孔維威 袁瑞奇 康源春 張玉亭 周舒浩 常曉超 劉洋洋

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，河南 鄭州 450002）

農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源是保障國(guó)家糧食安全和重要農(nóng)副產(chǎn)品有效供給的戰(zhàn)略性資源。2020年，國(guó)務(wù)院辦公廳出臺(tái)“關(guān)于加強(qiáng)農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用的意見”，提出開展系統(tǒng)收集保護(hù)，實(shí)現(xiàn)應(yīng)保盡保，要強(qiáng)化鑒定評(píng)價(jià)，提高利用效率等。2021年河南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳印發(fā)《河南省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源普查總體方案》，計(jì)劃利用3年時(shí)間在全省組織開展農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源普查，摸清河南省農(nóng)作物、畜禽、水產(chǎn)和食用菌種質(zhì)資源家底。2019年河南省食用菌各類品種生產(chǎn)量折合55億袋以上，鮮菇產(chǎn)量達(dá)到540.94萬(wàn)噸，產(chǎn)值397.70億元，產(chǎn)量和產(chǎn)值繼續(xù)居全國(guó)第一位[1]。出口創(chuàng)匯14.9億美元，占2019年全省農(nóng)產(chǎn)品出口額的69.63%[2]。

白靈側(cè)耳（Pleurotus tuoliensis）[3,4]商品名為白靈菇，是我國(guó)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)和明確原產(chǎn)地的品種，也是最早被列入我國(guó)植物新品種保護(hù)名錄（第六批）的食用菌品種（2005年5月20日農(nóng)業(yè)部令第51號(hào)公布施行）。2019年全國(guó)白靈側(cè)耳產(chǎn)量為5.7881萬(wàn)噸，比2018年增長(zhǎng)3.67%[1,5]。白靈側(cè)耳雖已人工栽培多年，但工廠化栽培菌株的農(nóng)藝性狀和商品性狀還有待改進(jìn)，原基誘導(dǎo)難、一致性低和生產(chǎn)周期較長(zhǎng)是目前產(chǎn)業(yè)發(fā)展遇到的主要瓶頸問題。因此，加快選育白靈側(cè)耳工廠化生產(chǎn)優(yōu)良性狀新品種是當(dāng)務(wù)之急。

菌株遺傳多樣性是育種改良的基礎(chǔ)。菌株遺傳多樣性分析的方法較多，張金霞等[6]研究發(fā)現(xiàn)白靈側(cè)耳的IGS1區(qū)域較保守，菌株間沒有多態(tài)性；IGS2區(qū)域較廣、變異多，是種內(nèi)遺傳多樣性分析和菌株鑒定的有效標(biāo)記區(qū)域，IGS2結(jié)合限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析，準(zhǔn)確性和可重復(fù)性好，是白靈側(cè)耳種內(nèi)遺傳多樣性和菌株鑒定鑒別的有效方法。本文廣泛收集河南省內(nèi)的白靈側(cè)耳菌株32個(gè)，采用拮抗反應(yīng)和IGS2-RFLP方法對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行分析，以期為雜交選育白靈側(cè)耳新品種的親本選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料見表1?，F(xiàn)保藏于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源環(huán)境研究所河南省食用菌種質(zhì)資源庫(kù)（Henan Mushroom Germplasm Resources Bank，HMGRB）。

表1 白靈側(cè)耳供試菌株

1.2 方法

（1）拮抗反應(yīng)。不同菌株間區(qū)別性鑒定采用拮抗法[7]。

（2）DNA提取。將低溫保存的菌種連續(xù)活化2次后接種于PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)10天，然后使用孔徑5 mm的打孔器打取10個(gè)菌種塊轉(zhuǎn)移至裝有100 mL PD液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，25 ℃下150 r/min培養(yǎng)7天。10 000 r/min離心收集菌絲，液氮速凍后-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。采用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒（上海生工生物公司）提取DNA。

（3）IGS2-PCR。擴(kuò)增體系采用2X高保真PCR Mix預(yù)混液（上海生工生物公司）和Primer各1.5μL，Template約25 ng，用ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。上游引物：5'-ACTGGCAGAATCAACCAGGTA-3'，下游引物：5'-ACCGCATCCCGTCTGAT-3'。反應(yīng)條件：94 ℃變性4 min；94 ℃變性1 min，56 ℃復(fù)

2 結(jié)果與分析

2.1 親和性反應(yīng)

不同菌株間存在拮抗反應(yīng)，交界處菌絲一般呈現(xiàn)隆起型、溝型和隔離型3種反應(yīng)類型。本試驗(yàn)結(jié)果表明，大部分白靈側(cè)耳菌株間都為隆起型，少部分菌株間是溝型，極少數(shù)出現(xiàn)隔離型的現(xiàn)象。Pt1、Pt5和Pt22這3個(gè)菌株相互間無(wú)拮抗反應(yīng)。

