李 瑩，鐘海蓉，李奕松，威則日沙，李文兵，劉 圓*

基于高通量測(cè)序研究甘松根際細(xì)菌及藥用部位內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性

李 瑩1, 2, 3，鐘海蓉2, 4，李奕松1，威則日沙3, 5，李文兵2, 3, 6，劉 圓2, 3, 6*

1. 西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041 2. 四川省羌彝藥用資源保護(hù)與利用工程實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610225 3. 青藏高原民族藥用資源保護(hù)與利用國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610225 4. 四川中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，四川 綿陽(yáng) 621000 5. 涼山彝族自治州第二人民醫(yī)院，四川 西昌 615000 6. 西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院，四川 成都 610225

探析并比較野生甘松與仿野生栽培甘松的根際細(xì)菌與內(nèi)生細(xì)菌的種群組成、豐富度、多樣性及差異性。以野生甘松和仿野生栽培甘松的根際土壤、根及根莖為研究樣本，基于Illumina MiSeq第二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)根際土壤細(xì)菌、根及根莖內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA V4-V5區(qū)進(jìn)行序列測(cè)定，并進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析。各組樣本基因組經(jīng)16S測(cè)序，細(xì)菌群落的所有序列分別進(jìn)行97%的相似水平下的物種分類單元（operational taxonomic units，OUT）分類，根際細(xì)菌共涉及22門、38綱、69目、119科、254屬、268種，內(nèi)生細(xì)菌共涉及16門、29綱、60目、107科、199屬、145種。根際、內(nèi)生細(xì)菌群落中共有的序列分別為498個(gè)、177個(gè)，主成分分析的最主要2類主成分（PC1和PC2）類群的比例綜合分別接近70%、60%，其中豐度排在前4位的依次為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門和擬桿菌門，其他類群的類別及相對(duì)豐度存在一定差異。優(yōu)勢(shì)細(xì)菌差異分析中，各組細(xì)菌群落組成及相對(duì)豐度差異很大。野生甘松和仿野生栽培甘松的優(yōu)勢(shì)促生菌群可能主要集中于變形菌門、放線菌門、酸桿菌門和擬桿菌門，可從中篩選出核心功能微生物混合菌群，對(duì)改良仿野生培育甘松土壤的微生物環(huán)境具有理論指導(dǎo)意義。

甘松；根際細(xì)菌；內(nèi)生細(xì)菌；群落結(jié)構(gòu)；多樣性

甘松為敗醬科植物甘松DC.的干燥根及根莖，為中藏藥材，亦為古印度阿育吠陀（Ayurveda）和尤納尼醫(yī)（Unani）學(xué)體系的常用藥物[1-2]。甘松廣泛應(yīng)用于藥品、日化及香料等領(lǐng)域，具有較高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年，甘松的野生資源逐年枯竭，匙葉甘松DC.已被列為《瀕危野生動(dòng)植物物種國(guó)際貿(mào)易公約》（2007、2013年版）的附錄II中。由于甘松對(duì)生態(tài)環(huán)境（海拔3400～5000 m）要求較為苛刻，人工種植處于尚未起步的狀態(tài)。

本課題組2015～2020年，在西南民族大學(xué)青藏基地對(duì)甘松進(jìn)行了仿野生移栽馴化工作，研究發(fā)現(xiàn)與野生甘松相比較，仿野生栽培甘松的總根表面積、須根根尖數(shù)量均明顯增加，主根變細(xì)，氣味明顯變?nèi)酰粐?yán)重影響仿野生栽培甘松藥材的品質(zhì)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)土壤微生態(tài)，特別是細(xì)菌微生物結(jié)構(gòu)和數(shù)量可能是影響根類、根及根莖類藥材品質(zhì)的重要因素[3-10]。其中，根際細(xì)菌中的促生菌在抑制根際病原菌、促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育及代謝等方面起到重要作用[6-10]；內(nèi)生細(xì)菌不僅參與植物從土壤中吸收養(yǎng)分、植物次生代謝產(chǎn)物的合成與轉(zhuǎn)化，還可獨(dú)立產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，在藥材品質(zhì)、道地性、協(xié)助植物抗逆與應(yīng)對(duì)海拔、季節(jié)、氣候特殊環(huán)境等方面均有重要的影響[4, 7-12]。

目前，關(guān)于甘松的根際微生物與內(nèi)生菌方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。高通量測(cè)序技術(shù)因其較傳統(tǒng)方法具有更快速、準(zhǔn)確、科學(xué)、全面地探析樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)[13-14]，本實(shí)驗(yàn)利用基于Illumina MiSeq平臺(tái)的第二代高通量測(cè)序技術(shù)，擬對(duì)甘松根際及藥用部位痕量細(xì)菌的宏基因組進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，分析甘松根際細(xì)菌和根及根莖內(nèi)生細(xì)菌群落分布和多樣性；并比較仿野生栽培和野生甘松在根際細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌群落的異同，為進(jìn)一步探究與篩選出核心功能微生物混合菌群，對(duì)改良仿野生培育甘松的土壤、調(diào)節(jié)微生物環(huán)境、幫助仿野生繁育品抵抗青藏高原的特殊惡劣環(huán)境提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

