陳朝林，韓佃剛，楊云慶，張 沖，李 靜，羅倩敏，尹尚蓮，董仙蘭，李凌楓，師亞玲，艾 軍，信吉閣

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，昆明 650201；2.中華人民共和國(guó)昆明海關(guān)，昆明 650228）

藍(lán)舌?。˙luetongue，BT）是由呼腸孤科（Reoviridae）環(huán)狀病毒屬（Obivirus）藍(lán)舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）引起的［1］，經(jīng)由庫(kù)朦屬吸血昆蟲(chóng)叮咬傳播反芻動(dòng)物、駱駝科動(dòng)物的病毒性疫病，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的必須通報(bào)的動(dòng)物疫?。?］。BTV 基因組由10 個(gè)雙鏈RNA 組成，包括大片段（L1-L3）、中片段（M4-M6）和小片段（S7-S10），共編碼7 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（VP1-VP7）和4 種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2、NS3、NS3a 和NS4）［3］。VP7 是由S7 基因編碼的主要結(jié)構(gòu)蛋白，由349 個(gè)氨基酸組成，位于病毒核衣殼的表面，呈三聚體結(jié)構(gòu)，約占核心蛋白總量的36%，是BTV 群特異性抗原蛋白之一，不同血清型之間的VP7 蛋白的同源性高達(dá)94%，通過(guò)對(duì)不同血清型VP7 蛋白的氨基酸序列比對(duì)得出，30～48 位氨基酸殘基的序列同源性為100%，證明VP7 蛋白為高度保守的蛋白，具有群特異性，是BTV 抗體檢測(cè)的理想抗原［4-7］。VP7 蛋白是血清群特異性的主要決定因素，大多數(shù)檢測(cè)BTV 的血清學(xué)檢測(cè)方法都是基于檢測(cè)抗VP7 抗體［8］。

昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是將外源目的基因插入桿狀病毒載體中，轉(zhuǎn)染入昆蟲(chóng)細(xì)胞中對(duì)單個(gè)蛋白或者蛋白復(fù)合體進(jìn)行高量表達(dá)的真核表達(dá)系統(tǒng)［9］。昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的重組蛋白具有完整的生物學(xué)活性，適合生產(chǎn)和研發(fā)治療性抗體。目前已經(jīng)利用High Five 細(xì)胞、Sf9 細(xì)胞成功表達(dá)出商業(yè)化的人抗gp41 抗體3D6［10］。

課題組前期開(kāi)發(fā)出基于昆蟲(chóng)重組桿狀病毒表達(dá)BTV VP7 蛋白的藍(lán)舌病ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒。為了優(yōu)化試劑盒生產(chǎn)工藝，進(jìn)一步獲得高表達(dá)量的BTV VP7 蛋白，本研究開(kāi)展了貼壁培養(yǎng)和搖瓶懸浮培養(yǎng)對(duì)昆蟲(chóng)細(xì)胞中BTV VP7 蛋白表達(dá)量影響的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

Sf9 昆蟲(chóng)細(xì)胞、表達(dá)BTV VP7 蛋白的重組桿狀病毒Vbacmin-BTV-VP7、藍(lán)舌病B-ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒（內(nèi)含HRP 標(biāo)記的BTV VP7 單克隆抗體、ELISA板、pH 9.6 碳 酸 鹽 包 被 液、TMB 顯 色 液、1 mol/L H2SO4終止液、PBST 洗液）由昆明海關(guān)技術(shù)中心動(dòng)物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室提供；胎牛血清購(gòu)自Biological Industries（BI）公司；Grace’s培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Sf9 細(xì)胞用含10%胎牛血清的Grace’s 培養(yǎng)基在27 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞感染重組桿狀病毒Vbacmin-BTV-VP7

1）待細(xì)胞長(zhǎng)滿75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶后，將2 瓶細(xì)胞換液，每瓶加入20 mL Grace’s 培養(yǎng)基，將細(xì)胞吹打下來(lái)，混合到一起，細(xì)胞計(jì)數(shù)得7.7×105CFU/mL。

