，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。

圖4 大鼠正畸牙移動過程中，第一磨牙遠中根遠中區(qū)（張應力側）α-SMA、PDGF-BB、PDGFR-β免疫組化染色（A）及半定量分析（B）

4.牙周膜α-SMA和PDGFRβ蛋白共定位情況

通過石蠟切片上免疫熒光雙重染色PDGFRβ、α-SMA，確認PDGFRβ是否在α-SMA+PDLFs上表達，以及確認張應力刺激下α-SMA+PDLFs上PDGFRβ表達是否上調。如圖5所示，正常對照組雙側可觀察到染色較淺的紅色熒光（α-SMA），且綠色熒光（PDGFRβ）也顯示相同的表達情況，從Merged圖可以觀察到少量綠色熒光與紅色熒光共存于同一細胞。而在正畸加力7天后，張應力側牙周膜α-SMA、PDGFRβ相比對側壓應力側染色明顯增強，從Merged圖上可以看出張應力側α-SMA和PDGFRβ表達共定位的細胞數(shù)目顯著增加，呈黃色，說明張應力刺激下上調了α-SMA+PDLFs上的PDGFRβ表達。

圖5 正畸牙移動7天后，上頜骨左側牙周膜張應力區(qū)和壓應力區(qū)免疫熒光標記α-SMA（紅色）、PDGFR-β（綠色）、DAPI（藍色）的典型圖像

討 論

牙周膜和牙槽骨的改建是正畸牙齒移動的基礎[11，12]。在正畸力作用下，牙周膜內細胞、組織對壓縮和牽張應變的反應不同，最終導致壓力側牙槽骨發(fā)生骨吸收，張應力側發(fā)生骨形成。壓應力側牙周間隙變窄，血流減少，膠原纖維和基質降解吸收，RANKL表達上調，導致破骨細胞分化，分泌細胞因子，溶解骨基質中的羥基磷灰石和有機質等骨組織成分，從而發(fā)生牙槽骨吸收；張應力側牙周間隙變寬，血流量增多，膠原纖維和基質增生，成骨因子Runx-2、OPG等表達升高，骨基質分泌、礦化，繼而新生骨沉積[13]。序貫熒光標記方法用于示蹤骨組織新生或改建過程中的鈣鹽沉積活動，可記錄不同階段新骨形成速度，已被作為骨再生研究中的常規(guī)檢測手段廣泛應用[14]。而本實驗中通過序列熒光標記發(fā)證實了在加力28天后張應力側的確有大量新骨沉積，這有利于牙齒移動到新的位置并穩(wěn)定下來。

牙周膜是牙周組織中可形變最大的組織，是正畸牙移動的關鍵[15，16]。PDLFs是牙周膜中的主體細胞，能夠調節(jié)牙周膜代謝。且具有異質性，部分亞型具有成骨細胞的表型，可以在力學刺激下成骨向分化[17]。PDLFs能分泌多種細胞因子影響骨代謝，而且其自身功能和代謝也受很多細胞因子的調節(jié)和影響，間接調節(jié)骨形成和骨吸收活動[18]。同時PDLFs被認為是感受機械應變并做出機械反應第一受體[19，20]。在本實驗中，免疫組化結果顯示張應力側α-SMA陽性的PDLFs明顯增多，在加力第7天時達到峰值，推測是因為張應力刺激下PDLFs由相對靜息狀態(tài)轉化為活化狀態(tài)，從而細胞增殖活性增強，這與之前的一些研究結果相一致[21，22]?；罨某衫w維細胞α-SMA表達會增多[23]，本研究顯示張應力刺激下張應力側牙周膜中PDGF-BB、PDGFRβ表達均上調。有研究指出PDGFRβ的表達上調可作為成纖維細胞發(fā)揮功能的指標[24]。PDGF-BB主要由血管內皮細胞、巨核細胞和神經元細胞表達，主要以旁分泌的形式發(fā)揮作用[25，26]。體內研究表明，人重組PDGF-BB可以促進牙周組織再生，骨折和骨缺損的修復，加快組織愈合，提高成骨質量，促進牙周軟硬組織的恢復，促進種植體周圍骨組織形成[27]。而通過體內組織切片的免疫熒光共定位可以發(fā)現(xiàn)張應力刺激下PDGFRβ與α-SMA+的PDLFs共定位。由此推測在正畸力作用下，張應力側PDLFs感受力學刺激，張應力刺激促進牙周膜中PDGF-BB表達，并且與α-SMA+/PDGFRβ+的PDLFs結合，發(fā)揮生物學作用。

綜上所述，研究確定了大鼠正畸牙移動過程中張應力側有大量新骨形成。本研究發(fā)現(xiàn)在正畸牙移動過程中牙周張應力側PDGF-BB、PDGFRβ表達上調，而壓應力側無明顯上調，推測這可能與PDGFBB/PDGFRβ參與正畸骨改建過程，但其詳細的分子機制有待進一步的深入研究。