劉倩 楊菁

哺乳動物的妊娠是一個獨特、動態(tài)的免疫過程。妊娠期母體能忍受異體胎兒在體內(nèi)的生長，免疫耐受異常則可導致自然流產(chǎn)的發(fā)生，但母胎免疫調(diào)控的機制目前仍不明確。Fyn為非受體酪氨酸激酶SRC家族中的一員，參與調(diào)控各類免疫活動，尤其是T淋巴細胞的發(fā)育和功能，與多種自身免疫性疾病和移植排斥相關(guān)[1, 2]。雖然Fyn對輔助性T細胞(T helper cells, Th cells)Th1和Th2的發(fā)育無明顯影響，但可能通過干擾素調(diào)節(jié)因子4(interferon regulatory factor 4, IRF4)調(diào)控Th17細胞的增殖分化[3]。Th17細胞作為母胎免疫中的關(guān)鍵性元素，與自然流產(chǎn)的發(fā)病密切相關(guān)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，IRF4可通過視黃酸相關(guān)的孤兒受體γt(RAR-related orphan receptor Gamma T, RORγt)調(diào)控Th17細胞的分化和功能，進而影響母胎免疫[4]。但是，F(xiàn)yn在母胎界面的表達及作用仍然未知。因此，本研究擬探討Fyn在母胎界面的表達特點及其對Th17細胞和相關(guān)炎癥因子的調(diào)控作用，為進一步闡明流產(chǎn)發(fā)生的原因和母胎耐受的調(diào)控機制，以及尋找新的防治手段提供創(chuàng)新性的理論依據(jù)。

材料與方法

一、材料

1. 實驗動物：雌性和雄性BALB/C小鼠，SPF級，8～10周，購于武漢大學動物中心(動物合格證號：SCXK(鄂)2008-0004)。雌性CBA、雄性DBA/2小鼠，SPF級，8～10周，購于南京大學生物醫(yī)藥研究所(動物合格證號：SCXK(蘇)2010-0001)。相關(guān)動物操作已通過武漢大學倫理學委員會批準。

2. 主要試劑：RNA抽提試劑Trizol(美國invitrogen公司)、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR檢測試劑盒(日本takara公司)、Fyn多克隆抗體和GAPDH單克隆抗體(美國CST公司)、鼠通用型免疫組化試劑盒(丹麥Dako Denmark A/S公司)、小鼠Fyn單克隆抗體(美國Santa Cruz生物公司)、IRDye 800CW標記的羊抗兔IgG(美國LI-COR Biosciences公司)、流式檢測試劑盒(美國eBioscience公司)、Fyn活性抑制劑SU6656和細菌脂多糖LPS(美國sigma公司)。

3. 孕鼠模型建立：同種正常妊娠模型(BALB/C雌雄鼠合籠)；自然流產(chǎn)模型(CBA雌鼠×DBA/2雄鼠)，同時以正常妊娠模型(C57BL/6 ×BALB/c)為對照。檢出陰栓的當天記為妊娠的第0.5天(E0.5天)。

二、方法

1. LPS誘導流產(chǎn)模型及各實驗組的處理：將正常妊娠小鼠隨機分為4組行腹腔注射，前3組在E7.5天予以LPS 2.5mg：①低劑量SU6656 組，E 6.5、7.5、8.5天注射SU6656 5μg；②高劑量SU6656 組，E6.5、7.5、8.5天給予SU6656 20μg；③LPS組，E6.5、7.5、8.5天注射SU6656 對應(yīng)的溶劑；④對照組，在E6.5、7.5和8.5天僅給予等量的相應(yīng)溶劑。

2. 標本的采集和處理：對于同種正常妊娠模型，在E4.5、E8.5、E12.5、E16.5天，將小鼠斷頸處死，取子宮/胎盤組織，行實時定量PCR(real time quantitative PCR, qPCR)檢測；對于自然流產(chǎn)和對照的正常妊娠模型小鼠，在E14.5天，獲取胎盤組織置于4%多聚甲醛中固定或低溫凍存。對于LPS誘導流產(chǎn)模型及各實驗組，在E10.5天，計算胚胎吸收率(被吸收的胚胎總數(shù)/著床胚胎的總數(shù))；收集子宮胎盤復合組織, 分離提取單核細胞或凍存待檢測。