精密電子天平（上海卓精電子科技有限公司），振蕩器vortex-5（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），HHS-2S型電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海予卓?jī)x器有限公司），Eppendorf離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），電泳儀和凝膠成像儀[Bio Rad公司，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司]，ABI9700 PCR儀（ABI，Applied Biosystems 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），Axygen凝膠回收試劑盒（Axygen公司，美國(guó)），F(xiàn)TC-3000TM real-time PCR（上海楓嶺生物技術(shù)有限公司），Miseq測(cè)序儀（Illumina公司，美國(guó)）。

Phusion超保真PCR Master Mix（貨號(hào)M0531L，NEB公司，英國(guó)），DNA Marker（貨號(hào)3427A，DL9000欣百諾公司，DL2000 Takara），TB Green Premix Ex Taq（貨號(hào)RR420，ATakara公司，日本），MiSeq Reagent Kits v3（貨號(hào)MS-102-3003，Illumina公司，美國(guó)），MIO-BIO PowerSoil DNA Isolation Kit（貨號(hào)12888-100，Mo Bio Laboratories公司，美國(guó)）。

野生甘松和仿野生栽培甘松樣品及其根際土壤均于2019年7月采自四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣，其中仿野生栽培品采自西南民族大學(xué)青藏基地（2015年從野外移栽至基地后，仿野生人工栽培4年）。經(jīng)西南民族大學(xué)劉圓教授鑒定為敗醬科植物甘松DC.，采集信息詳見(jiàn)表1。

2 方法

2.1 樣品前處理

采集新鮮、健康的帶土甘松，抖去多余泥土后，將一部分帶浮土的根、根莖用剪刀（經(jīng)70%乙醇消毒）剪段，裝至無(wú)菌PE管保存于液氮罐中，作為檢測(cè)根際細(xì)菌樣品；另一部分立即用蒸餾水將根和根莖淋洗干凈，用70%乙醇擦拭表面至無(wú)菌后，切段裝至無(wú)菌PE管并保存于液氮罐中，作為檢測(cè)內(nèi)生細(xì)菌樣品。

表1 甘松樣品及根際土壤采集信息

Table 1 Collection information of N. jatamansi and rhizosphere soil

樣本編號(hào)樣品來(lái)源與部位產(chǎn)地海拔/m A1-1栽培甘松-土根西南民族大學(xué)青藏基地3670 A1-2栽培甘松-凈根西南民族大學(xué)青藏基地3670 A1-3栽培甘松-土根莖西南民族大學(xué)青藏基地3670 A1-4栽培甘松-凈根莖西南民族大學(xué)青藏基地3670 A2-1栽培甘松-土根西南民族大學(xué)青藏基地3670 A2-2栽培甘松-土根莖西南民族大學(xué)青藏基地3670 A2-3栽培甘松-凈根西南民族大學(xué)青藏基地3670 B1-1野生甘松-土根安曲鎮(zhèn)下哈拉瑪村3561 B1-2野生甘松-凈根安曲鎮(zhèn)下哈拉瑪村3561 B1-3野生甘松-土根莖安曲鎮(zhèn)下哈拉瑪村3561 B1-4野生甘松-凈根莖安曲鎮(zhèn)下哈拉瑪村3561 B2-1野生甘松-土根阿木鄉(xiāng)峨扎村3560 B2-2野生甘松-凈根阿木鄉(xiāng)峨扎村3560 B2-3野生甘松-土根莖阿木鄉(xiāng)峨扎村3560 B2-4野生甘松-凈根莖阿木鄉(xiāng)峨扎村3560

2.2 DNA提取

2.2.1 根際細(xì)菌 于超凈臺(tái)內(nèi)，將甘松根及根莖附著的根際土壤洗脫到95%乙醇中，于?80 ℃超低溫冰箱冷凍保存，按照MIO-BIO PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒的說(shuō)明書對(duì)根際土壤細(xì)菌總DNA進(jìn)行提取。

2.2.2 內(nèi)生細(xì)菌 于超凈臺(tái)內(nèi)取出樣品后，在75%乙醇中浸泡2.5 min，用無(wú)菌水清洗3次，切取中間段的植物組織，保證其無(wú)菌。再用PBS溶液反復(fù)沖洗，將沖洗液離心5 min，轉(zhuǎn)速8000 r/min，合并沉淀置于?80 ℃凍存。臨用前放于干冰浴中，于潔凈操作臺(tái)上取出，立即用液氮進(jìn)行研磨、破壁。按蛋白酶K裂解法和酚氯仿抽提常規(guī)方法提取細(xì)菌總DNA。

