姬海月，胡本祥,2，楊冰月，羅 瑤，顏永剛，彭 亮*

(1 陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院/陜西省秦嶺中草藥應(yīng)用開發(fā)工程技術(shù)研究中心/“秦藥”研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 712046；2 陜西國際商貿(mào)學(xué)院，西安 712046)

鉛為植物非必需重金屬，具有高毒性和持久性，通過污染土壤和水體引發(fā)嚴(yán)重的環(huán)境問題。當(dāng)下，自然環(huán)境因工業(yè)化進(jìn)展迅猛而遭受的污染日益嚴(yán)重，尤其是重金屬鉛的逐漸滲透導(dǎo)致環(huán)境中存在過量的鉛而造成鉛脅迫，隨之影響植物的生長發(fā)育、次生代謝產(chǎn)物積累和產(chǎn)量[1]。大量研究表明，鉛脅迫通過抑制植物細(xì)胞正常生長、酶活性來影響植物組織蛋白質(zhì)合成，破壞細(xì)胞膜通透性，降低呼吸作用和光合作用，最終對(duì)種子萌發(fā)及植物生長發(fā)育造成損害[2]。種子萌發(fā)和幼苗生長是植物生命周期中的兩個(gè)重要階段，最易受到外界環(huán)境因子的干擾，更是直接影響植物后期的生長發(fā)育，因而常用種子的萌發(fā)和幼苗生長狀況作為檢測(cè)植物對(duì)重金屬耐性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[3-5]。蕓苔素(EBL)作為一種新式的植物內(nèi)源激素，系目前公認(rèn)活性最高的安全、廣譜、高能的植物生長激素之一[6]。EBL自身具有優(yōu)良的生長特性，可以通過調(diào)節(jié)植物本身生長所需的多種酶、激素，使植物增長活力、提高作物質(zhì)量、增強(qiáng)抗逆性能力，進(jìn)而達(dá)到促進(jìn)植物自身生長發(fā)展?jié)撃堋⒊浞职l(fā)揮植物的生長功能優(yōu)勢(shì)，并已在促進(jìn)芥菜[7]、茄子[8]、水稻[9]等種子萌發(fā)及幼苗生長方面取得了一系列的研究成果。

遠(yuǎn)志(PolygalatenuifoliaWilld.) 系遠(yuǎn)志科多年生草本植物，其干燥根為中國常用大宗中藥材，具有鎮(zhèn)靜安神、祛痰開竅、解毒消腫等功效[10]。遠(yuǎn)志廣泛分布于中國西北、華北及東北等地區(qū)，對(duì)干旱、鹽等逆境脅迫表現(xiàn)出一定程度的適應(yīng)性，相關(guān)研究多集中于質(zhì)量控制、主要藥用影響因素和藥理作用等方面[11]，鮮見有關(guān)遠(yuǎn)志種子萌發(fā)和幼苗生長對(duì)重金屬脅迫的適應(yīng)能力，以及使用激素緩解脅迫的相關(guān)生理機(jī)制研究。

以2020年《中華人民共和國藥典》中鉛含量的限量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)全國2056份中藥材進(jìn)行鉛含量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)超標(biāo)率為 3.79%，表明中國中藥材鉛超標(biāo)的情況仍存在，且鉛含量水平因種類不同表現(xiàn)出差異性，這與中藥材的產(chǎn)地、品種、用藥部位等方面密切相關(guān)[12]。吳娟娟等[13]對(duì)陜西漢中的藥用植物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)有重金屬輕度污染的情況，其中Pb為主要影響因素。鑒于種植產(chǎn)地中可能存在一定程度的鉛污染，本試驗(yàn)以遠(yuǎn)志為基本材料，通過人工模擬正常鉛污染水平環(huán)境，解析EBL對(duì)遠(yuǎn)志種子萌發(fā)、幼苗生長、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化酶系統(tǒng)等植物體內(nèi)生理生化特性的影響，以期了解遠(yuǎn)志種子及幼苗對(duì)重金屬脅迫的響應(yīng)情況及反應(yīng)機(jī)制，降低重金屬毒害的發(fā)生，同時(shí)探討在保證藥材安全性的基礎(chǔ)上，增強(qiáng)遠(yuǎn)志的重金屬脅迫耐受性，尋找促進(jìn)遠(yuǎn)志植株正常生長的措施。

