王敏存，賀琪珺，周燕子，陳定芳，楊學斌，李 萍，李海英，黃 勝，鄧凱文，潘 雪*，賀福元, 4, 6*

丹膝顆粒組成藥味UPLC指紋圖譜的1次穩(wěn)態(tài)投料量研究

王敏存1, 2，賀琪珺4, 5，周燕子1, 2，陳定芳1, 2，楊學斌1, 2，李 萍1, 2，李海英1, 2，黃 勝3，鄧凱文4, 5，潘 雪1, 2*，賀福元1, 2, 4, 6*

1. 湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410208 2. 中藥成藥性與制劑制備湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208 3. 九芝堂股份有限公司，湖南 長沙 410008 4. 湖南中醫(yī)藥大學 中醫(yī)藥超分子機理與數(shù)理特征化實驗室，湖南 長沙 410208 5. 湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007 6. 中藥藥性與藥效國家中醫(yī)藥管理局重點實驗室，湖南 長沙 410208

建立丹膝顆粒組成藥味的UPLC指紋圖譜，并運用總量統(tǒng)計矩、信息熵和信息量及1次投料量數(shù)學模型，計算出穩(wěn)態(tài)1次投料量，建立動態(tài)中藥成分群的穩(wěn)態(tài)性質量提取方法。采用UPLC法，色譜柱為Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫；體積流量為0.4 mL/min；240 nm UV檢測；柱溫為30 ℃；進樣量為3 μL。建立丹參、牛膝、川芎等12味丹膝顆粒組成藥味的UPLC指紋圖譜，采用總量統(tǒng)計矩、信息熵和信息量分析方法獲得指紋圖譜的動態(tài)性參數(shù)，并根據(jù)遺傳統(tǒng)計學原理獲得單味藥材及全方的1次投料量，指導工業(yè)化大生產，獲得成分穩(wěn)態(tài)的丹膝顆粒。丹膝顆粒12味組成藥味的平均總量統(tǒng)計矩零、一、二階矩、信息熵、信息量分別為6.56×104、13.36、50.71、5.75、3.59×105；其中以桑寄生藥材信息量的RSD最大，以川芎藥材的RSD最小，平均為24.51%；按單味藥材投料，據(jù)全方累積信息量的RSD計算出1次投料量為2.13 kg，按全方的比例投料，全方1次穩(wěn)態(tài)投料量為335.35 kg，遠遠大于《中國藥典》2020年版規(guī)定。丹膝顆粒組成藥味的指紋圖譜動態(tài)性可用總量統(tǒng)計矩、信息熵、信息量進行分析，據(jù)此可獲得穩(wěn)態(tài)的一次投料量，據(jù)此投料生產可保證丹膝顆粒質量的穩(wěn)定。

丹膝顆粒；指紋圖譜；總量統(tǒng)計矩；超分子“氣析”理論；1次穩(wěn)態(tài)投料量

丹膝顆粒由丹參、牛膝、天麻、牡丹皮、赤芍、川芎、地黃、淫羊藿、桑寄生、梔子、決明子、火麻仁共12味藥材組成，具有養(yǎng)陰平肝、熄風通絡、清熱除煩功效；用于中風病中經絡恢復期瘀血阻絡兼腎虛證，癥見半身不遂、口舌歪斜、舌強語蹇、偏身麻木、頭暈目眩、腰膝酸軟等，腦梗死恢復期見上述諸癥狀者[1]。該方臨床療效確切，但基礎研究薄弱，為了提升該產品的科技含量，進行二次開發(fā)和有效組分中藥的研制，在進行藥效學研究前需摸清該方的成分動態(tài)變化規(guī)律；為了生產出質量穩(wěn)定均一顆粒劑，需對藥材飲片的指紋圖譜和穩(wěn)態(tài)性提取工藝中的1次投料量進行研究，以便控制該顆粒劑的質量穩(wěn)定均一性。

中藥為生物巨復超分子體，在自然界的生物進化過程中，生命體通過自組織、自組裝、自識別與自復制，在眾多小分子模板基礎上進行超分子主體結構的合成，組成超分子，最終構成整個生物世界，生物體為各種形式的超分子體，中藥為其一員[2]。人體同樣是自然界生物體系統(tǒng)的巨復超分子體，擁有各種層次“印跡模板”空間孔穴通道結構，亦超分子主體，與外界發(fā)生聯(lián)系；中藥對人體作用而產生效應就是基于生物界這種超分子“印跡模板”主客體選擇性作用的結果[3]。中藥成分簇是這種超分子“印跡模板”作用的客體聚集體，受生長環(huán)境和生物遺傳多樣性影響，隨域隨種隨株變化而變化，其質量處于動態(tài)的遺傳統(tǒng)計學變化之中。與中藥材及其制劑質量相關的一切關系總和為其質量屬性，受藥材基原、道地性、采收季節(jié)、入藥部位、產地加工、炮制技術等環(huán)境固有因素影響[4]，最終在指紋圖譜上體現(xiàn)為提取物成分的種類和含量的變化上；受生物遺傳多態(tài)性影響，可按Hardy-Weinberg平衡的群體質量的生物統(tǒng)計學原理控制[5]。環(huán)境固有和遺傳多樣性影響都會反映到中藥成分的指紋圖譜特征屬性的變化上；可采用客體成分簇的總量統(tǒng)計矩參數(shù)、信息熵和信息量進行動態(tài)性評價，并根據(jù)其RSD獲得穩(wěn)態(tài)1次投料量進行質量統(tǒng)計遺傳學控制，實現(xiàn)中藥質量的穩(wěn)定均一[6]。