2.3 16 S rDNA V4～V5區(qū)的PCR擴(kuò)增

根據(jù)illumina Miseq高通量測(cè)序要求，進(jìn)行雙向測(cè)序，設(shè)計(jì)目標(biāo)區(qū)域和帶有“5’ Miseq接頭- barcode-測(cè)序引物-特異引物-3’”的融合引物。并采用2步PCR擴(kuò)增的方法，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。

PCR所用的引物已經(jīng)融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)的V4-V5通用引物，外生菌采用引物515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和926R：5’-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3’。內(nèi)生菌引物為799F：5’-AACMGGATTAGATACCCKG-3’和1193R：5’-ACGTCATCCCCACCTTCC-3’。

采用兩步PCR擴(kuò)增的方法，首先采用特異引物擴(kuò)增目的片段，將目的片段進(jìn)行膠回收，而后將回收產(chǎn)物作為模板進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增，目的是將Illumina平臺(tái)測(cè)序所需的接頭測(cè)序引物Barcode添加到目的片段的兩端。

采用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收?；厥债a(chǎn)物進(jìn)行qRT-PCR定量。

2.4 RT-PCR定量

全部PCR產(chǎn)物已采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，F(xiàn)TC-3000TM RT-PCR儀對(duì)回收的DNA以精確定量，按照等比例進(jìn)行混合后測(cè)序。

2.5 上機(jī)測(cè)序

樣品檢測(cè)合格后，DNA委托微基生物科技（上海）有限公司完成測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為美國(guó)Illumina公司Illumina Miseq PE250高通量測(cè)序儀。

2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

Miseq測(cè)序得到的PEreads，根據(jù)barcode對(duì)樣本進(jìn)行區(qū)分，對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控及過(guò)濾；再根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，拼接后的序列再次進(jìn)行質(zhì)控和濾過(guò)，最后得到的優(yōu)化序列。利用軟件USEARCH在97%的相似水平上進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OUT）聚類分析和物種分類學(xué)分析，基于OTU聚類分析結(jié)果，用于對(duì)OTU進(jìn)行樣本內(nèi)的alpha多樣性分析，并對(duì)測(cè)序深度進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，基于分類學(xué)信息在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析，并對(duì)樣本之間進(jìn)行beta多樣性分析。基于上述分析，再進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育等深入的統(tǒng)計(jì)學(xué)和可視化分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 甘松根際細(xì)菌的分析結(jié)果

所有樣品擴(kuò)增區(qū)域均為16S rDNA V4～V5，測(cè)序條數(shù)均超過(guò)4.5萬(wàn)條，所有樣品的測(cè)序深度超過(guò)99%，均擴(kuò)增成功。

3.1.1 序列長(zhǎng)度分布 甘松根際土壤樣品所測(cè)得的8個(gè)樣本，有效序列數(shù)在30 301～39 040，優(yōu)化序列平均長(zhǎng)度為412 bp，見(jiàn)圖1。

圖1 甘松根際細(xì)菌的序列長(zhǎng)度分布

3.1.2 各樣本OTU分布及物種信息（測(cè)序樣品的置信分析） 基于OUT-稀釋曲線（圖2）結(jié)果顯示，隨著測(cè)序數(shù)量的增加，稀釋曲線斜率逐漸降低，但未進(jìn)入平臺(tái)期，說(shuō)明再增加測(cè)序量也只會(huì)產(chǎn)生少量新的物種（OUTs），說(shuō)明本次測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。

結(jié)合Alpna多樣性分析結(jié)果，Simpson指數(shù)呈現(xiàn)出的差異稍明顯，表明根莖（B1-3、B2-3、A2-2）根際細(xì)菌的種群豐富度和多樣性最高，而總體來(lái)看仿野生人工栽培品根際細(xì)菌豐富度更高；Shannon-Wiener指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)結(jié)果均表明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。同時(shí)，說(shuō)明野生甘松與栽培甘松的根際菌群豐富度與均勻度較為一致。

3.1.3 甘松根際細(xì)菌群落分布特征 對(duì)測(cè)得的所有序列進(jìn)行97%的相似水平下的OUT分類，并進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析（圖3）。

圖2 甘松根際細(xì)菌稀釋性曲線圖

在門的分類水平上，野生甘松和仿野生栽培甘松的根際細(xì)菌中共檢測(cè)出22個(gè)門，相對(duì)豐度較高且共有的8個(gè)細(xì)菌門類依次為變形菌門（Proteobacteria，46.55%～68.67%）、放線菌門（Actinobacteria，10.57%～27.44%）、酸桿菌門（Acidobacteria，2.62%～16.74%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，2.99%～8.07%）、浮霉菌門（Planctomycetes，2.48%～5.08%）、綠彎菌門（Chloroflexi，1.43%～5.41%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，0.80%～2.57%）、厚壁菌門（Firmicutes，0.80%～3.28%）等。

