T淋巴細(xì)胞亞群相關(guān)細(xì)胞因子與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病的相關(guān)性及機(jī)制研究①

于曉東 賀寶軍 劉羽璇霖 單 良 高 亮 田 晶 （錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，錦州121000）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種炎癥性和多系統(tǒng)性自身免疫病，其臨床特征是多器官系統(tǒng)的進(jìn)行性累及，交替出現(xiàn)臨床加重期和緩解期［1-2］。SLE 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，涉及免疫系統(tǒng)的各個(gè)方面，如B、T 淋巴細(xì)胞不可控的自身反應(yīng)性，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生針對自身抗原的抗體，免疫復(fù)合物大量沉積及隨后的中性粒細(xì)胞浸潤、免疫復(fù)合物和凋亡細(xì)胞清除能力降低及多種免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的因子缺陷對SLE器官炎癥和組織損傷至關(guān)重要［3-5］。

研究表明SLE表現(xiàn)為Th1亞群功能下降，Th2亞群功能亢進(jìn)，導(dǎo)致B 細(xì)胞過度活化產(chǎn)生自身抗體。Th2 亞群的促炎細(xì)胞因子IL-6 能促進(jìn)淋巴細(xì)胞和髓細(xì)胞的分化和激活，誘導(dǎo)急性期蛋白產(chǎn)生［6］。在SLE 中，自身反應(yīng)性T 細(xì)胞克隆會(huì)產(chǎn)生大量IL-6，從而促進(jìn)B細(xì)胞活化和自身抗體產(chǎn)生。新近研究提出CD4+T 淋巴細(xì)胞譜系Th17 亞群在自身免疫的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并在SLE 的發(fā)展中具有致病作用。Th17 產(chǎn)生的IL-17 是一種多效性促炎細(xì)胞因子，與牛皮癬、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病和全身性硬化病等炎癥和自身免疫病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)［7-9］。本研究通過分析Th1、Th2、Th17 相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)及其與疾病活動(dòng)程度的相關(guān)性，運(yùn)用全蛋白Labelfree 定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選顯著差異蛋白，通過富集聚類分析，尋找與T 淋巴細(xì)胞亞群分化相關(guān)的差異蛋白，為研究SLE的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制、診斷治療提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 本研究共有97 例對象參與，其中67 例為SLE 患者，為2019 年1 月至2020 年12 月錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科收治的門診及住院患者。所有SLE患者診斷均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）2019 年標(biāo)準(zhǔn)。年齡、性別與之相匹配的30 例健康對照者來自健康體檢人員，且不符合SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)中的任意一項(xiàng)。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑與儀器 人Th1/Th2/Th17 亞群檢測試劑盒（流式熒光法）購自江西賽基生物有限公司；抗核抗體IgG 檢測試劑盒（間接免疫熒光法）購自杭州醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司；淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑盒（流式細(xì)胞儀法-6色）購自碧迪醫(yī)療器械上海有限公司；BD VacutainerTM血樣采集管和TrucountTM絕對計(jì)數(shù)管購自美國BD 公司；全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀和離心機(jī)購自美國貝克曼庫爾特有限公司；流式細(xì)胞儀FACS CantoⅡ購自美國BD 公司；Q Exac?tiveTMHF-X質(zhì)譜購自美國賽默飛公司。

1.2 方法

1.2.1 血漿ANA 熒光染色 使用EDTA 抗凝管無菌采集靜脈血5 ml，2 000 r/min 離心20 min，取血漿進(jìn)行ANA 染色。取30 μl 樣本至加樣板的反應(yīng)區(qū)，蓋上生物薄片，室溫孵育30 min，PBS 沖洗，緩沖液浸泡10 min，每個(gè)反應(yīng)區(qū)加FITC 標(biāo)記的二抗30 μl，室溫孵育30 min，PBS 沖洗，緩沖液浸泡10 min，取出玻片，熒光顯微鏡下觀察核型。