2.2 IGS2-PCR分析

由圖1可知，應(yīng)用IGS2片段的特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，不同酶對(duì)供試菌株的IGS2-PCR產(chǎn)菌株間IGS2片段大小不同，數(shù)量在2～8條之間。

圖1 白靈側(cè)耳供試菌株IGS2-PCR擴(kuò)增圖譜

2.3 IGS2-RFLP及聚類分析

用HpaII、RsaⅠ和HaeIII等3個(gè)限制性內(nèi)切物進(jìn)行酶切，結(jié)果（圖2）顯示每個(gè)菌株均存在3種酶的酶切位點(diǎn)，但酶切位點(diǎn)不同，各菌株電泳后產(chǎn)生的帶型圖譜也不同。3種限制性內(nèi)切酶酶切一共產(chǎn)生36個(gè)片段，其中有差異性的片段28個(gè)，占總帶數(shù)的77.8%。采用最遠(yuǎn)鄰法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建分子系統(tǒng)樹（圖3）。

圖2 白靈側(cè)耳不同菌株IGS2-RFLP 電泳圖譜

圖3 供試菌株的IGS2-RFLP聚類樹狀圖

基于HpaII酶切的電泳圖譜聚類分析結(jié)果為，在相對(duì)距離10下，可以將32個(gè)菌株分為3組，其中1、2、3、4、5、6、7、10、11、13、14、15、16、18、23、25、27、28、31、32號(hào)菌株為I組，9、17、19、20、22、24、26、29、30號(hào)菌株為II組，8、12、21號(hào)菌株為III組?；赗saⅠ酶切和HaeIII酶切的電泳圖譜聚類分析結(jié)果表明，這2個(gè)酶切后I組菌株與HpaII酶切的聚類結(jié)果完全一致，差別在于29號(hào)菌株是屬于II組（RsaⅠ酶切），還是III組（HaeIII酶切）。組內(nèi)各菌株的聚類關(guān)系也略有差異。

3 結(jié)論與討論

目前我國(guó)已選育出一些白靈側(cè)耳栽培種，其中通過國(guó)審的有4個(gè)品種。從子實(shí)體形態(tài)上主要分為掌狀、扇狀、匙狀、馬蹄狀等。由于各單位引種途徑不一，引種后又自行命名，造成名稱比較混亂，在河南省尤為嚴(yán)重。IGS序列是核糖體RNA（rRNA）的重要組成元件，包括IGS（intergenic sparer）1和IGS2 這2個(gè)區(qū)域[8]。IGS序列的多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，白靈菇和香菇不同菌株或不同品種之間存在多態(tài)性，可以用于菌株鑒別[6,9]。趙夢(mèng)然等[10]比較白靈側(cè)耳野生菌株的遺傳多樣性后發(fā)現(xiàn)，多態(tài)性檢測(cè)效率最高的標(biāo)記為ISSR，其次是IGS2-RFLP，最后是SCoT。3種標(biāo)記中，SCoT和ISSR標(biāo)記的聚類結(jié)果極其相似，均能較為準(zhǔn)確地反映樣本的地理來源；IGS2-RFLP的標(biāo)記效率較高，準(zhǔn)確性和可重復(fù)性好，可用于菌株標(biāo)準(zhǔn)圖譜的制作，更適用于品種權(quán)保護(hù)中的菌株鑒定鑒別。

本研究共收集河南省內(nèi)白靈側(cè)耳菌株32個(gè)，應(yīng)用拮抗反應(yīng)和IGS2-RFLP法對(duì)這些菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)菌株間具有拮抗反應(yīng)，僅Pt1、Pt5和Pt22等3個(gè)菌株相互間無(wú)拮抗反應(yīng)。IGS2-RFLP法采用3種限制性內(nèi)切酶，對(duì)白靈側(cè)耳的IGS2擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，均具有良好的特異性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，酶切圖譜具豐富的多態(tài)性，不同菌株間有差異?；谏鲜鼋Y(jié)果對(duì)收集到的白靈側(cè)耳菌株遺傳多樣性進(jìn)行分析，最終將這些菌株分為親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的3組，其中25號(hào)（國(guó)審品種中農(nóng)翅鮑）和32號(hào)（許白2號(hào)）菌株位于第I組，24號(hào)（國(guó)審品種中農(nóng)1號(hào)）菌株位于第II組，其余菌株分屬于三組之中。而菌株29號(hào)經(jīng)3個(gè)酶酶切后的聚類分析分組位于第II組或第III組。此結(jié)論為今后新品種雜交選育親本的選擇提供參考和選擇依據(jù)。