1 材料和方法

1.1 供試材料

參試的遠(yuǎn)志成熟種子來自于遠(yuǎn)志栽培種植基地(陜西省淳化縣)，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)胡本祥教授鑒定為遠(yuǎn)志(PolygalatenuifoliaWilld.)的干燥成熟種子。

1.2 試劑與儀器

試驗(yàn)試劑蕓苔素購自上海源葉生物科技有限公司(CAS#72962-43-7 HPLC>95% LOT:J20J11H118372)，鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液購自國家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心(GSB 04-1742-2004)，其余所用試劑均為分析純。蛋白質(zhì)定量(A045-2)、總超氧化物歧化酶(A001-1)、過氧化物酶(A084-3-1)、抗壞血酸過氧化物酶(A123-1-1)、過氧化氫(A064-1-1)、脯氨酸(A107-1-1)、植物丙二醛(A003-1)、過氧化氫酶試劑盒(A007-1-1)、96孔板均購自南京建成生物工程研究所，定性濾紙購自天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

試驗(yàn)儀器包括酶標(biāo)儀 A-5082(Tecan Austrla Gmbh Untersbergetr公司)、馬弗爐Sx2-4-10(上海精密儀器有限公司)、石墨爐原子吸收SP-3803AA(上海光譜儀器有限公司)、空心陰極燈(鉛燈，上海光譜儀器有限公司)、高壓滅菌鍋GR60DA(廈門致微儀器有限公司)、水浴鍋(上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司)以及萬分之一電子天平BS110S(德國賽多利斯公司)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

前期多次預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，3 mmol·L-1醋酸鉛(CH3CO2)2Pb可引發(fā)遠(yuǎn)志鉛中度脅迫，種子發(fā)芽率在50%左右，故本試驗(yàn)選擇3 mmol·L-1醋酸鉛來模擬鉛脅迫。同時(shí)，設(shè)置濃度為0、0.0001、0.01、1、100 μmol·L-1的蕓苔素處理，采用預(yù)浸法和混合溶液拌種法兩種形式來評(píng)價(jià)蕓苔素對(duì)鉛脅迫下遠(yuǎn)志種子萌發(fā)及幼苗生長發(fā)育的影響。

1.3.1 預(yù)浸種組選取大小均一的遠(yuǎn)志種子，除去表面絨毛，10%過氧化氫溶液浸泡15 min后用超純水反復(fù)沖洗干凈，隨后置于不同濃度EBL溶液中預(yù)浸種處理12 h。以經(jīng)高壓鍋滅菌處理的培養(yǎng)皿(直徑9 cm，內(nèi)鋪有2層濾紙)為發(fā)芽床，將各濃度EBL預(yù)浸種處理后的種子均勻排布在加有4 mL的3 mmol·L-1醋酸鉛溶液的發(fā)芽床中(分別記為A0、A1、A2、A3、A4)，以純水發(fā)芽床為對(duì)照(CK)，每床30粒，3次重復(fù)。

1.3.2 拌種組在不同濃度EBL溶液中加入醋酸鉛配制成混合溶液，并使醋酸鉛終濃度為3 mmol·L-1，發(fā)芽床同預(yù)浸種組，將已消毒的種子均勻排布在加有上述4 mL混合溶液的發(fā)芽床中(分別記為B0、B1、B2、B3、B4)，以純水發(fā)芽床為對(duì)照(CK)，每床30粒，3次重復(fù)。

1.3.3 培養(yǎng)條件組培室溫度25 ℃、光照時(shí)間12 h/d，每天分別向發(fā)芽床加入適量蒸餾水或相關(guān)溶液以保持原始質(zhì)量，隔天換紙1次。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 種子萌發(fā)指標(biāo)和幼苗干鮮重每天8：00觀察并記錄遠(yuǎn)志種子萌發(fā)情況，發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間為實(shí)驗(yàn)開始到第1顆種子發(fā)芽所需要的天數(shù)，種子發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)為露出1 mm以上的胚根，連續(xù)7 d無萌發(fā)種子視為萌發(fā)結(jié)束。發(fā)芽結(jié)束后，計(jì)算發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間、發(fā)芽持續(xù)時(shí)間、發(fā)芽勢(shì)(第8天)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)；另外，每重復(fù)取10 株幼苗測(cè)量其胚根和胚芽長度，同時(shí)稱取幼苗鮮重，置于65 ℃ 烘干箱干燥至恒重后稱取干重。