在綱的分類水平上，共檢測(cè)出38個(gè)綱，其中相對(duì)占優(yōu)勢(shì)的有α變形桿菌綱（Alphaproteobacteria，24.14%～44.98%）、-變形菌綱（Gammaproteobacteria，5.32%～21.93%）、放線菌綱（Actinobacteria，5.87%～20.13%）、嗜熱油菌綱（Thermoleophilia，3.46%～10.49%）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria，2.80%～7.84%）、鞘脂桿菌綱（Sphingobacteriia，2.28%～5.87%）、酸桿菌綱（Acidobacteriia，0.11%～7.65%）、δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria，1.29%～6.17%）、浮霉菌綱（Planctomycetacia，1.33%～3.00%）。

在目的分類水平上，共檢測(cè)出69個(gè)目，甘松根際細(xì)菌主要分布在根瘤菌目（Rhizobiales，2.38%～25.22%）、鞘脂桿菌目（Sphingobacteriales，2.28%～5.87%）、黃色單胞菌目（Xanthomonadales，2.86%～12.59%）、伯克霍爾德氏菌目（Burkholderiales，1.66%～8.99%）、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales，2.38%～25.22%）、酸桿菌目（Acidobacteriales，2.86%～12.59%）、紅螺菌目（Rhodospirillales，2.52%～5.16%）、Gaiellales（1.83%～5.65%）和弗蘭克氏菌目（Frankiales，2.42%～4.44%）等。

在科的分類水平上，共檢測(cè)出119個(gè)科，其中在鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae，2.33%～8.86%）、慢生根瘤菌科（Bradyrhizobiaceae，3.21%～8.24%）、黃色單胞菌科（Xanthomonadaceae，1.33%～11.15%）、酸桿菌科（Acidobacteriaceae，0.11%～7.65%）、叢毛單胞菌科（Comamonadaceae，0.98%～4.34%）、根瘤菌科（Rhizobiaceae，0.97%～5.65%）、腸桿菌科（Enterobacteriacese，0.01%～17.73%）、Chitinophagaceae科（0.97%～3.51%）、黃色桿菌科（Xanthobacteraceae，0.88%～2.51%）等多有分布。

在屬的分類水平上，共檢測(cè)出254個(gè)屬，其中在慢生根瘤菌屬（3.06%～8.06%）、鞘氨醇單胞菌屬（0.65%～8.29%）、根瘤菌屬（0.85%～5.65%）、單胞菌屬（0.08%～6.69%）、鞘脂菌屬（0.15%～7.77%）、假黃色單胞菌屬（0.003%～1.58%）和屬（0.63%～1.71%）等多有分布在種的分類水平上，共檢測(cè)出268個(gè)種，其中有149種細(xì)菌尚未被人工條件下獲得培養(yǎng)的微生物，有1種未分類的細(xì)菌，這2部分細(xì)菌占有相對(duì)優(yōu)勢(shì)。從甘松根際細(xì)菌的種水平樣品聚類數(shù)與柱狀圖組合分析圖（圖4）來(lái)分析，來(lái)自2個(gè)產(chǎn)地的野生甘松根的根際細(xì)菌聚成一類，根莖的根際細(xì)菌也聚成一類，但栽培甘松的根與根莖的根際細(xì)菌沒(méi)有這樣的規(guī)律。

圖3 甘松根際細(xì)菌的門(A)、綱(B)、目(C)、科(D)、屬(E) 水平物種分布柱狀圖

3.1.4 甘松根際細(xì)菌群落主成分分析 基于相似水平為97%的OTU樣品表進(jìn)行分析，得Venn圖（圖5），可比較直觀地觀察到野生甘松與仿野生栽培甘松的根際細(xì)菌群落均有1448序列被劃分入相同的OTU中，各樣品中共有的序列有498個(gè)。

再根據(jù)每個(gè)樣品OTU的豐度數(shù)據(jù)計(jì)算出每個(gè)OTU在每個(gè)樣品所占的百分比，利用這個(gè)百分比信息進(jìn)行OTU的主成分分析（principal component analysis，PCA）。由圖6可知，PC1和PC2的比例綜合接近70%，基本可表明各樣本整體組成情況。其中，野生甘松根的根際細(xì)菌與仿野生栽培甘松根際細(xì)菌組成的相似度較高，而野生甘松的根際細(xì)菌組成離群較明顯。結(jié)合門、綱、目、科、屬和種水平上的分析結(jié)果，仿野生栽培甘松的根際細(xì)菌群落與野生甘松根際細(xì)菌群落更為相似。

圖4 甘松根際細(xì)菌的種水平樣品聚類數(shù)與柱狀圖組合分析圖

圖5 甘松根際細(xì)菌Venn圖-分組(左) 與花瓣圖(右)