1.2.2 CD4+T、CD8+T、NK 和B 細(xì)胞亞群檢測 使用BD VacutainerTM采血管無菌采集靜脈血5 ml，取淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑20 μl至BD Trucount絕對計(jì)數(shù)管內(nèi)，用反向移液技術(shù)吸取抗凝全血50 μl，加入至BD Trucount 絕對計(jì)數(shù)管，輕柔混均，室溫（20～25 ℃）避光孵育15 min，取450 μl BD FACS（1×）溶血素加入管中，輕柔混均，室溫（20～25 ℃）避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3 Th1、Th2 和Th17 相關(guān)細(xì)胞因子檢測 準(zhǔn)備血漿樣本0.5 ml。配制標(biāo)準(zhǔn)品：取標(biāo)準(zhǔn)品管原液300 μl 至300 μl 樣品稀釋液中，混勻，標(biāo)記1：2 管，從1：2 管中取液300 μl 至300 μl 樣品稀釋液中，混勻，標(biāo)記1：4管，如此倍比稀釋至1：512。標(biāo)本染色：捕獲微球混合液（A）1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入與上清液等體積的微球緩沖液（H），混勻，避光孵育30 min；混勻，每管添加25 μl捕獲微球液；樣品管加25 μl 待測血漿樣本；標(biāo)準(zhǔn)品管加入25 μl 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；熒光檢測試劑（C）加至所有管中（25 μl/管），混勻，避光孵育2.5 h，1 ml/管PBS，1 000 r/min 離心5 min，棄上清；每管加入100 μl PBS，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 質(zhì)譜樣本制備及分析 選取SLE 患者和健康對照者血液樣本各12 例進(jìn)行蛋白質(zhì)譜檢測。蛋白提?。簶悠芳尤? 倍體積裂解緩沖液（1%蛋白酶抑制劑）超聲裂解。4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至離心管，BCA 法測定蛋白濃度。胰酶酶解：取等量蛋白樣品酶解，加入二硫蘇糖醇（終濃度5 mmol/L）56 ℃還原30 min；加入碘乙酰胺（終濃度11 mmol/L）避光室溫孵育15 min；加入TEAB稀釋尿素（濃度≥2 mol/L）；加入胰蛋白酶（蛋白酶：蛋白=1：50，m/m）酶解過夜；再按1：100 比例加入胰蛋白酶酶解4 h。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析：肽段用液相色譜流動(dòng)相A相溶解后使用EASY-nLC 1200超高效液相系統(tǒng)分離。肽段注入NSI 離子源中電離，然后進(jìn)入Q ExactiveTMHF-X質(zhì)譜分析；離子源電壓2.1 kV，高分辨Orbitrap 檢測并分析肽段母離子及二級(jí)碎片；一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍400～1 500 m/z，掃描分辨率120 000；二級(jí)質(zhì)譜掃描范圍起點(diǎn)為100 m/z，二級(jí)掃描分辨率15 000。數(shù)據(jù)采集模式使用數(shù)據(jù)依賴型掃描（DDA）程序；二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Maxquant（v1.6.15.0）進(jìn)行檢索。差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO 分類、KEGG 通路和蛋白結(jié)構(gòu)域3 個(gè)層面的富集分析以尋找差異蛋白是否在某些功能類型中具有顯著性富集趨勢。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS22.0 和Graph?Pad Prism 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，定量資料以±s 表示。兩樣本間比較采用t 檢驗(yàn)，多組樣本間比較采用單因素方差分析。正態(tài)分布資料的相關(guān)性采用Pear?son 相關(guān)分析，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Spear?man 等級(jí)相關(guān)分析。采用ROC 曲線評價(jià)細(xì)胞因子水平對SLE 活動(dòng)程度的預(yù)測價(jià)值。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況分析 與HC 組相比，SLE 組性別構(gòu)成比、年齡和補(bǔ)體C4 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。SLE組補(bǔ)體C3水平較HC組有小幅降低（P＜0.05），SLE 組CRP、ESR、ANA、anti-dsDNA 和SLE?DAI-2k score較HC組均有顯著提高（P＜0.01，表1）。

表1 SLE患者臨床指標(biāo)比較s）Tab.1 Comparison of clinical indicators in SLE patients（s）

表1 SLE患者臨床指標(biāo)比較s）Tab.1 Comparison of clinical indicators in SLE patients（s）

Note：Compared with HC group，1）P＜0.05，2）P＜0.01.