1.4.2 幼苗抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量培養(yǎng)14 d后收獲幼苗,取鮮重0.1 g幼苗用于酶活性檢測(cè),每個(gè)指標(biāo)3次重復(fù)。過氧化物酶活性測(cè)定采用比色法，總超氧化物歧化酶活性測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法，過氧化氫酶活性測(cè)定采用鉬酸銨法，丙二醛含量測(cè)定采用TBA法，游離脯氨酸含量的測(cè)定采用酸性茚三酮法，可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法，抗壞血酸過氧化物酶活性、過氧化氫含量采用分光光度法測(cè)定，以上指標(biāo)測(cè)定的具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。可溶性糖含量采用苯酚法測(cè)定[14]，單位用mg·g-1表示。

1.4.3 種子和幼苗鉛含量鉛含量用原子吸收光譜法測(cè)定。將所用到的玻璃儀器全部放入25%的硝酸里浸泡24 h后再用純水沖洗多遍，在烘箱內(nèi)烘干備用。分別將種子和幼苗樣品置于60 ℃烘干箱中至恒重,取出樣品并研磨成粉末，過20目篩。分析天平稱取1 g樣品置于坩堝內(nèi)，每處理平行試驗(yàn)3組，放入對(duì)應(yīng)的坩堝中，移入馬弗爐于600 ℃下灰化6 h，使樣品呈淺灰白色，取出，冷卻；加入15 mL硝酸和高氯酸混合溶液(2∶1)過夜，直到有機(jī)物完全消解；過濾、稀釋溶液后用原子吸收光譜法測(cè)定鉛含量。儀器操作條件:波長 283.30 nm，光譜帶寬 0.7 nm，氚燈校正背景，高壓211.6 V, 工作電流4.0 mA, 原子化升溫方式(Optical, 干燥灰化時(shí)間94 s, 原子化時(shí)間4 s，原子化溫度1 900 ℃)，每個(gè)樣品重復(fù)3次；繪制鉛濃度為0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線(A=0.734363C+1.1354，R=0.89909. A為吸光度，C為濃度)，據(jù)此計(jì)算樣品鉛含量，鉛含量以干物質(zhì)含量表示(mg·kg-1)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，采用 Microsoft Excel 2019軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，測(cè)定結(jié)果表示為‘平均值±標(biāo)準(zhǔn)差’形式，用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Original 8.0 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EBL對(duì)鉛脅迫下遠(yuǎn)志種子萌發(fā)的影響

表1顯示，對(duì)照組(CK)遠(yuǎn)志種子在培養(yǎng)的第1 天開始啟動(dòng)萌發(fā)，第5 天已大量萌發(fā)，最終發(fā)芽率為93.33%；單獨(dú)3 mmol·L-1醋酸鉛(CH3CO2)2Pb脅迫處理(B0、A0)下遠(yuǎn)志種子發(fā)芽時(shí)間比CK延遲約2 d，第7 天大量萌發(fā)，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均比相應(yīng)CK顯著降低。與B0、A0處理相比，各濃度EBL預(yù)浸種和拌種處理遠(yuǎn)志種子的萌發(fā)指標(biāo)均不同程度地升高，且除預(yù)浸種處理的發(fā)芽指數(shù)外，A1～A3和B1～B3處理的增幅均達(dá)到顯著水平，A4和B4處理的個(gè)別指標(biāo)增幅也達(dá)到顯著水平；在鉛脅迫條件下，預(yù)浸種和拌種處理遠(yuǎn)志種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均隨EBL濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，并分別在A3和B2處理時(shí)達(dá)到最高，且不同濃度間大多差異顯著。在相同EBL濃度處理下，遠(yuǎn)志種子發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)在B0與A0處理間均無顯著差異；B1～B3處理各萌發(fā)指標(biāo)均不同程度地高于相應(yīng)A1～A3處理，尤其是B1～B3處理的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)不但顯著高于相應(yīng)的A1～A3處理，還甚至稍高于相應(yīng)CK水平；但B4處理各萌發(fā)指標(biāo)則不同程度低于A4處理，且大多達(dá)到顯著水平?？梢?，3 mmol·L-1Pb2+脅迫顯著抑制了遠(yuǎn)志種子萌發(fā)，0.0001～1.0 μmol·L-1EBL拌種或者預(yù)浸種處理均能顯著緩解鉛脅迫的抑制效應(yīng)，且相同濃度 EBL拌種處理優(yōu)于預(yù)浸種處理；0.01 μmol·L-1EBL拌種處理和1 μmol·L-1EBL預(yù)浸種處理緩解鉛脅迫效應(yīng)最好，發(fā)芽率分別達(dá)到98.89%和82.22%。