3.1.5 野生甘松和仿野生栽培甘松根際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌差異分析 以所有野生甘松和仿野生栽培甘松的根際細(xì)菌類群為對(duì)象，使用LDA Effect Size組間群落差異分析兩者的根際細(xì)菌群落中主要差異物種（圖7）。分析結(jié)果表明，仿野生栽培甘松中起到重要作用的根際微生物物種包括假諾卡式菌目（Pseudonocardiales）、Solirubrobacterales目、微單孢菌目（Micromonosporales）等3個(gè)目，假諾卡式菌科（Pseudonocardiaceae）、微單孢菌科（Micromonosporaceae）、丙酸桿菌科（Propionibacteriaceae）、土壤紅桿菌科（Solirubrobacteraceae）、分支桿菌科（Mycobacteriaceae）和產(chǎn)堿桿菌科（Alcaligenaceae）等6個(gè)科，假諾卡式菌屬、游動(dòng)放線菌屬、土壤紅桿菌屬、、小月菌屬、微枝形桿菌屬紅游動(dòng)菌屬、土微菌屬、中慢生根瘤菌屬、、分枝桿菌屬和溶桿菌屬等12個(gè)屬。野生甘松中起到重要作用的根際微生物物種包括β-變形桿菌綱（Betaproteobacteria）、Solibacteres綱、芽孢桿菌綱（Bacilli）等3個(gè)綱，伯克霍爾德氏菌目（Burkholderiales）、黏球菌目（Myxococcales）、立克次氏體目（Rickettsiales）、Solibacterales、Nitrosomonadales和Bacillales等6個(gè)目，Solibacteraceae、多囊粘菌科（Polyangiaceae）、亞硝化單胞菌科（Nitrosomonadaceae）、伯克氏菌科（Burkholderianceae）等5個(gè)科，艾德昂菌屬、、未知嗜酸菌屬、食烴菌屬等5個(gè)屬。

圖6 OUT水平上的甘松根際細(xì)菌主成分分析

圖7 野生甘松和仿野生栽培甘松根際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌LEfSe分析

3.2 甘松根和根莖內(nèi)生菌的分析結(jié)果

所有樣品擴(kuò)增區(qū)域均為16S rDNA V4-V5，除A1-2樣品的測(cè)序條數(shù)為逾2.2萬(wàn)條外，測(cè)序條數(shù)均超過(guò)4萬(wàn)條，所有樣品的測(cè)序深度超過(guò)97%，均擴(kuò)增成功。

3.2.1 序列長(zhǎng)度分布 甘松樣品所測(cè)得的7個(gè)樣本，有效序列數(shù)在30 301～39 040，優(yōu)化序列平均長(zhǎng)度為412 bp，見(jiàn)圖8。

3.2.2 各樣本OTU分布及物種信息（測(cè)序樣品的置信分析） 基于OUT-稀釋曲線（圖9）結(jié)果顯示，隨著測(cè)序數(shù)量的增加，稀釋曲線斜率逐漸降低，趨于進(jìn)入平臺(tái)期，說(shuō)明再增加測(cè)序量也只會(huì)產(chǎn)生少量新的OUTs。結(jié)合Alpna多樣性分析指數(shù)結(jié)果（圖10），Simpson指數(shù)呈現(xiàn)出的差異稍明顯，表明，其中以A2-3和甘松根與根莖的內(nèi)生細(xì)菌的種群豐富度較高，差異也較大，B2-2的豐富度最高、多樣性最高；Shannon-Wiener指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)野生甘松與仿野生栽培甘松的內(nèi)生細(xì)菌菌群的豐富度與均勻度較為一致。結(jié)果均表明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。

圖8 甘松根及根莖的內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)化序列長(zhǎng)度分布

圖9 甘松內(nèi)生細(xì)菌稀釋性曲線圖

圖10 甘松內(nèi)生細(xì)菌Simpson、Shannon、Chao、Ace指數(shù)圖

3.2.3 甘松根和根莖內(nèi)生菌群落分布特征 對(duì)甘松根及根莖內(nèi)生細(xì)菌測(cè)得的所有序列，進(jìn)行97%的相似水平下的OUT分類，并進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析（圖11）。在門的分類水平上，野生甘松和仿野生栽培甘松的根際內(nèi)生細(xì)菌群落中共檢測(cè)出16個(gè)門，主要分布有變形菌門（Proteobacteria，65.54%～88.09%）、放線菌門（Actinobacteria，5.937%～26.61%）、酸桿菌門（Acidobacteria，0.38%～5.69%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，0.22%～3.62%）、厚壁菌門（Firmicutes，0.45%～2.84%）、綠彎菌門（Chloroflexi，0.16%～1.37%）等。

圖11 甘松內(nèi)生細(xì)菌的門(A)、綱(B)、目(C)、科(D)、屬(E) 水平物種分布柱狀圖

在綱的分類水平上，共鑒別29個(gè)綱，甘松內(nèi)生細(xì)菌在α-變形桿菌綱（Alphaproteobacteria，26.48%～42.47%）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria，17.93%～33.78%）、放線菌綱（Actinobacteria，4.49%～23.54%）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria，8.82%～19.13%）、酸桿菌綱（Acidobacteriia，0.24%～4.22%）、δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria，0.70%～2.94%）、嗜熱油菌綱（Thermoleophilia，0.62%～2.12%）、芽孢桿菌綱（Bacilli，0.44%～1.91%）、黃桿菌綱（Flavobacteriia，0.06%～2.73%）等中均有分布。