3. qPCR檢測子宮、胎盤中Fyn、RORγt mRNA表達：將組織在液氮中進行研磨，以Trizol法抽提總RNA。按照試劑盒說明合成cDNA，并進行PCR反應(yīng)。小鼠Fyn、RORγt及內(nèi)參β-actin引物均由日本Takara公司設(shè)計合成(表1)。

表1 引物序列表

4. 免疫組織化學染色檢測胎盤中Fyn的定位表達：固定的胎盤組織行石蠟包埋、切片，常規(guī)脫蠟，抗原修復。封閉后一抗4℃孵育過夜，生物素標記的二抗4℃孵育50min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、復染、脫水干燥、透明后封片。顯微鏡下棕黃色部分為陽性表達。

5. Western blot檢測胎盤中Fyn蛋白表達水平：組織裂解后提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。采用10%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，一抗孵育4 ℃過夜。漂洗后，熒光二抗室溫封閉1h。置于Odyssey Classic近紅外雙色激光成像系統(tǒng)中掃描并分析。

6. 流式細胞學檢測母胎界面Th17細胞和Treg細胞：將子宮胎盤復合組織置于200目尼龍網(wǎng)上研磨，收集過濾后的組織溶液，采用Ficoll細胞分離液分離提取單核細胞。加入PRMI 1640培養(yǎng)液重懸細胞并分裝，加入不同熒光標記的抗體進行膜表面標記，破膜，加入CD16/32抗體阻斷非特異染色，選擇性加入PE標記的IL-17A/FOXP3抗體，離心、重懸細胞后置于FACS Calibur流式細胞儀(美國BD生物科學公司)中檢測。

7.統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、Fyn在妊娠小鼠不同階段母胎界面的表達研究

qPCR結(jié)果顯示子宮胎盤組織中Fyn mRNA的含量在妊娠過程中呈動態(tài)變化，E4.5天最高，著床后則明顯下降至非妊娠期水平以下，妊娠中期最低，妊娠晚期略有回升。此外，妊娠過程中Fyn與RORγt mRNA的表達呈正相關(guān)(圖1)。

圖1 Fyn在小鼠妊娠不同階段的表達特點

二、Fyn在自然流產(chǎn)和正常妊娠小鼠母胎界面中的表達差異

根據(jù)子宮胎盤復合組織的結(jié)構(gòu)特點，將其可分為子宮系膜淋巴聚集區(qū)、蛻膜區(qū)、交界區(qū)和迷路區(qū)。免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)yn的表達在兩組中均主要見于系膜淋巴聚集區(qū)的淋巴細胞，同時偶見于迷路區(qū)的滋養(yǎng)細胞。并且，自然流產(chǎn)組可見更多的淋巴細胞浸潤與Fyn陽性表達(圖2)。定量研究顯示，與正常妊娠組相比，F(xiàn)yn mRNA和蛋白水平在自然流產(chǎn)組均有不同程度的升高。其中，qPCR結(jié)果顯示自然流產(chǎn)組Fyn mRNA水平明顯高于正常妊娠組，差異具有統(tǒng)計學意義(圖3)。

圖2 Fyn在小鼠母胎界面的免疫組織化學染色結(jié)果

圖3 Fyn在自然流產(chǎn)和正常妊娠小鼠母胎界面的表達差異

三、Fyn在LPS誘導的小鼠流產(chǎn)模型中的作用研究

1. 各組小鼠胚胎吸收率的統(tǒng)計差異：腹腔注射LPS成功構(gòu)建了同種異系小鼠流產(chǎn)模型，LPS處理組的流產(chǎn)率高達65.2%。20 μg SU6656可有效逆轉(zhuǎn)LPS引起的胚胎吸收，使胚胎吸收率下降至 22.7%，盡管該值仍然高于未使用藥物處理的對照組(6.6%)。而5μg SU6656組的胚胎吸收率仍高達71.4%，與LPS處理組比較差異無統(tǒng)計學意義，且明顯高于20 μg SU6656組和對照組。