表1 EBL對(duì)緩解遠(yuǎn)志幼苗鉛脅迫萌發(fā)數(shù)據(jù)(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

2.2 EBL對(duì)鉛脅迫下遠(yuǎn)志幼苗生長的影響

相比CK組，A0、B0 處理使遠(yuǎn)志幼苗生長嚴(yán)重受阻；各濃度EBL預(yù)浸種和拌種處理均對(duì)鉛脅迫幼苗生長有不同程度的影響，且幼苗子葉隨EBL的濃度增加而增大(圖1)，但100 μmol·L-1EBL處理下子葉發(fā)黃卷曲，葉面積超出CK組2倍，較正常幼苗衰老速度加快，呈現(xiàn)高濃度抑制作用。表2顯示，在相同EBL濃度處理下，遠(yuǎn)志幼苗胚芽長度、地上部長度、胚根長度在B0與A0處理間均無顯著差異；預(yù)浸種處理下，幼苗的芽長隨著EBL濃度的升高而增大，在A4處理下達(dá)到最大值(0.63 cm)，且A4和B2處理的芽長不但顯著高于A0、B0處理，還甚至高于CK。同時(shí)，EBL處理可一定程度上緩解鉛脅迫對(duì)遠(yuǎn)志幼苗胚根的抑制作用，且拌種處理優(yōu)于預(yù)浸種處理，二者均以0.01 μmol·L-1EBL處理組(A2、B2)逆轉(zhuǎn)率最好，胚根長分別為A0、B0的4.50和7.81倍。耐受性指數(shù)作為鉛敏感性指標(biāo)，代表脅迫和非脅迫下幼苗生長之間的關(guān)系，是植物修復(fù)方法中需要考慮的一個(gè)相關(guān)參數(shù)[15]。B2處理耐受指數(shù)最大(0.42)，對(duì)鉛脅迫的恢復(fù)作用顯著(P<0.05)，根據(jù)Lux[16]文獻(xiàn)判斷遠(yuǎn)志幼苗經(jīng)0.01 μmol·L-1EBL誘導(dǎo)后耐受性提高至中等耐性。另外，隨EBL濃度的增加，遠(yuǎn)志幼苗鮮重、干重先增后減，A1～A3處理幼苗鮮重分別顯著高于A0 23.4%、33.85%、40.14%，B1～B3處理則分別比B0顯著增加41.05%、54.08%、33.60%；各濃度EBL處理遠(yuǎn)志幼苗干重均比A0和B0顯著增加，增幅分別為22.58%、38.46%、52.00%、29.41%和61.11%、63.15%、64.40%、51.16%，且均在1 μmol·L-1時(shí)有最高值，說明EBL可顯著提高鉛脅迫幼苗的生物量。此外，鉛脅迫遠(yuǎn)志幼苗含水量隨EBL濃度的增加先增后減，但總體呈降低的趨勢(shì)，證明植株在EBL的作用下會(huì)調(diào)控降低鉛脅迫幼苗含水量水平。

圖1 0.01 μmol·L-1 EBL浸種和拌種處理對(duì)鉛脅迫下遠(yuǎn)志幼苗生長情況的影響Fig.1 Effect of 0.01 μmol·L-1 EBL seed soaking and seed dressing on the growth of P. tenuifolia seedlings under lead stress