在目的分類水平上，共鑒別60個(gè)目，甘松內(nèi)生細(xì)菌在伯克霍爾德氏菌目（Burkholderiales，17.52%～32.36%）、根瘤菌目（Rhizobiales，13.28%～22.45%）、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales，6.07%～15.82%）、黃色單胞菌目（Xanthomonadales，3.51%～17.35%）、微球菌目（Micrococcales，5.83%～15.82%）、弗蘭克氏菌目（Frankiales，1.85%～6.34%）、棒狀桿菌目（Corynebacteriales，0.89%～5.03%）、柄桿菌目（Caulobacterales，1.02%～5.90%）、單胞菌目（Pseudomonadales，0.12%～8.93%）、酸桿菌目（Acidobacteriales，0.24%～4.22%）等均有分布。

在科的分類水平上，甘松內(nèi)生細(xì)菌鑒別的有107個(gè)科，多分布在叢毛單胞菌科（Comamonadaceae，8.05%～25.91%）、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae，5.36%～15.80%）、黃色單胞菌科（Xanthomonadaceae，2.14%～6.76%）、伯克氏菌科（Burkholderiaceae，0.97%～15.63%）、根瘤菌科（Rhizobiaceae，1.30%～8.40%）、微桿菌科（Microbacteriaceae，0.91%～10.72%）、弗蘭克氏菌科（Frankiaceae，0.94%～5.48%）、分支桿菌科（Mycobacteriaceae，0.84%～4.86%）等科類。

在屬的分類水平上，甘松內(nèi)生細(xì)菌共鑒別處出199個(gè)屬，其中在根瘤桿菌屬（0.23%～14.04%）、鞘氨醇單胞菌屬（3.13%～9.76%）、根瘤菌屬（0.96%～8.27%）、慢生根瘤菌屬（0.86%～9.68%）、纖毛菌屬（0.21%～6.63%）、分支桿菌屬（0.84%～4.86%）、屬（0.85%～5.65%）、屬（0.59%～7.01%）中多有分布。在種的水平上有145個(gè)種，其中68種細(xì)菌尚未被人工條件下獲得培養(yǎng)的微生物，1種未分類的細(xì)菌，這兩部分細(xì)菌占有相對(duì)優(yōu)勢(shì)。從甘松內(nèi)生細(xì)菌的種水平差異性矩陣熱圖（圖12）可得知，野生甘松和仿野生栽培甘松的內(nèi)生細(xì)菌最先聚成一類，根際細(xì)菌也聚成一類，再與內(nèi)生細(xì)菌聚為一類。

圖12 甘松內(nèi)生細(xì)菌的種水平差異性矩陣熱圖

3.2.4 甘松根和根莖內(nèi)生菌群落主成分分析 基于相似水平為97%的OTU樣品表進(jìn)行分析，得Venn圖（圖13），可比較直觀地觀察到野生甘松與仿野生栽培甘松的內(nèi)生細(xì)菌群落均有562序列被劃分入相同的OTU中，各樣品中共有的序列有177個(gè)。

再根據(jù)每個(gè)樣品OTU的豐度數(shù)據(jù)計(jì)算出每個(gè)OTU在每個(gè)樣品所占的百分比，利用這個(gè)百分比信息進(jìn)行OTU的PCA分析。由圖14可知，PC1和PC2的比例綜合接近60%，基本可表明各樣本整體組成情況。其中，仿野生栽培甘松的樣品A1-2、A1-4的內(nèi)生細(xì)菌群落與野生甘松樣品B1-2、B1-4和B2-4的內(nèi)生細(xì)菌群落組成的相似度較高，而野生甘松樣品B2-2的內(nèi)生細(xì)菌和仿野生栽培甘松樣品A2-3的內(nèi)生細(xì)菌組成離群較遠(yuǎn)。結(jié)合門、綱、目、科、屬水平和種水平的分析結(jié)果，仿野生栽培甘松的內(nèi)生細(xì)菌群落與野生甘松根莖的內(nèi)生細(xì)菌群落更為相似。

圖13 甘松內(nèi)生細(xì)菌群落Venn圖-分組(左) 與花瓣圖(右)