本實驗采用中藥指紋圖譜的總量統(tǒng)計矩、信息熵和信息量進行成分印跡性的動態(tài)評價，獲得多批次樣本間的RSD，再采用Hardy-Weinberg平衡的1次投料量公式計算出穩(wěn)態(tài)性投料量，以指導實際工業(yè)化生產，獲得質量穩(wěn)態(tài)性丹膝顆粒制劑。

1 實驗原理

1.1 總量統(tǒng)計矩分析法和信息熵理論的基本原理

總量統(tǒng)計矩分析法是運用統(tǒng)計矩原理定性定量表征中藥指紋圖譜的分析方法[7-9]。該法將中藥指紋圖譜色譜峰的響應曲線轉化成正態(tài)分布概率密度函數(shù)曲線，先獲得單個色譜峰的統(tǒng)計矩參數(shù)，再利用統(tǒng)計矩的加合性獲得總量零階矩（AUCT）、總量一階矩（MCRTT）、總量二階矩（VCRTT）3個參數(shù)來反映整張指紋圖譜的特征?？偭苛汶A矩為曲線下的個色譜峰面積總和，按公式（1）計算；總量一階矩MCRTT，為個色譜峰的平均保留時間，按公式（2）計算；總量二階矩VCRTT為個色譜峰的平均保留時間方差，按公式（3）計算；其中AUCT可用于對來自于中藥的成分組成進行定量分析，表征整體成分的含量變化；MCRTT、VCRTT2個參數(shù)可用于中藥指紋圖譜的定性分析，表征成分組成（構成比）發(fā)生的變化，3個參數(shù)就能定性定量地分析1張指紋圖譜的特征，反映出成分的動態(tài)變化規(guī)律。

AUCT＝A（1）

＝

Aiλi

/

Ai

（2）

＝A(σ2＋λ2/A－（3）

A表示第峰的峰面積，λ表示第峰的保留時間，σ表示第峰的保留時間標準差，共有個色譜峰

信息熵是離散值的概率性表達，中藥材指紋圖譜上每個峰對應1個化學成分，中藥成分復雜多樣，每個化學成分可看作1個離散信息元，峰的強度即表明其化學信息顯現(xiàn)的概率，且此概率受色譜條件、成分相互作用等的綜合影響，因此中藥指紋圖譜色譜峰的出峰狀態(tài)可用信息熵和信息量進行表征[10-12]，信息熵表征指紋圖譜所攜帶成分的信息單元多少，信息量表示指紋圖譜的信息量大小。

中藥指紋圖譜的色譜峰的“出現(xiàn)”與“不出現(xiàn)”可用信息熵（ΔSe）表示，反映1個體系的混雜程度，按公式（4）計算；而信息量（ΔS）要在特征峰信息熵的基礎上乘以這一色譜條件下的總面積T，其中信息量按公式（5）計算。

ΔSe＝?(1/ln2)wlnw（4）

ΔS＝?(T/0ln2)wlnw（5）

w為第峰的峰面積百分比，為色譜峰的總峰數(shù)，0為總含量或單位投料量，T為總響應面積

因此可用中藥指紋圖譜的總量統(tǒng)計矩參數(shù)及信息熵、信息量來表征指紋圖譜的動態(tài)特征，分析各批次樣本的差異性。

1.2 穩(wěn)態(tài)性1次投料的基本原理

中藥材多以動植物入藥，來源于自然界，具生物多樣性，在環(huán)境（沒有選擇、突變、遷移和遺傳漂變）穩(wěn)定的情況下其成分呈多態(tài)性，但宏觀上應遵循Hardy-Weinberg群體平衡定律[13-14]，即當中藥的生長環(huán)境穩(wěn)定后，經過相當長的時間，其遺傳基因變異頻率與基因型頻率每代保持不變，中藥材的群體整體質量處于穩(wěn)定。由于基因的變異頻率可通過中藥有效成分群指紋圖譜質量屬性的變化得以反映，因此測定中藥有效成分群指紋圖譜質量屬性信息，按生物統(tǒng)計學求算獲得1次投料單元樣本數(shù)目，乘上單元重量就可以得到1次總投藥量[15]。對于某一產地中藥材的加工飲片，當大于一定量的樣本投料量投料進行生產時，其成分處于Hardy-Weinberg平衡的穩(wěn)態(tài)性質量之中，其指紋圖譜的總量統(tǒng)計矩和信息參數(shù)就處于穩(wěn)定，若以大于此量進行勾兌，則中藥成分指紋圖譜的特征信息量所體現(xiàn)的差異被勾兌消失，質量處于穩(wěn)定均一之中，若以小于此量進行勾兌，則中藥成分指紋圖譜特征信息量差異處于波動之中，其批間成分質量在一定的上下限進行波動，因此中藥成分的波動上下限與投料量相關[16]。以信息量為橫坐標，各信息出現(xiàn)的頻率為縱坐標，得到1張信息量——頻率近似正態(tài)分布曲線，運用統(tǒng)計學原理，則其穩(wěn)態(tài)時的投料樣本數(shù)按公式（6）計算。