2.3 EBL對(duì)鉛脅迫下遠(yuǎn)志幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

遠(yuǎn)志幼苗游離脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的含量在單獨(dú)Pb脅迫處理(B0、A0)下均比相應(yīng)CK顯著降低(圖2)。在鉛脅迫條件下，浸種和拌種處理遠(yuǎn)志幼苗游離脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的含量隨EBL濃度的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢(shì)，并均在0.01 μmol·L-1EBL(B2、A2)處理時(shí)達(dá)到最大值，并顯著高于A0、B0處理組(P<0.05)。同時(shí)，EBL拌種處理的效果優(yōu)于相應(yīng)濃度的預(yù)浸種處理，B2處理幼苗的游離脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量最高，分別是B0處理的1.99倍、1.95倍和2.31倍，A2處理分別是A0處理的1.88倍、1.72倍和1.26倍?？梢?，在鉛脅迫條件下，外源EBL可以促進(jìn)遠(yuǎn)志幼苗體內(nèi)大量積累脯氨酸和可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，通過滲透調(diào)節(jié)作用來有效緩解鉛脅迫造成的傷害，并以0.01 μmol·L-1EBL處理效果最佳。

表2 鉛脅迫下不同濃度EBL處理幼苗生長情況

圖2 EBL對(duì)鉛脅迫下遠(yuǎn)志幼苗滲透性調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響Fig.2 Effects of EBL on the contents of osmotic regulation substances in seedlings of P. tenuifolia under lead stress

2.4 EBL對(duì)鉛脅迫下遠(yuǎn)志幼苗抗氧化酶活性的影響

遠(yuǎn)志幼苗抗氧化酶活性在單獨(dú)鉛脅迫下(A0、B0)均比CK大幅度顯著降低(P<0.05)。與B0、A0處理相比，各濃度EBL預(yù)浸種和拌種處理下遠(yuǎn)志幼苗抗氧化酶活性均不同程度升高，且A1～A3和B1～B3處理的增幅均達(dá)到顯著水平，A4和B4處理的個(gè)別指標(biāo)增幅也達(dá)到顯著水平；在鉛脅迫條件下，預(yù)浸種和拌種處理SOD、POD和CAT活性均隨EBL濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，在0.01 μmol·L-1EBL處理達(dá)到最高，此時(shí)并分別為A0、B0的1.51倍和1.52倍(圖3，A)、1.33倍和2.61倍(圖3，C)、3.77倍和5.65倍(圖3，D);同時(shí)不同濃度處理間大多差異顯著,尤其是B2處理的CAT含量不但顯著高于相應(yīng)的A2處理，甚至顯著高于相應(yīng)CK水平(P<0.05)。可見，Pb2+脅迫顯著抑制了遠(yuǎn)志幼苗抗氧化酶活性，0.0001～1.0 μmol·L-1EBL拌種或者預(yù)浸種處理均能顯著提高其抗氧化酶活性，拌種組0.01 μmol·L-1EBL處理較預(yù)浸組緩解鉛脅迫效應(yīng)更佳。與以上抗氧化酶表現(xiàn)不同，預(yù)浸組遠(yuǎn)志幼苗APX活性較拌種組高，但仍在0.01 μmol·L-1EBL處理下最高，約為A0 處理的5.81倍(圖3，B)。

圖3 EBL對(duì)鉛脅迫下遠(yuǎn)志幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effects of EBL on antioxidant enzyme activities of P. tenuifolia seedlings under lead stress