圖14 OUT水平上的甘松內(nèi)生細(xì)菌主成分分析

3.2.5 野生甘松和仿野生栽培甘松根及根莖的內(nèi)生優(yōu)勢(shì)細(xì)菌差異分析 以所有野生甘松和仿野生栽培甘松的內(nèi)生細(xì)菌類群為對(duì)象，使用LDAEffect Size組間群落差異分析野生甘松與仿野生栽培甘松的內(nèi)生細(xì)菌群落中主要差異物種（圖15）。分析結(jié)果表明，仿野生栽培甘松組別中起到重要作用的內(nèi)生微生物物種包括酸桿菌門（Acidobacteria）和裝甲菌門（Armatimonadetes）2個(gè)門，梭狀芽胞桿菌綱（Clostridia）和Armatimonadia 2個(gè)綱，黃色單胞菌目（Xanthomonadales）、梭狀芽胞桿菌目（Clostridiales）、細(xì)鏈孢菌目（Catenulisporales）和Armatimonadales 4個(gè)目，黃色單胞菌科（Xanthomonadaceae）、細(xì)鏈孢菌科（Catenulisporaceae）和梭狀芽胞桿菌科（Clostridiaceae）等3個(gè)科，、細(xì)鏈孢菌屬、、羅河桿菌屬和5個(gè)屬。野生甘松組別中起到重要作用的內(nèi)生微生物物種包括浮霉菌門（Planctomycetes），Phycisphaerae綱，根瘤菌目（Rhizobiales）和Phycisphaerales目，拜葉林克氏菌科（Beijerinckiaceae）、產(chǎn)堿桿菌科（Alcaligenaceae）、Phycisphaeraceae和生絲單胞菌科（Hyphomonadaceae）4個(gè)科，弗蘭克氏菌屬、、r 3個(gè)屬。

4 討論

高通量測(cè)序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境[4]、食品[15]、作物培植[9,12,16]以及藥用植物[3,5-7,10-11]等微生物群落的多樣性研究中。本實(shí)驗(yàn)首次運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)甘松的仿野生栽培品和野生品的根際及內(nèi)生細(xì)菌菌群進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

圖15 野生甘松和仿野生栽培甘松內(nèi)生優(yōu)勢(shì)細(xì)菌LEfSe分析

甘松是青藏高原高寒草甸重要的特有種之一，在保護(hù)青藏高原高寒生態(tài)系統(tǒng)方面具有重要的作用。在甘松的根際細(xì)菌與內(nèi)生細(xì)菌群落中，優(yōu)勢(shì)促生菌的功能主要是促進(jìn)根際土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)植物的抗環(huán)境脅迫能力和對(duì)病原微生物的抵抗力。

仿野生栽培甘松和野生甘松的優(yōu)勢(shì)促生菌主要分布在根瘤菌目、鞘脂桿菌目、鞘脂單胞菌目、慢生根瘤菌科、酸桿菌科等。其中，根瘤菌目中的部分細(xì)菌具有固氮功能[8]，鞘脂桿菌目中的部分細(xì)菌可參與鐵代謝以及少量的鉀和硫的代謝，影響植物的生理代謝，增強(qiáng)植物抗病和抗蟲能力[17-22]。鞘脂桿菌目中的部分細(xì)菌因能產(chǎn)生熱休克蛋白，可提高植物的耐寒性、耐熱性和耐旱性[23-25]。酸桿菌科功能的研究比較少，但其在生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用，有助于將腐殖質(zhì)中的有機(jī)物轉(zhuǎn)化為土壤中的養(yǎng)分，主動(dòng)與植物相互作用，起到促進(jìn)植物生長(zhǎng)的細(xì)菌作用，以及產(chǎn)生胞外多糖，支持細(xì)菌粘附到根表面等[26]。

仿野生栽培甘松根際細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群有假諾卡式菌目、Solirubrobacterales和微單孢菌目等3個(gè)目，假諾卡式菌科、微單孢菌科和丙酸桿菌科等6個(gè)科；內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群有黃色單胞菌目、梭狀芽胞桿菌目、細(xì)鏈孢菌目和Armatimonadales等4個(gè)目，黃色單胞菌科、細(xì)鏈孢菌科和梭狀芽胞桿菌科等3個(gè)科，相對(duì)豐度顯著高于野生甘松。這些差異菌群可能是影響仿野生甘松植物生長(zhǎng)的主要細(xì)菌群落，例如細(xì)鏈孢菌科菌群是影響重組植物根際微生物共生網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵，為根部提供了更多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[27]；屬的放線菌可抑制植物病原體在根際的生長(zhǎng)、分解并利用土壤中的有機(jī)質(zhì)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生[28]。