|ΔS,i－|/(/1/2)≥t,n－1（6）

同時考慮到II型假陰性錯誤概率，則式（6）可轉化為式（7）。

1/2≥(t,n－1＋)·σ/|ΔS,i－| （7）

為投料樣本數(shù)，也可為測試“單位”，α,n－1為界值（＝－1）時的檢驗界值，β為犯II型假陰性錯誤概率對應的可信限，ΔS為信息量均數(shù)，σ為信息量方差，也可為平均分子連接性指數(shù)、總量統(tǒng)計矩參數(shù)及各種物理參數(shù)等

按當＝0.05，＝0.05（t,n－1＋μ＝10.8）， |ΔSq,i－|≤·10%時，也就是置信系數(shù)為0.05，質量控制在有效期含量規(guī)定內（制劑生產過程中一般認為藥物變化的差值不得低于原值的10%時，其質量是穩(wěn)定的），因此可變?yōu)楣剑?）。

≥(108σ/)2＝(108 RSD)2（8）

故一次穩(wěn)態(tài)投料量為公式（9）。

≥0＝(108 RSD)20（9）

因此，只要測出同一產地或多個產地中藥指紋圖譜總量統(tǒng)計矩、信息熵和信息量的變異系數(shù)RSD，可確定單味藥味的穩(wěn)態(tài)投料量，根據(jù)處方的比例計算整個復方的總穩(wěn)態(tài)投料量（）。

≥1A/B＋2A/B＋……＋BA/B（10）

為處方中藥味的個數(shù)，處方質量為1、2、3、…、B；首先通過各飲片指紋圖譜信息量的變異系數(shù)計算出各飲片的穩(wěn)態(tài)投料量為1、2、3、…、A。A為各藥味的穩(wěn)態(tài)投料量最大者，該藥味的處方用量為B。以A為基準，按處方比例依次放大其他藥味的1次穩(wěn)態(tài)投料量，同時與按單一藥味計算出的1次穩(wěn)態(tài)投料量比對，若按處方比例的1次穩(wěn)態(tài)投料量小于單一藥味的1次穩(wěn)態(tài)投料量，應以單一藥味計算出的1次穩(wěn)態(tài)投料量按比例放大到全方后，再得到全方的穩(wěn)態(tài)投料量，按1次穩(wěn)態(tài)投料量公式就能獲得整體質量穩(wěn)定的總樣本大小，亦統(tǒng)計遺傳學上特征參數(shù)穩(wěn)定1次勾兌投料量，當可實現(xiàn)中藥質量的穩(wěn)定。

2 儀器與材料

2.1 儀器

Acquity UPLC H-Class型超高效液相色譜儀，美國沃特世公司；RE-2000A旋轉蒸發(fā)器，鞏義市中天儀器科技有限公司；ZDHW調溫電熱套，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；YHC-A6英衡精密電子秤，哈爾濱眾匯衡器有限公司；MS205DU電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；H1850R型臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；EKup-II-20T超純水機，長沙市科臨電子科技有限公司。

2.2 試劑與藥材

對照品購自上海源葉生物科技有限公司，質量分數(shù)均大于98%，包括芍藥苷（批號X12A8C33672）、丹參酮IIA（批號Y16M10C88487）、丹酚酸B（批號P20J10F93457）、天麻素（批號T10M9F55562）、阿魏酸（批號L03A9D57744）、蛻皮激素（批號TO2A9F57640）、丹皮酚（批號L15D9D77791）、橙黃決明素（批號P07S11F122784）、川芎嗪（批號KJ0622CA14）、大黃酚（批號T29D10F107203）、淫羊藿苷（批號T05D9B76755）、槲皮素（批號S14J10Y79596）、梔子苷（批號C01J10Y91727）、梓醇（批號Y26F11Y17148）。甲醇（批號20055094）、乙腈（批號20055009）為色譜純，美國Tedia試劑公司；其他試劑為分析純；水為超純水。