2.5 EBL對(duì)鉛脅迫下遠(yuǎn)志幼苗丙二醛和H2O2含量的影響

圖4顯示，在單獨(dú)Pb脅迫處理(A0、B0)下，遠(yuǎn)志幼苗丙二醛(MDA)和H2O2的含量均比相應(yīng)的CK顯著增加；與抗氧化酶活性的變化趨勢(shì)相反，隨著EBL濃度的逐漸增加，預(yù)浸種和拌種處理的遠(yuǎn)志幼苗MDA和H2O2含量均表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)，且在各濃度處理間均差異顯著，并均在A2、B2處理下達(dá)到最低值。其中，與A0、B0處理相比，除B3外的預(yù)浸種和拌種處理遠(yuǎn)志幼苗MDA含量均顯著降低，A2、B2處理的MDA含量分別顯著降低71.81%和67.53%，且顯著低于CK組水平(P<0.05)，此時(shí)拌種組稍高于預(yù)浸種組(圖4，B)；在鉛脅迫條件下，各濃度EBL預(yù)浸種和拌種處理遠(yuǎn)志幼苗H2O2含量均顯著低于A0、B0處理，A2、B2處理的分別相應(yīng)顯著降低76.18%和82.01%，此時(shí)B2處理顯著低于A2處理(圖4，B)。以上結(jié)果說明，適宜濃度外源EBL預(yù)浸種或者拌種均可顯著緩解鉛脅迫誘導(dǎo)的遠(yuǎn)志幼苗膜脂過氧化傷害，但EBL濃度過高反而會(huì)導(dǎo)致遠(yuǎn)志幼苗質(zhì)膜遭受明顯損傷。

圖4 EBL對(duì)鉛脅迫下遠(yuǎn)志幼苗MDA及H2O2含量的影響Fig.4 Effects of EBL on the contents of MDA and H2O2 in P. tenuifolia seedlings under lead stress

2.6 EBL對(duì)鉛脅迫下遠(yuǎn)志種子和幼苗中鉛含量的影響

圖5,A顯示，單獨(dú)鉛脅迫處理(A0、B0)下遠(yuǎn)志種子中Pb含量大幅顯著增加，拌種處理的增幅遠(yuǎn)大于浸種處理，A0、B0處理分別為CK的3.09倍和12.84倍。EBL預(yù)浸種處理遠(yuǎn)志種子中Pb含量均不同提高，但其增幅僅在A1處理下達(dá)到顯著水平(P<0.05)，且達(dá)到最大值(0.86 mg·kg-1)，此時(shí)為A0 處理的1.42倍；各濃度EBL拌種處理則可以不同程度降低遠(yuǎn)志種子中Pb含量，且除B4處理外均與 B0組差異顯著(P<0.05)，并以B2處理降低幅度最大(38.78%)。同時(shí)，在相同EBL濃度處理下，拌種處理遠(yuǎn)志種子中Pb含量均顯著高于相應(yīng)的預(yù)浸種處理。因此，各濃度外源EBL預(yù)浸種處理均可促進(jìn)志種子中Pb積累，但僅0.0001 μmol·L-1EBL處理達(dá)到顯著水平，而拌種處理均能降低Pb的積累，并以0.01 μmol·L-1EBL處理降幅最大。

另外，從圖5,B可知，單獨(dú)鉛脅迫處理(A0、B0)下遠(yuǎn)志幼苗中Pb含量同樣比CK大幅顯著增加，A0、B0處理分別為CK的7.51倍和7.69倍。與A0、B0組相比，不同濃度EBL預(yù)浸種和拌種處理遠(yuǎn)志幼苗中鉛含量均顯著增加，且均隨EBL濃度的增加呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，并均在A2、B2處理下達(dá)到最高值，分別為1.63和1.40 mg·kg-1。在相同EBL濃度下，僅B2顯著高于A2，B3顯著低于A3，其余濃度下拌種和預(yù)浸種處理間均無顯著差異。上述結(jié)果表明，EBL無論以何種形式添加均可顯著提高幼苗中鉛含量，且0.01 μmol·L-1EBL處理促進(jìn)作用最強(qiáng)，而以100 μmol·L-1EBL處理促進(jìn)作用較弱。

3 討 論

植物在不同生長階段對(duì)脅迫的耐受性不同，并以種子和幼苗兩個(gè)階段最為脆弱[16]。鉛作為常見的重金屬污染之一，在自然界中廣泛存在，可對(duì)藥用植物的生長發(fā)育及藥用安全性等造成危害。蕓苔素(EBL)在植物遭受脅迫時(shí)表現(xiàn)出優(yōu)良的抗逆性，通過提高酶活性來增加自由基的清除速度，使植株免受脅迫傷害[17]。Jin等[18]研究表明，EBL可以促進(jìn)新的木葡聚糖添加到細(xì)胞壁中，從而使細(xì)胞松弛和伸長；Soares 等[7]證實(shí)EBL可通過減少活性氧(ROS)來緩解小白菜在脅迫環(huán)境下遭受的不良影響。因此，本實(shí)驗(yàn)通過考察EBL對(duì)鉛脅迫下遠(yuǎn)志種子萌發(fā)與幼苗生長情況的影響，同時(shí)分析相關(guān)生長及抗逆生理生化指標(biāo)，初步了解EBL緩解遠(yuǎn)志種子及幼苗抵抗重金屬鉛脅迫的效應(yīng)。