2.2 SLE 患者CD4+T/CD8+T、NK 和B 細(xì)胞水平 與HC 組相比，SLE 組CD4+T/CD8+T 及NK 細(xì)胞比例呈降低趨勢（P＜0.05），B細(xì)胞比例有小幅升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 CD4+T/CD8+T、NK、B細(xì)胞水平Fig.1 Levels of CD4+T/CD8+T，NK and B cells

2.3 SLE 患 者Th1、Th2 和Th17 相 關(guān) 細(xì) 胞 因 子 水平 與HC 組相比，SLE 組Th1 亞群TNF-α、IFN-γ，Th2 亞群IL-4、IL-6、IL-10，Th17 亞群IL-17 水平均有不同程度升高（P＜0.05 或P＜0.01），IL-2 呈上升趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 Th1、Th2和Th17相關(guān)細(xì)胞因子水平Fig.2 Levels of Th1，Th2 and Th17 related cytokines

2.4 SLE 患 者 血 清IL-6、IL-17 與anti-dsDNA 和SLEDAI-2k score的相關(guān)性分析 SLE患者血清IL-6、IL-17水平與anti-dsDNA 水平呈正相關(guān)（r=0.313，P=0.009 9；r=0.386，P=0.001 3）；IL-6、IL-17 水平與SLEDAI-2k score 均呈正相關(guān)（r=0.448，P=0.000 1；r=0.407，P=0.005 3），見圖3。

圖3 IL-6、IL-17 與抗dsDNA 抗體和SLEDAI-2k score 的相關(guān)性Fig.3 Correlation between IL-6，IL-17 and anti-dsDNA antibody and SLEDAI-2k score

2.5 蛋白質(zhì)譜結(jié)果分析 以蛋白質(zhì)多次重復(fù)樣本中相對定量值均值之比為差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C），并計(jì)算兩組樣本間各蛋白FC，發(fā)現(xiàn)SLE 組較HC 組有84 個(gè)上調(diào)蛋白，92 個(gè)下調(diào)蛋白（圖4、圖5）。進(jìn)一步篩選上、下調(diào)FC≥2倍的差異蛋白，總數(shù)31個(gè)，其中上調(diào)蛋白18個(gè)，下調(diào)蛋白13個(gè)（表2、表3）。

表2 SLE組較HC組上調(diào)的差異蛋白Tab.2 Up-regulated proteins in SLE group compared to HC group

表3 SLE組較比HC組下調(diào)的差異蛋白Tab.3 Down-regulated proteins in SLE group compared to HC group

圖4 差異蛋白統(tǒng)計(jì)圖Fig.4 Statistical graph of differential proteins

圖5 差異蛋白火山圖Fig.5 Volcano graph of differential proteins

以氣泡圖展現(xiàn)差異表達(dá)蛋白顯著富集（Pvalue＜0.05）的功能分類和通路，見圖6。富集分析得到的KEGG 通路通過網(wǎng)頁形式進(jìn)行可視化展示，結(jié)果顯示SLE 組較HC 組T 細(xì)胞亞群分化相關(guān)的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，CaN）、活化T 細(xì)胞核因子（nu?clear factor of activated T cells，NFAT）、分裂原激活的蛋白激酶p38 (mitogen activated protein kinases p38,MAPK p38）和信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6（signal transducers and activators of transcription，STAT6）表達(dá)升高，見附圖1（www.immune99.com）。