丹膝顆粒處方：丹參15 g，牛膝12 g，天麻3 g，牡丹皮10 g，赤芍12 g，川芎5 g，地黃12 g，淫羊藿9 g，桑寄生12 g，梔子6 g，決明子6 g，火麻仁6 g。丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參Bge的干燥根及根莖；牛膝為莧科牛膝屬植物牛膝Bl.的干燥根；天麻為蘭科天麻屬植物天麻Bl.的干燥塊莖；牡丹皮為毛茛科芍藥屬植物牡丹Andr.的干燥根皮；赤芍為毛莨科芍藥屬植物芍藥Pall.的干燥根；川芎為傘形科藁本屬植物川芎Hort.的干燥根；地黃為玄參科地黃屬植物地黃Libosch.的干燥塊根；淫羊藿為小檗科淫羊藿屬植物淫羊藿Maxim.的干燥葉；桑寄生為桑寄生科鈍果寄生屬植物桑寄生(DC.) Danser的干燥帶葉莖枝；梔子為茜草科梔子屬植物梔子Ellis的干燥成熟果實；決明子為豆科決明屬植物決明L.干燥成熟種子；火麻仁為?？拼舐閷僦参锎舐長.的干燥成熟種仁。上述藥材每產地各5批，購于湖南中醫(yī)藥大學含浦校區(qū)周邊藥店及由本課題組成員于原產地購買，均由湖南中醫(yī)藥大學藥學院中藥炮制教研室石繼連教授按《中國藥典》2020年版一部有關項下要求進行鑒別，均符合規(guī)定，具體信息見表1。

3 方法與結果

3.1 溶液的制備

3.1.1 丹膝顆粒全方供試品溶液 取1/3處方量藥材，即丹參5 g，牛膝3 g，天麻1 g，牡丹皮3.3 g，赤芍4 g，川芎1.67 g，地黃4 g，淫羊藿3 g，桑寄生4 g，梔子2 g，決明子2 g，火麻仁2 g，丹參、牛膝、牡丹皮、川芎、火麻仁粉碎成粗粉，加10倍量的70%乙醇回流提取2次，每次1 h，濾過，濾液合并，回收乙醇并濃縮至生藥質量濃度為1 g/mL（60 ℃）的清膏，備用；上述各藥渣及其余生地黃等7味飲片加10倍量水煎煮2次，第1次1.5 h，第2次1 h，合并濾液，濾過，濾液濃縮至生藥質量濃度為1 g/mL（60 ℃）的清膏，與上述各清膏合并，濃縮至生藥質量濃度為1.5 g/mL（60 ℃）的清膏；取2 mL，揮干溶劑，加入50%甲醇復溶，定容至5 mL，超聲10 min，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，得全方供試品溶液。

表1 丹膝顆粒組成藥味的產地信息

Table 1 Origin information of composition of function ingredients Danxi Granules

藥材產地 1～5批6～10批11～15批 丹參山西運城市河北保定市山東臨沂市 牛膝河南武陟縣河南溫縣內蒙古赤峰市 天麻云南昭通市貴州雷山縣四川青川縣 牡丹皮安徽亳州市河南洛陽市安徽銅陵市 赤芍河北赤城縣河北遷西縣內蒙古呼倫貝爾市 川芎四川崇州市四川都江堰四川彭州市 地黃河南溫縣陜西咸陽市河南武陟縣 淫羊藿陜西寧強縣甘肅徽縣甘肅渭源縣 桑寄生廣西欽州市廣西玉林市廣西南寧市 梔子浙江臺州市湖南瀏陽市江西樟樹市 決明子安徽合肥市四川省廣元市安徽蚌埠市 火麻仁山東泰安市廣西巴馬縣山西陽曲縣

3.1.2 單味飲片供試品溶液 取單味飲片各10 g[6,15]，丹參、牛膝、牡丹皮、川芎、火麻仁粉碎成粗粉，加10倍量的70%乙醇后同上法提??；上述5味飲片藥渣與其余生地黃等各7味飲片加10倍量水后同上法提?。桓黠嬈瑸V液及濾液合并液同上法濃縮至生藥質量濃度為1.5 g/mL（60 ℃）的清膏，取2 mL，揮干溶劑，加入50%甲醇復溶，定容至5 mL，超聲10 min，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，得各單味飲片供試品溶液。

3.1.3 混合對照品溶液 取芍藥苷、丹參酮IIA、丹酚酸B、天麻素、阿魏酸、蛻皮激素、丹皮酚、橙黃決明素、川芎嗪、大黃酚、淫羊藿苷、梔子苷、槲皮素、梓醇適量，精密稱定置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成各對照品儲備液。分別精密吸取上述對照品儲備液適量，充分混合后加甲醇定容，制成上述對照品質量濃度分別為0.081、0.115、0.123、0.547、0.043、0.108、0.263、0.255、0.448、0.408、0.255、0.333、0.127、0.553 mg/mL的混合對照品溶液，過0.22 μm微孔濾膜，即得混合對照品溶液。

3.2 色譜條件

Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為0.1%磷酸水溶液-乙腈；梯度洗脫：0～4 min，0～4.5%乙腈；4～8 min，4.5%～9.0%乙腈；8～10 min，9%～11%乙腈；10～12 min，11%～14%乙腈；12～16 min，14%～18%乙腈；16～19 min，18%～22%乙腈；19～24 min，22%～27%乙腈；24～29 min，27%～32%乙腈；29～40 min，32%～45%乙腈；40～45 min，45%～63%乙腈；45～50 min，63%～81%乙腈；50～53 min，81%～90%乙腈；53～55 min，90%～0乙腈；柱溫30 ℃；體積流量0.4 mL/min；全波長掃描（190～400 nm），240 nm下峰面積較大，峰數(shù)最多，故選擇檢測波長為240 nm；進樣量3 μL。