2）將40 mL 含細(xì)胞的培養(yǎng)液平均分到1 個(gè)175 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶和1 個(gè)500 mL 搖瓶中，各加入8 mL含有重組桿狀病毒Vbacmin-BTV-VP7 的種子病毒貯存液，然后用含有2%胎牛血清的Grace’s 培養(yǎng)基調(diào)節(jié)總體積至每瓶80 mL。175 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入27 ℃培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)，搖瓶放入27 ℃搖床中懸浮培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為60 r/min。培養(yǎng)5 d。

1.4 Sf9 細(xì)胞形態(tài)觀察及BTV VP7 蛋白表達(dá)量測(cè)定

培養(yǎng)第一至第五天，每天分別用顯微鏡觀察并拍照記錄兩種培養(yǎng)條件下Sf9 細(xì)胞的形態(tài)變化，無(wú)菌條件下分別從細(xì)胞培養(yǎng)瓶和搖瓶中吸取500 μL細(xì)胞培養(yǎng)基，裝于1.5 mL 的離心管中，用間接ELISA方法檢測(cè)BTV VP7 蛋白表達(dá)量。簡(jiǎn)述如下：取不同方式培養(yǎng)的病毒液，用pH 9.6 碳酸鹽包被液1∶10 稀釋，每孔100 μL 包被ELISA 板，37 ℃作用1 h，洗板3次，將洗滌液拍干。每孔加100 μL 固定濃度HRP 標(biāo)記的BTV VP7 單克隆抗體，37 ℃作用1 h，洗板3 次，將洗滌液拍干，TMB 顯色，1 mol/L H2SO4終止顯色，讀取450 nm 吸光度值（OD450nm）。根據(jù)OD450nm判定表達(dá)蛋白的含量，OD450nm大小與表達(dá)蛋白含量成正比，OD450nm越高間接反映蛋白表達(dá)量越高。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。用Excel軟件制作折線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞形態(tài)變化

由圖1 和圖2 可見(jiàn)，昆蟲(chóng)細(xì)胞在轉(zhuǎn)染病毒的第一天，細(xì)胞形態(tài)為大小均勻的圓形，細(xì)胞透亮，折光性好，細(xì)胞數(shù)量較多。貼壁培養(yǎng)和搖瓶懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞隨著B(niǎo)TV VP7 蛋白在細(xì)胞內(nèi)的增殖，細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始逐漸變化，一些細(xì)胞變大，出現(xiàn)細(xì)胞大小不均勻、細(xì)胞折光性變差的現(xiàn)象。第四天，細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始明顯減少，顯微鏡下可見(jiàn)具有完整細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞數(shù)量變少，出現(xiàn)很多細(xì)胞碎片。第五天，貼壁培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)的瓶?jī)?nèi)只存在極少數(shù)的圓形細(xì)胞，其他均為非細(xì)胞形態(tài)的碎片。

圖2 貼壁培養(yǎng)第一至第五天昆蟲(chóng)細(xì)胞形態(tài)對(duì)比（顯微鏡倍數(shù)20 倍）

2.2 BTV VP7 蛋白表達(dá)量測(cè)定

表1 為記錄第一天到第五天從細(xì)胞搖瓶中吸取的樣品測(cè)得的吸光度值。運(yùn)用SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析可知，初始濃度與第一、二天相比，差異顯著（P＜0.05）；第三天與第一、二、四、五天相比，差異顯著（P＜0.05）；第二、四、五天之間相比，差異不顯著（P＞0.05）。

表1 搖瓶培養(yǎng)重組桿狀病毒不同時(shí)間點(diǎn)BTV VP7蛋白含量（OD450 nm）

表2 為記錄第一天到第五天從貼壁培養(yǎng)瓶中吸取的樣品測(cè)得的吸光度值。第一、二、四、五天與初始濃度相比差異顯著（P＜0.05），第一、二、四、五天之間差異不顯著（P＞0.05），第三天和其他天數(shù)相比差異均顯著（P＜0.05）。