野生甘松根際細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群有β-變形桿菌綱、Solibacteres綱、芽孢桿菌綱和豐祐菌綱等4個(gè)綱，伯克霍爾德氏菌目、黏球菌目、立克次氏體目、Solibacterales目等8個(gè)目，Solibacteraceae、多囊粘菌科、亞硝化單胞菌科等8個(gè)科；內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群有根瘤菌目和Phycisphaerales2個(gè)目，拜葉林克氏菌科、產(chǎn)堿桿菌科、Phycisphaeraceae和生絲單胞菌科等4個(gè)科，弗蘭克氏菌屬、、等3個(gè)屬，相對(duì)豐度顯著高于仿野生人工栽培甘松。這些差異菌群是甘松植物適應(yīng)青藏高原高寒的惡劣環(huán)境的重要菌群。例如弗蘭克氏菌屬可顯著提高在退化的土壤中移栽后植株的生長(zhǎng)、生物量、莖根氮含量和成活率[29]；屬為很強(qiáng)的甲基營(yíng)養(yǎng)性菌，可促進(jìn)植物的增殖、影響種子萌發(fā)和根系生長(zhǎng)，幫助植物抵抗水分脅迫及幫助保護(hù)植物免受干燥和過(guò)度輻射等惡劣環(huán)境的影響[30]。

這些差異菌群可能是影響仿野生人工栽培甘松與野生甘松藥材品質(zhì)差異的主要細(xì)菌群落，而相同的優(yōu)勢(shì)促生菌是保持其品質(zhì)一致的主要細(xì)菌群落，后續(xù)研究應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注。同時(shí)，課題組也在對(duì)移栽后的仿野生甘松種子與野生甘松種子育苗、移栽、仿野生繁育、藥材品質(zhì)進(jìn)行系列對(duì)比研究。課題后續(xù)將圍繞藥材品質(zhì)一致性評(píng)價(jià)，篩選優(yōu)化出甘松仿野生栽培所需的核心功能微生物混合菌群，并通過(guò)分離出的細(xì)菌菌群篩選對(duì)甘松植物生長(zhǎng)的影響，有針對(duì)性地改良仿野生培育甘松土壤、調(diào)節(jié)仿野生繁育品的微生物環(huán)境，為開(kāi)發(fā)出提高甘松藥材品質(zhì)的生物菌肥提供重要的研究基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Community structure and diversity analysis of rhizosphere bacterial ofand endophytic bacteria in medicinal parts based on high-throughput sequencing technology

LI Ying1, 2, 3, ZHONG Hai-rong2, 4, LI Yi-song1, WEIZE Ri-sha3,5, LI Wen-bing2, 3, 6, LIU Yuan2, 3, 6

1. College of Pharmacy, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China 2. Sichuan Provincial Qiang-Yi Medicinal Resources Protection and Utilization Technology and Engineering Laboratory, Chengdu 610225, China 3. Key Laboratory of Tibetan Plateau Ethnic Medicinal Resources Protection and Utilization, National Ethnic Affairs Commission of China, Chengdu 610225, China 4. Sichuan College of Traditional Chinese Medicine, Mianyang 621000, China 5. The Second People’s Hospital of Liangshan Yi Autonormous Prefecture, Xichang 615000, China 6. Ethnic Medicine Institute, Southwest Minzu University, Chengdu 610225, China

To analyze and compare the population composition, richness, diversity and difference in rhizosphere and endophytic bacteria of the wild and wild imitating cultivated.The 16S rDNA V4-V5 region of rhizosphere bacteria in soil and endophytic bacteria in roots and rhizomes ofthe wild and wild imitating cultivatedwas sequenced by using the Illumina Miseq second-generation high-throughput sequencing technology, and the related biological information was also analyzed.The genome of each sample was sequenced by 16S, and all sequences of bacterial community were OUT classified at 97% similar level, respectively. A total of 22 phyla, 38 classes, 69 orders, 119 families, 254 genera, and 268 species were detected in the rhizosphere bacteria of. And there were 16 phyla, 29 classes, 60 orders, 107 families, 199 genera, and 145 species in rhizosphere bacteria of. The common sequences of rhizosphere and endophytic bacterial communities were 498 and 177, respectively. The comprehensive proportions of PC1 and PC2 groups in principal component analysis were close to 70% and 60%, respectively. Among them, Proteobacteria, Actinobacteria, Acidobacteria and Bacteroidetes ranked the top four in the order of abundance, while there were some differences in the categories and relative abundance of other groups.The main growthpromoting phylums of wild and wild imitating cultivatedmay be mainly concentrated in Proteobacteria, Actinobacteria, Acidobacteria and Bacteroidetes, from which the core functional microorganism mixed flora can be screened out. These results can play a theoretical guiding significance for improving the soil microbial community of wild imitating cultivated

DC.; rhizosphere bacteria; endophytic bacteria; community structure; diversity

R282.2

A

0253 - 2670(2022)03 - 0835 - 13

;10.7501/j.issn.0253-2670.2022.03.024

2021-09-06

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC1706101）；四川省科技計(jì)劃應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目（2020YJ0099）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金研究類項(xiàng)目（2018NQN13）

李 瑩（1982—），女，吉林伊通，漢族，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槊褡逅幤贩N與品質(zhì)評(píng)價(jià)研究。E-mail: liying@swun.cn

劉 圓（1968—），女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事民族藥品種、品質(zhì)評(píng)價(jià)及新藥資源保護(hù)與利用研究。Tel: (028)85528812 E-mail: 499769896@qq.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]