3.3 方法學考察

3.3.1 精密度試驗 取表1中每味藥材第1個產地中第1批次飲片組成的復方，按“3.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“3.2”項色譜條件，連續(xù)進樣6次，根據(jù)所得指紋圖譜計算總量統(tǒng)計矩、信息熵、信息量參數(shù)，其峰數(shù)的RSD為0.47%，總量零階矩的RSD為0.35%，總量一階矩的RSD為0.16%，總量二階矩的RSD為0.46%，信息熵的RSD為0.09%，信息量的RSD為0.39%，結果表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜的檢測要求。

3.3.2 重復性考察 取表1中每味藥材第1個產地中第1批次飲片組成的復方6份，按“3.1.1”項下方法平行制備供試品溶液6份，按“3.2”項色譜條件測定指紋圖譜，計算總量統(tǒng)計矩、信息熵、信息量參數(shù)，其峰數(shù)的RSD為2.92%，總量零階矩的RSD為1.47%，總量一階矩的RSD為1.28%，總量二階矩的RSD為1.12%，信息熵的RSD為0.66%，信息量的RSD為1.25%，表明該試驗重復性良好。

3.3.3 穩(wěn)定性試驗 取表1中每味藥材第1個產地中第1批次飲片組成的復方，按“3.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“3.2”項色譜條件分別在制備后0、2、4、6、8、12、24 h進樣，記錄色譜圖，計算總量統(tǒng)計矩、信息熵、信息量參數(shù)，其峰數(shù)的RSD為1.49%，總量零階矩的RSD為0.24%，總量一階矩的RSD為0.16%，總量二階矩的RSD為0.94%，信息熵的RSD為0.28%，信息量的RSD為0.36%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

3.4 12味藥材及丹膝顆粒全方指紋圖譜的建立

取“3.1”項下各供試品溶液，按“3.2”項下色譜條件進樣測定，采用國家藥典委員會《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012.130723版本》軟件進行圖譜處理，每味飲片和全方選取1個批次的圖譜進行展示，分別標記為S2～S14。根據(jù)《中國藥典》2020年版確定丹參（丹參酮IIA、丹酚酸B）、牛膝（蛻皮激素）、天麻（天麻素）、牡丹皮（丹皮酚）、赤芍（芍藥苷）、川芎（阿魏酸、川芎嗪）、地黃（梓醇）、淫羊藿（淫羊藿苷）、桑寄生（槲皮素）、梔子（梔子苷）、決明子（橙黃決明素、大黃酚）藥材中的對照品，結果見圖1。

圖1 1個批次的丹膝顆粒單味藥材飲片及全方的UPLC指紋圖譜

3.5 15批丹膝顆粒的飲片及制劑的UPLC指紋圖譜的總量統(tǒng)計矩參數(shù)及信息熵分析

按總量統(tǒng)計矩法分析獲得其總量統(tǒng)計零、一、二階矩參數(shù)和信息熵、信息量，其均值及RSD列于表2?？芍?，零階矩、信息量的平均值RSD＞10%，說明這2個參數(shù)能作為中藥指紋圖譜的定量分析指標，反映整體成分的含量變化；而一階矩、二階矩和信息熵的平均值RSD＜10%，說明這3個參數(shù)可用于中藥指紋圖譜的定性分析，中藥整體受控于超分子“印跡模板”作用機制，來源于不同產地的同一藥材成分構成比的變化符合要求，即在宏觀上表現(xiàn)出整體性質的穩(wěn)定。

根據(jù)各單味飲片信息量的RSD大小、操作單位及處方用量，按穩(wěn)態(tài)性1次投料公式計算得各12味飲片及全方特征參數(shù)的1次穩(wěn)態(tài)投料量，結果列于表3。對比各特征參數(shù)的1次穩(wěn)態(tài)投料量，按累積信息量的RSD變化，全方需投2.13 kg，川芎的1次穩(wěn)態(tài)投料量最?。?.03 kg），而桑寄生1次穩(wěn)態(tài)投料量為最大（30.58 kg），也就是只要按桑寄生信息量的1次穩(wěn)態(tài)投料量投料，其它參數(shù)會更穩(wěn)定。以桑寄生信息量的1次穩(wěn)態(tài)投料量作為基準，再按處方比例依次放大其他藥味及全方的1次穩(wěn)態(tài)投料量，結果發(fā)現(xiàn)天麻的1次穩(wěn)態(tài)投料量最?。?.32 kg），而丹參最大（46.58 kg），全方需投335.35 kg，雖遠遠大于累積的全方1次投料量（2.13 kg），但能保證藥物成分的均一性與穩(wěn)定性。