表2 貼壁培養(yǎng)重組桿狀病毒不同時(shí)間點(diǎn)BTV VP7蛋白含量（OD450 nm）

BTV VP7 蛋白表達(dá)量動(dòng)態(tài)折線圖見(jiàn)圖3。由圖3 可知，BTV VP7 蛋白表達(dá)量從第一天到第三天處于增長(zhǎng)期，從第二天到第三天BTV VP7 蛋白表達(dá)量顯著上升，從第三天到第四天BTV VP7 蛋白表達(dá)量下降迅速，第四天到第五天蛋白表達(dá)量變化微小。培養(yǎng)至第三天時(shí)貼壁培養(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞中BTV VP7蛋白表達(dá)量明顯高于搖瓶培養(yǎng)的蛋白表達(dá)量。

圖3 BTV VP7 蛋白表達(dá)量動(dòng)態(tài)

3 小結(jié)與討論

BTV VP7 蛋白在貼壁培養(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)量高于搖瓶培養(yǎng)，且培養(yǎng)到第三天時(shí)BTV VP7 蛋白表達(dá)量最高。

藍(lán)舌病是一種嚴(yán)重危害綿羊養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的疫病。綿羊不分品種、性別和年齡都對(duì)藍(lán)舌病毒易感。病毒感染對(duì)羔羊的影響尤為明顯，如生長(zhǎng)發(fā)育遲滯，甚至引起死亡；母羊感染會(huì)導(dǎo)致胎兒畸形等嚴(yán)重后果［11］。2019 年，有學(xué)者從污染疫苗批次中分離出一株新BTV 毒株，經(jīng)鑒定為血清28 型藍(lán)舌病病毒［12］。同年在很多國(guó)家和地區(qū)發(fā)生血清3 型藍(lán)舌病、血清4 型藍(lán)舌病、血清8 型藍(lán)舌病，總受影響動(dòng)物14 萬(wàn)只，感染動(dòng)物2 800 只，死亡300 只。藍(lán)舌病病毒抵抗力較強(qiáng)，具有多個(gè)血清型，且各型之間交叉免疫性差，故只有制成多價(jià)疫苗，才能獲得可靠的保護(hù)作用［13］。為了控制BTV 的傳播，將經(jīng)濟(jì)損失降到最低，開(kāi)展藍(lán)舌病疫苗研究、血清抗體監(jiān)測(cè)是一項(xiàng)非常重要的工作。

ELISA 是最常用的血清學(xué)檢測(cè)方法，20 世紀(jì)80年代國(guó)外已先后報(bào)道了BTV間接ELISA、阻斷ELISA、競(jìng)爭(zhēng)性ELISA 檢測(cè)方法的建立［14］。本研究將重組桿狀病毒在昆蟲(chóng)細(xì)胞上產(chǎn)生的BTV VP7 蛋白包被到ELISA 板上，利用固定濃度HRP 標(biāo)記BTV VP7 單抗，采用間接ELISA 法評(píng)估BTV VP7 蛋白的表達(dá)量。結(jié)果表明，昆蟲(chóng)細(xì)胞在貼壁培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)兩種培養(yǎng)條件下均在第三天時(shí)BTV VP7 蛋白表達(dá)量最高。從細(xì)胞形態(tài)變化可以看出第四到五天細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞碎片增加。BTV VP7 在第一天到第二天侵染細(xì)胞、增殖、分泌蛋白，第三天細(xì)胞破碎，釋放出大量蛋白，因此第三天的蛋白表達(dá)量明顯增多，而第四天和第五天，由于大部分細(xì)胞已破碎，BTV VP7 蛋白表達(dá)量不再繼續(xù)升高。此外，BTV VP7 蛋白表達(dá)量下降，可能是由于某些原因?qū)е翨TV VP7 蛋白降解所致，具體降解原因有待進(jìn)一步研究。貼壁培養(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞中BTV VP7 蛋白表達(dá)量更高，可能是由于貼壁培養(yǎng)單位體積提供細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積大，細(xì)胞密度更高，而搖瓶培養(yǎng)單位體積提供細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積小，細(xì)胞生長(zhǎng)密度低。本試驗(yàn)結(jié)果可為優(yōu)化昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)BTV VP7 蛋白的培養(yǎng)條件提供參考。