鉛、鉻、鋅等重金屬改變了植物的生存環(huán)境，可直接影響其種子萌發(fā)、幼苗生長發(fā)育及抗氧化酶活性等生理生化指標(biāo)[19-21]。本研究表明，鉛脅迫能夠抑制遠(yuǎn)志種子萌發(fā)與幼苗生長，EBL預(yù)浸種和拌種處理可以顯著提高遠(yuǎn)志種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、活力指數(shù)和耐受性指數(shù)等指標(biāo)，有效緩解其所遭受的鉛脅迫傷害，并存在高濃度抑制效應(yīng)，其原因可能是EBL可刺激胚胎發(fā)育及在大孢子有絲分裂中發(fā)揮作用所致。其中，預(yù)浸組1 μmol·L-1EBL種子發(fā)芽率最高，拌種處理組0.01 μmol·L-1EBL發(fā)芽率最高(98.89%)，但與1 μmol·L-1EBL處理(96.67%)無顯著差異，表明EBL處理方式和濃度均會(huì)影響遠(yuǎn)志種子萌發(fā)，且種子在混合溶液的發(fā)芽床上連續(xù)浸泡時(shí)劑量可能會(huì)干擾激素的使用效果[22]。植物生長指標(biāo)可較直觀反映重金屬脅迫的影響，EBL會(huì)通過激活H+-ATPase增加細(xì)胞壁的合成，促進(jìn)幼苗生長[23]。本研究中遠(yuǎn)志幼苗遭受鉛脅迫后，其生長指標(biāo)均被抑制，添加EBL可改變其耐受指數(shù)，呈現(xiàn)出低中濃度促進(jìn)高濃度抑制現(xiàn)象，其中0.01 μmol·L-1EBL處理能夠顯著緩解鉛脅迫對(duì)遠(yuǎn)志幼苗生長的抑制作用，可能與EBL通過促進(jìn)遠(yuǎn)志幼苗根的生長來提高耐受性有關(guān)，這也與Ahammed等[24]的相關(guān)研究結(jié)果類似。

EBL會(huì)通過調(diào)節(jié)游離脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的水平來保護(hù)幼苗以減輕其遭受的鉛毒害。在鉛脅迫條件下，遠(yuǎn)志幼苗3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量隨EBL濃度增加表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，證實(shí)了EBL可以誘導(dǎo)遠(yuǎn)志幼苗增加合成可溶性糖和蛋白數(shù)量來降低原生質(zhì)的滲透勢(shì)，抵御對(duì)細(xì)胞有毒的化合物積累，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞免于損傷，以提高其對(duì)鉛環(huán)境的適應(yīng)性[25]。酶促保護(hù)體系可有效清除因脅迫環(huán)境而產(chǎn)生過量的活性氧，其中APX、POD、SOD和CAT是普遍存在于植物體內(nèi)的重要抗氧化酶，與植物的生理生化及代謝活動(dòng)關(guān)系密切[26]。本研究證實(shí)，遠(yuǎn)志幼苗的APX、POD、SOD和CAT活性在鉛脅迫下顯著降低，而在預(yù)浸種和拌種處理后隨著EBL濃度的增加均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，表明遠(yuǎn)志幼苗遭受鉛脅迫后體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)可通過復(fù)雜的協(xié)同調(diào)控來增加體內(nèi)抗氧化酶活性，從而清除過多活性氧的積累；但是，高濃度EBL環(huán)境下活性氧的增加已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過抗氧化酶系統(tǒng)的負(fù)荷而對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重傷害，從而引起酶活性的下降，這與王文靜等[27]的研究結(jié)果一致。同時(shí)，EBL處理可以通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性來降低體內(nèi)MDA和H2O2含量，修復(fù)生理機(jī)能，從而改善遠(yuǎn)志幼苗在鉛脅迫時(shí)出現(xiàn)的細(xì)胞膜損傷和膜透性[28-29]?？梢?，EBL處理有助于提高遠(yuǎn)志幼苗中抗氧化酶活性，降低活性氧等有害物質(zhì)積累，有效克服鉛脅迫所引發(fā)的脅迫效應(yīng)。