4 討論

本研究采用UPLC法建立了丹膝顆粒各單味飲片及全方的指紋圖譜，在色譜條件探索過程中，流動相研究了水-甲醇、水-乙腈、0.05%甲酸水溶液-乙腈、0.05%醋酸水溶液-乙腈、0.1%磷酸水溶液-乙腈，發(fā)現(xiàn)0.1%磷酸水溶液-乙腈條件下，色譜圖基線平穩(wěn)，各色譜峰分離較好，出峰較多，峰形較好，故流動相選用0.1%磷酸水溶液-乙腈；進樣量考察了1、2、3、4、5 μL，發(fā)現(xiàn)進樣量為3 μL時，峰數(shù)較多，峰面積較大，故選擇了進樣量為3 μL；柱溫考察了25、30、35 ℃，發(fā)現(xiàn)柱溫為30 ℃時，色譜峰分離度較好，出峰時間適中，故柱溫選擇了30 ℃。體積流量考察了0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL/min，發(fā)現(xiàn)體積流量為0.4 mL/min時，出峰時間適中，洗脫效果較好，故體積流量選擇了0.4 mL/min。

表2 15批丹膝顆粒單味飲片及全方UPLC指紋圖譜的總量統(tǒng)計矩參數(shù)及信息熵、信息量及其RSD (,n = 15)

Table 2 Total statistical moment parameters and information entropy, information quantityand their RSD of UPLC fingerprint of 15 batches of medical herb in pieces and whole prescription of Danxi Granules (, n = 15)

樣品AUCT/(μV?s) (RSD/%)MCRTT/min (RSD/%)VCRTT/min2 (RSD/%)ΔSie/(μV?s)ΔSiq/(μV?s) 丹參(9.52±1.88)×104 (33.85)21.33±0.48 (14.33)50.24±12.65 (11.41)4.77±0.95(4.44±0.76)×105 牛膝(9.52±3.43)×103 (36.05)10.82±0.63 (5.86)106.69±15.65 (14.67)5.27±0.36(5.11±2.05)×104 天麻(9.39±2.29)×103 (24.37)5.93±0.29 (4.92)31.10±3.14 (10.10)5.33±0.25(5.05±1.43)×104 牡丹皮(7.99±1.73)×104 (21.71)15.04±0.79 (5.26)31.98±1.47 (4.60)5.65±0.09(4.52±1.05)×105 赤芍(8.49±1.16)×104 (13.65 )13.50±0.20 (1.51)22.62±1.32 (5.84 )4.23±0.14(3.60±5.93)×104 川芎(5.06±0.39)×104 (7.63)16.24±1.91 (11.78)105.10±27.02 (25.71)5.86±0.20(2.97±0.28)×105 地黃(3.88±1.31)×104(33.85)8.80±1.26 (14.33)26.74±3.05 (11.41)6.08±0.13(2.36±0.81)×105 淫羊霍(1.04±0.11)×105 (10.99 )18.94±1.54 (8.12)73.61±4.86 (6.60)6.54±0.12(6.80±0.68)×105 桑寄生(4.27±2.12)×104 (49.78 )14.39±2.23 (15.48 )30.88±4.51 (14.61)5.75±0.24(2.49±1.27)×105 梔子(1.83±0.20)×105(11.05)15.28±0.78 (5.15)38.23±5.02 (13.14)5.30±0.28(9.74±1.55)×105 決明子(7.41±1.15)×105 (15.52 )19.81±0.34 (1.73)40.70±1.62 (3.97 )5.80±0.14(4.30±0.69)×105 火麻仁(1.32±0.46)×104 (35.01)13.57±3.13 (23.10)101.40±26.15 (25.79 )6.08±0.18(8.00±2.71)×104 全方(6.71±0.87)×104 (13.00)15.45±0.34 (2.20)51.58±3.71 (7.19)6.22±0.07(4.18±0.56)×105 均值(單味藥材)(6.56±5.10)×104 (22.57)13.36±5.87 (5.99)50.71±32.64 (8.78)5.75±0.58(3.59±2.70)×105

表3 丹膝顆粒單味飲片及全方的1次穩(wěn)態(tài)投料量

Table 3 One-time steady-state feeding quantityof medical herb in pieces and whole prescription of Danxi Granules

名稱操作單位/g1次穩(wěn)態(tài)投料量/kg處方用量/g1次穩(wěn)態(tài)處方投料量/kg 丹參103.455.0046.58 牛膝1018.794.0037.26 天麻109.321.009.32 牡丹皮106.253.3331.02 赤芍103.164.0037.26 川芎101.031.6715.53 地黃1013.794.0037.26 淫羊霍101.183.0027.95 桑寄生1030.584.0037.26 梔子102.972.0018.63 決明子103.022.0018.63 火麻仁1013.392.0018.63 全方362.1336.00335.35