2. 各組妊娠小鼠母胎界面IL-17、RORγt、TNF-α和IFN-γ mRNA表達差異：LPS組中IL-17、RORγt和TNF-α mRNA水平均明顯高于20 μg SU6656組。LPS組IFN-γ mRNA表達水平雖有輕微上升，但與其余組比較差異無統(tǒng)計學意義(圖4)。

圖4 各組妊娠小鼠母胎界面IL-17、RORγt、TNF-α和IFN-γ mRNA表達差異

3. 各組妊娠小鼠母胎界面Th17/Treg 細胞免疫模式比較：正常妊娠小鼠母胎界面上Th17細胞含量較低，使用LPS處理小鼠后明顯升高；SU6656則可抑制LPS引起的Th17細胞比例的增加，使其下降至接近正常水平。Treg細胞比例在三組間差異均無統(tǒng)計學意義。Th17/Treg細胞的比值則同樣于LPS處理后大幅升高，加入SU6656后明顯下降，但是仍高于對照組(圖5)。

圖5 各組妊娠小鼠母胎界面Th17/Treg細胞免疫模式

討 論

哺乳動物妊娠過程中，母體呈現(xiàn)出特殊的免疫狀態(tài)，一方面要忍受異體的胎兒在體內(nèi)的生長，另一方面要抵抗可能危害到母體自身或胎兒的感染。免疫激活和耐受間任何一點微小的失衡均可能危及胎兒的生存。胎兒因攜帶父源性的白細胞組織相容性抗原(human leukocyte antigen, HLA)而具有半抗原性，其如何逃避母體的免疫排斥目前仍不完全清楚[5]。胎兒所攜帶的同種異體抗原可被母體的抗原呈遞細胞識別并呈遞給特定的CD4+T細胞。CD4+T細胞受到抗原刺激后可分化為Th1、Th2、Th17和Treg細胞。Th17細胞可選擇性地分泌IL-17，在誘導炎癥反應(yīng)和免疫排斥中具有重要作用，參與母胎界面局部的免疫調(diào)控，并可能介導流產(chǎn)的發(fā)生[6]。

Fyn可調(diào)節(jié)細胞的生長、存活、粘附活動等[7, 8]，在多項生理過程中發(fā)揮重要作用，并參與多項生殖活動，包括卵子的發(fā)育和成熟[9]、精子發(fā)生和頂體反應(yīng)[10]等。值得注意的是，F(xiàn)yn幾乎參與了T淋巴細胞發(fā)育和功能分化的所有階段。但是，目前Fyn對Th細胞的作用仍所知甚少。雖然其可能對Th1和Th2細胞無明顯作用，卻可影響Th17細胞的分化和功能[11]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，母胎界面Fyn的表達與Th17細胞的分化有關(guān)。在妊娠的大部分階段，F(xiàn)yn處于低表達水平，與Th17細胞的抑制狀態(tài)一致。低水平的Fyn有利于抑制Th17細胞的分化和功能，維持妊娠免疫耐受。妊娠4.5天，F(xiàn)yn的表達達到高峰，說明高水平的Fyn可能有利于胚胎著床。Fyn與RORγt表達水平呈正相關(guān)，進一步提示Fyn可能調(diào)控RORγt的表達促進Th17細胞的分化。

妊娠過程中免疫失衡可導致自然流產(chǎn)的發(fā)生。大量研究證據(jù)表明，Th17細胞數(shù)量和功能的失衡是流產(chǎn)發(fā)生的重要因素[6, 12]。Qian[13]等人的研究即發(fā)現(xiàn)，Th17細胞在原因不明性復發(fā)性流產(chǎn)患者母胎界面的數(shù)量明顯高于正常妊娠者。我們對小鼠模型的研究結(jié)果顯示Fyn的mRNA和蛋白表達水平在自然流產(chǎn)模型小鼠母胎界面高于正常妊娠模型小鼠，這可能也與Fyn在Th17細胞分化和功能中的作用有關(guān)。