圖6 KEGG富集圖Fig.6 Enrichment map of KEGG

3 討論

SLE 是以免疫耐受性下降、過度炎癥反應(yīng)和組織損傷為特征的自身免疫病。CD4+T 細(xì)胞Th1、Th2和Th17 亞群細(xì)胞因子水平的失調(diào)與自身免疫性炎癥有關(guān)，相關(guān)因子可作為評估疾病活動(dòng)和嚴(yán)重程度的 生 物 標(biāo) 志 物［10］。Th1 產(chǎn) 生 的Th1 型 細(xì) 胞 因 子TNF-α、IFN-γ等參與細(xì)胞介導(dǎo)的胞內(nèi)細(xì)菌和病毒的清除；Th2 產(chǎn)生的Th2 型細(xì)胞因子IL-4、IL-6 等可增強(qiáng)針對胞外細(xì)菌、寄生蟲、毒素和過敏原的體液免疫；Th17 型細(xì)胞因子保護(hù)宿主免受諸如真菌和細(xì)菌等細(xì)胞外微生物的侵害［11］。研究表明T細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受損可導(dǎo)致自身免疫，現(xiàn)已成為SLE 致病性的關(guān)鍵因素之一［12］。本研究檢測SLE 患者Th1、Th2 和Th17 亞群細(xì)胞因子水平，以及異常高表達(dá)的細(xì)胞因子與疾病活動(dòng)程度的相關(guān)性，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)篩選差異蛋白，生物信息學(xué)分析T 淋巴細(xì)胞亞群分化相關(guān)的差異蛋白，探討SLE 發(fā)生發(fā)展的免疫學(xué)機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示SLE患者CRP、ESR、anti-dsDNA和ANA 較正常組均有不同程度升高，急性時(shí)相反應(yīng)蛋白CRP 和重要炎癥指標(biāo)ESR 的升高提示疾病活動(dòng)期可能伴發(fā)感染或組織損傷，血清anti-dsDNA 和ANA 屬于IgG 型抗體，其水平升高提示B 細(xì)胞過度活化產(chǎn)生高滴度抗自身DNA 和細(xì)胞核組分的抗體，針對性攻擊自身組織，造成組織和器官損傷。SLE組CD4+/CD8+T 和NK 細(xì)胞比例呈降低趨勢。CD4+T細(xì)胞是反映免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)，CD8+T 屬于免疫抑制細(xì)胞，通過分泌抑制因子達(dá)到免疫抑制作用。CD4+/CD8+T 降低提示機(jī)體處于抑制或免疫功能低下狀態(tài)。NK 細(xì)胞作為固有免疫的殺傷細(xì)胞，其失衡是導(dǎo)致自身免疫病發(fā)病的重要機(jī)制［13］。T 細(xì)胞亞群相關(guān)細(xì)胞因子流式檢測結(jié)果顯示，SLE 患者Th1亞群TNF-α、IFN-γ，Th2 亞群IL-4、IL-6、IL-10，Th17亞群IL-17水平均顯著升高，提示SLE患者出現(xiàn)體內(nèi)T 淋巴細(xì)胞亞群的分化失衡。對高差異性表達(dá)的IL-6 和IL-17 進(jìn)行進(jìn)一步的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，IL-6 水平與IL-17、anti-dsDNA 呈正相關(guān)，IL-17 水平與antidsDNA 呈正相關(guān)。IL-6 促進(jìn)Th17 細(xì)胞分化并分泌IL-17，同時(shí)IL-17會(huì)上調(diào)IL-6產(chǎn)生，Th17細(xì)胞途徑與IL-6 之間存在正反饋回路。血清IL-6、IL-17、antidsDNA、ANA 與SLEDAI-2k score 均呈正相關(guān)，表明IL-6、IL-17、anti-dsDNA、ANA 水平越高，SLE 疾病活躍程度越強(qiáng)，病情越惡化。對蛋白質(zhì)譜顯著差異蛋白進(jìn)行KEGG 富集聚類分析，發(fā)現(xiàn)SLE 組T 細(xì)胞亞群分化相關(guān)的CaN、NFAT、p38 和STAT6 表達(dá)升高。CaN 激活后使靶蛋白NFAT 脫磷酸化，NFAT 在免疫反應(yīng)中對誘導(dǎo)T 細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮重要作用。PARK 等［14］報(bào)道Ca2+介導(dǎo)的CaN-NFAT 通路失調(diào)影響T、B 淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答，在自身免疫病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。p38 MAPK 信號(hào)通路通過介導(dǎo)T 細(xì)胞的激活和分化參與自身免疫病的發(fā)生［15］。STAT 家族蛋白在自身免疫病EAE 傳遞Th1 和Th17 細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)中具有重要作用［16］。

綜上所述，SLE 存在T 淋巴細(xì)胞亞群的分化失衡，T 細(xì)胞亞群細(xì)胞因子IL-6 和IL-17 的過度表達(dá)及高水平anti-dsDNA的產(chǎn)生在SLE疾病的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。血清IL-17、IL-6 和anti-dsDNA 水平有望成為SLE 疾病活動(dòng)期的生物標(biāo)志物。T 細(xì)胞亞群分化相關(guān)的CaN、NFAT、p38 和STAT6 參與疾病的發(fā)生，為研究SLE免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制、診斷治療提供數(shù)據(jù)支持。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將擴(kuò)大樣本量評價(jià)差異蛋白是否能成為SLE診斷的標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。