據(jù)信息量的變異系數(shù)RSD變化，計算出全方需投2.13 kg，川芎的1次穩(wěn)態(tài)投料量最?。?.03 kg），而桑寄生最大（30.58 kg），也就是只要按桑寄生的1次穩(wěn)態(tài)投料量投料，其它參數(shù)會更穩(wěn)定。以桑寄生信息量的1次穩(wěn)態(tài)投料量作為基準，再據(jù)處方比例依次放大其他藥味及全方的1次穩(wěn)態(tài)投料量，并與以單一藥味計算出的1次穩(wěn)態(tài)投料量對比，發(fā)現(xiàn)天麻按處方用的1次穩(wěn)態(tài)投料量小于單獨使用天麻計算出的1次穩(wěn)態(tài)投料量，故以單獨使用天麻的1次穩(wěn)態(tài)投料量按比例放大到全方后，再得到全方的穩(wěn)態(tài)投料量，這也是處方用天麻的1次穩(wěn)態(tài)投料量最小的原因，最終得到全方1次穩(wěn)態(tài)投料量為335.35 kg，各藥味的投料量依次為丹參46.58 kg，牛膝37.26 kg，天麻9.32 kg，牡丹皮31.02 kg，赤芍37.26 kg，川芎15.53 kg，地黃37.26 kg，淫羊藿27.95 kg，桑寄生37.26 kg，梔子18.63 kg，決明子18.63 kg，火麻仁18.63 kg，該投料量為保證制劑生產的最小投料量，雖遠遠大于《中國藥典》規(guī)定，若能以大于等于該最小投料量進行投料和工業(yè)化生產，則能保證藥物成分的均一性與穩(wěn)定性。

中藥客體成分受環(huán)境和遺傳雙重影響，成分具多樣性，從源頭上影響中藥提取物的質量穩(wěn)定均一，中藥提取工藝長期缺乏對中藥材遺傳基因多態(tài)性的認識[16-19]，沒有明確中藥材及復方的最小投料量是造成中藥有效成分群制劑質量不穩(wěn)的關鍵因素，也是以多少量實現(xiàn)勾兌必須解決的首要問題。測定中藥有效成分群指紋圖譜信息量的變異概率曲線，按統(tǒng)計學原理求得有效投料單元數(shù)量，乘上單元重量就可以得到總投料量，在大于總投料量的前提下投料進行中藥有效成分群的炮制、提取、勾兌，就能獲得中藥制劑群體Hardy-Weinberg平衡質量，以實現(xiàn)中藥質量的均一與穩(wěn)定。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典 [S]. 一部. 2020: 719.

[2] 賀福元, 周逸群, 鄧凱文, 等. 超分子化學對中醫(yī)藥理論的特殊影響 [J]. 中國中藥雜志, 2014, 39(8): 1534-1543.

[3] 賀玉婷, 樊啟猛, 周逸群, 等. 中藥毒性的研究現(xiàn)狀及其超分子“印跡模板”調控機制的探討 [J]. 中草藥, 2020, 51(21): 5638-5644.

[4] 賀福元, 周宏灝, 羅杰英, 等. 生物遺傳多態(tài)性規(guī)律揭示中藥材質量穩(wěn)定性規(guī)律的探討 [J]. 中草藥, 2008, 39(1): 2-6,12.

[5] 賀福元, 鄧凱文, 黃勝, 等. 中藥群體指紋圖譜信息量和一次投料量數(shù)學模型的建立及對大黃和魚腥草實驗研究 [J]. 中成藥, 2011, 33(8): 1292-1298.

[6] 李海英, 賀鵬, 樊啟猛, 等. 桃紅四物湯HPLC指紋圖譜的總量統(tǒng)計矩及一次穩(wěn)態(tài)投料量分析 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2019, 25(15): 37-43.

[7] 周晉. 指紋圖譜總量統(tǒng)計矩分析法的建立及對補陽還五湯的研究[D]. 長沙: 湖南中醫(yī)藥大學, 2006.

[8] 賀福元, 周宏灝, 鄧凱文, 等. 指紋圖譜的一種定性定量研究新方法: 總量統(tǒng)計矩分析法 [J]. 藥學學報, 2008, 43(2): 195-201.

[9] 李海英, 樊啟猛, 賀玉婷, 等. 金銀花、山銀花動態(tài)揮發(fā)性成分的質量控制 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2020, 26(22): 148-155.

[10] 朱志飛, 樊啟猛, 劉有志, 等. 基于信息熵最大化原則優(yōu)化經典名方身痛逐瘀湯UPLC指紋圖譜 [J]. 中草藥, 2020, 51(12): 3173-3179.

[11] 唐宇, 賀福元, 鄧凱文, 等. 中藥燃燒焓、信息熵及生物熵的穩(wěn)定性揭示其成分間的“虹勢性” [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2012, 27(4): 867-873.

[12] 朱志飛, 劉金玲, 樊啟猛, 等. 基于指紋圖譜段帶總量統(tǒng)計矩法和信息熵的桑源藥材成分比較分析研究 [J]. 中國中藥雜志, 2021, 46(10): 2547-2555.

[13] 張宏禮, 張鴻雁. 關于最大信息熵原理與群體遺傳平衡一致性的探討 [J]. 遺傳, 2006, 28(3): 324-328.

[14] 汪小龍, 袁志發(fā), 郭滿才, 等. 最大信息熵原理與群體遺傳平衡 [J]. 遺傳學報, 2002, 29(6): 562-564.