為了進一步研究Fyn在母胎免疫中的作用，我們對LPS誘導的流產(chǎn)模型小鼠進行了Fyn活性抑制劑干預實驗。LPS誘導下的小鼠流產(chǎn)模型被認為是一種可用于研究炎癥、免疫狀態(tài)與自然流產(chǎn)的有效動物模型。在本研究中，僅在妊娠的第7.5天腹腔注射一次2.5 μg的LPS即可引起小鼠大范圍流產(chǎn)，胚胎吸收率高達65.2%。Fyn與LPS存在多方面的功能共同點。Panicker等人的研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激下，F(xiàn)yn迅速活化，繼而參與促炎性信號傳導通路的調(diào)控[14]。本部分實驗結(jié)果顯示Fyn同樣在LPS介導的小鼠流產(chǎn)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，一旦Fyn的活性被充分抑制，LPS則不能有效誘發(fā)小鼠流產(chǎn)。此外，充分抑制Fyn的活性可同時下調(diào)LPS引發(fā)的小鼠母胎界面IL-17和RORγt的異常高表達。IL-17和RORγt的表達變化提示Th17細胞功能和增殖分化水平的改變，被認為與流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)[15,16]。同時，流式細胞學檢測結(jié)果直接顯示，Th17細胞的占比和Th17/Treg細胞比值在LPS作用下大幅升高，經(jīng)SU6656處理后則可下降至接近正常狀態(tài)。因此，抑制Fyn的活性可通過對母胎界面Th17細胞的調(diào)控防止自然流產(chǎn)的發(fā)生。

Treg細胞是CD4+T細胞中的另一亞型，與Th17細胞具有相反的功能，可抑制炎癥因子的分泌，進而防止母體對胚胎/胎兒的免疫排斥，Th17/Treg細胞間的平衡模式對母胎免疫耐受和流產(chǎn)的發(fā)生十分重要。但是，本研究中，LPS的作用并未導致Treg細胞數(shù)量的異常變化，可能是通過其他信號通路得到了代償性的維持。此外，有研究指出，Treg細胞主要在胚胎著床和早期妊娠階段發(fā)揮重要作用，對于后期妊娠的維持并不是必需的[17]。

與既往研究一致，我們在LPS誘導的流產(chǎn)小鼠的母胎界面上檢測到一系列細胞因子的異常表達，除IL-17和RORγt外，還包括TNF-α和IFN-γ。TNF-α和IFN-γ作為與妊娠相關(guān)的促炎性細胞因子，參與誘導流產(chǎn)的發(fā)生[18,19]。我們的研究發(fā)現(xiàn)SU6656可抑制LPS誘發(fā)的TNF-α表達升高；在不同實驗組間雖未檢測到IFN-γ表達水平的統(tǒng)計學差異，但是LPS組IFN-γ表達水平有升高趨勢，SU6656處理組IFN-γ表達水平甚至低于正常組，所以仍然不能排除LPS和SU6656對IFN-γ表達的調(diào)控作用?？傊琒U6656抑制LPS引發(fā)的TNF-α和IFN-γ的異常高表達，提示Fyn參與了兩者的表達調(diào)控。TNF-α和IFN-γ的表達還可體現(xiàn)多種免疫細胞的狀態(tài)，包括巨噬細胞、自然殺傷細胞和Th1細胞等。既往報道指出，F(xiàn)yn同樣可調(diào)控巨噬細胞、自然殺傷細胞、Th2細胞等的分布和分化[2,19,20]。因此，F(xiàn)yn不僅通過Th17細胞參與自然流產(chǎn)的發(fā)生，巨噬細胞、自然殺傷細胞和Th1細胞等也可能直接或間接參與其中。

綜上所述，本研究首次在母胎界面檢測到了Fyn的表達，并發(fā)現(xiàn)其主要通過影響Th17細胞的增殖分化和功能，參與母胎免疫調(diào)控和自然流產(chǎn)的發(fā)生，具體機制及Fyn對母胎界面其他免疫細胞的影響尚需進一步研究。