鉛等重金屬脅迫影響著植物從種子萌發(fā)到生長發(fā)育的整個(gè)階段，其傷害主要是由于鉛脅迫誘導(dǎo)引起的細(xì)胞膜組成、膜通透性以及ROS積累的變化所致。本研究中遠(yuǎn)志種子的鉛含量隨EBL濃度增加呈先下降后上升的趨勢(shì)，且拌種組鉛含量遠(yuǎn)高于預(yù)浸種組，原因是種子在預(yù)浸泡中已經(jīng)水合，種子已經(jīng)達(dá)到了吸脹第二階段，而第二階段開始重新啟動(dòng)新陳代謝，此時(shí)種子的吸水率最低[30]。遠(yuǎn)志幼苗中鉛含量變化趨勢(shì)與種子相反，隨著胚根的出現(xiàn)和幼苗的形成，鉛的含量在種皮破裂后顯著增加，表明從胚根突起形成開始，幼苗組織對(duì)鉛的吸收逐漸增加，而EBL可以通過改變細(xì)胞膜透性來增加對(duì)鉛的凈化和吸收，提高鉛存在下激活的ROS解毒系統(tǒng)的效率[30]。同時(shí)，鉛等重金屬的超標(biāo)會(huì)嚴(yán)重影響中藥材的安全性，馮云霞等[31]對(duì)100味常用藥材的重金屬殘留狀況分析發(fā)現(xiàn)中藥材中存在不同程度和種類的重金屬污染，總超標(biāo)率為22%，其中鉛的超標(biāo)率為5%；石伊凡等[32]通過測(cè)定和分析35味中藥材的鉛、銅、砷、鎘、汞等5種重金屬含量，表明鉛元素超標(biāo)率在5種重金屬元素中最高，達(dá)到了11.43%，不同中藥材中鉛元素的含量差異較大(0.18～13.33 mg·kg-1)，平均含量為2.10 mg·kg-1，最高含量為藥典標(biāo)準(zhǔn)的2.67倍。可見，因受種植環(huán)境、土壤等因素的影響，鉛仍然是影響中藥材安全性的重要因素之一，本研究中適宜濃度EBL預(yù)浸種和拌種處理可以通過調(diào)節(jié)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和抗氧化酶活性來有效緩解鉛脅迫對(duì)遠(yuǎn)志種子萌發(fā)和幼苗生長傷害，并顯著促進(jìn)幼苗中鉛的積累，但引起的鉛含量最大值為2.54 mg·kg-1，遠(yuǎn)低于藥典規(guī)定的5 mg·kg-1。

綜上所述，EBL通過調(diào)節(jié)遠(yuǎn)志幼苗自身生長和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、保護(hù)酶系統(tǒng)、丙二醛及過氧化氫含量等來有效促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育，抵御所處鉛脅迫環(huán)境的傷害，表現(xiàn)出較好的抗逆性。在維護(hù)遠(yuǎn)志藥材重金屬安全性的前提下，應(yīng)用EBL處理種子可以作為改善鉛脅迫環(huán)境中遠(yuǎn)志種子萌發(fā)和幼苗生長狀況的一個(gè)新途徑。本研究對(duì)于揭示促進(jìn)遠(yuǎn)志種子及幼苗生長適應(yīng)鉛脅迫環(huán)境下的基本機(jī)制，增強(qiáng)遠(yuǎn)志的重金屬脅迫耐受性，促進(jìn)植物正常生長，指導(dǎo)開展遠(yuǎn)志種苗耐鉛毒性處理以及緩解其他重金屬脅迫環(huán)境措施研究具有重要的社會(huì)實(shí)踐意義。