[15] 樊啟猛, 劉潤南, 賀鵬, 等. 經典名方單味藥材群體指紋圖譜信息熵及一次投料量研究 [J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2020, 31(4): 975-979.

[16] 劉文龍. 中藥材魚腥草株間的遺傳多樣性及其質量穩(wěn)定性控制研究 [D]. 長沙: 湖南師范大學, 2014.

[17] 劉紅宇, 賀福元, 羅杰英. 中藥(復方)成分提取動力學數(shù)學模型建立及粒徑對六味地黃湯中梓醇濃度的影響[J]. 中國藥房, 2009, 20(36): 2804-2807.

[18] 王海琴, 劉文龍, 賀福元, 等. 基于魚腥草ISSR擴增條帶信息熵的一次投料量研究 [J]. 中國中藥雜志, 2012, 37(3): 288-292.

[19] 任德權. 抓住機遇, 迎接挑戰(zhàn)——在中藥指紋圖譜和中藥工程會議上的報告 [J]. 中成藥, 2002, 24(1): 1-2.

Study on one-time steady-state feeding quantity of UPLC fingerprint of composition of function ingredients of Danxi Granules

WANG Min-cun1,2, HE Qi-jun4,5, ZHOU Yan-zi1,2, CHEN Ding-fang1,2, YANG Xue-bin1,2, LI Ping1,2, LI Hai-ying1,2, HUANG Sheng3, DENG Kai-wen4,5, PAN Xue1,2, HE Fu-yuan1,2,4,6

1. School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2. Key Laboratory of Druggability and Preparation Modification for Traditional Chinese Medicine of Hunan Province, Changsha 410208, China 3. Jiuzhitang Co., Ltd., Changsha 410008, China 4. Laboratory of Supramolecular Mechanism and Mathematic-Physics Characterization for TraditionalChinese Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 5. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China 6. Key Laboratory of Medicinal Properties and Efficacy of Traditional Chinese Medicine, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410208, China

To establish a UPLC fingerprint of composition of function ingredients of Danxi Granules (丹膝顆粒), and use total statistical moments, information entropy, information amount and one-time steady-state feeding quantity mathematical model, to calculate the one-time steady-state feeding quantity, and establish a steady-state quality extraction method for dynamic Chinese medicine component groups.UPLC method was adopted. The sample was separated on a chromatographic column of Acquity UPLC HSS T3 (100 mm × 2.1 mm, 1.8 μm) with acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution as mobile phase, gradient elution at a volume flow rate of 0.4 mL/min, 240 nm UV detection; The column temperature was 30 ℃; The injection volume was 3 μL. UPLC fingerprint of 12 Chinese medicine herbs of composition of function ingredients of Danxi Granules was established. The dynamic parameters of the fingerprints were obtained by total statistical moment, information entropy and information amount. The one-time steady-state feeding quantity of single-medicinal herb and complex preparation were obtained according to the principles of genetic statistics, which guided industrial production and obtained Danxi Granules with stable ingredients.The average total statistical zero, first and second moments, information entropy, and information amount of the 12 composition of function ingredients of Danxi Granules were 6.56 × 104, 13.36, 50.71, 5.75, 3.59 × 105respectively; Among them, the RSD of information amount of Chinese medicine herbswas the largest one, and the RSD ofwas the smallest one, with an average of 24.51%. According to single medicinal herb, the one-time steady-state feeding quantity calculated according to the RSD change of the accumulated information amount of the whole prescription was 2.13 kg. When one-time steady-state feeding quantity was 335.35 kg according to ratio of the whole prescription, which was far greater than that stipulated in Chinese Pharmacopoeia.The dynamics of the fingerprint of composition of function ingredients Danxi Granule can be analyzed by total statistical moment, information entropy, and information amount. According to this, one-time steady-state feeding quantity can be obtained, and stability of the quality of Danxi Granules can be guaranteed.

Danxi Granules; fingerprint; total statistical moment; supramolecularchromatography theory; one-time steady-state feeding quantity

R283.6

A

0253 - 2670(2022)03 - 0704 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.03.008

2021-08-27

國家自然科學基金（81874507）；國家自然科學基金（81803729）；湖南省自然科學基金項目（2021JJ80058）；湖南省中醫(yī)藥科研項目（2021078）；長沙市科技計劃項目（kq1907137）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項目（CX20210689）；湖南中醫(yī)藥大學校級科研基金（2019XJJJ024）

王敏存，女，碩士研究生，研究方向為中藥復方的生物有效性及其新制劑、新技術與新工藝的研究。Tel: (0731)88458225 E-mail: 13312587641@163.com

賀福元，教授，博士生導師，主要從事中藥藥理學、中藥藥劑學、中醫(yī)藥超分子與數(shù)理特征化的研究。Tel: (0731)85381372 E-mail: pharmsharking@tom.com

潘 雪，講師，從事中藥藥理學、中藥復方物質基礎及超分子化學研究。E-mail: 405465029@qq.com

[責任編輯 鄭禮勝]