蒲小峰，張雨薇，李勝男，張雪靜，蘇 艷

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

近年來,隨著新疆地區(qū)驢養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，馬流產(chǎn)沙門菌(Salmonellaabortusequi)引起的驢副傷寒已成為影響和阻礙驢產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要傳染病之一[1-2]，已對驢產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。馬流產(chǎn)沙門菌僅侵害馬屬動物，引起懷孕母驢(馬等)流產(chǎn)、子宮內(nèi)膜炎、公驢(馬)睪丸炎、關(guān)節(jié)突出、幼驢(駒)腹瀉、敗血癥、支氣管肺炎、心包炎等癥狀[3-4]。該病通常呈散發(fā)性，有時呈地方性流行，初產(chǎn)母畜和幼駒易感性最高[5]。國內(nèi)關(guān)于豬、禽類沙門菌的報道較多，關(guān)于驢源馬流產(chǎn)沙門菌的報道較少。目前該病在中國已隨馬驢產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展呈多地頻發(fā)的趨勢，馮培祥等[6]在2018年及孫陽陽等[7]在2019年分別從山東地區(qū)驢流產(chǎn)胎兒分離得到驢源沙門菌。該病引起馬屬動物的流產(chǎn)率可達(dá)到30%～100%，直接影響了馬及驢產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

鞭毛蛋白FliC不僅是馬流產(chǎn)沙門菌的運動器官，還與該菌的黏附、侵襲力、毒性和生物被膜的形成相關(guān)[8-9]。生物被膜又是導(dǎo)致該菌的隱性感染與反復(fù)感染的重要原因之一[10-11]。此外,FliC保守性良好[12]，還有較強(qiáng)的抗原性[13]。目前關(guān)于驢源馬流產(chǎn)沙門菌鞭毛基因的研究較少。2020年新疆伊犁地區(qū)和和田地區(qū)出現(xiàn)了驢流產(chǎn)的病例，本試驗從新疆2個不同地區(qū)采集了驢流產(chǎn)胎兒肝臟和脾臟進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，得到了2株驢源馬流產(chǎn)沙門菌，并進(jìn)行了生化試驗、藥敏試驗和小鼠致病性分析，還對驢源馬流產(chǎn)沙門菌的鞭毛蛋白FliC的氨基酸進(jìn)行了進(jìn)化分析與比較，可為進(jìn)一步研究鞭毛在該菌的致病機(jī)制和基因工程疫苗的研究提供基礎(chǔ)，并為臨床開展驢源馬流產(chǎn)沙門菌病的診斷與治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料及試驗動物

新疆地區(qū)某2個集約化驢場的驢流產(chǎn)胎兒，通過剖解采集其肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織器官，共21份，進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定。5周齡健康SPF昆明小鼠54只，雌雄不限，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

膠回收試劑盒、DNA提取試劑盒、TaqDNA聚合酶、DL2000 DNA Marker均購自天根生化科技(北京)有限公司；營養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、藥敏試紙、沙門菌生化發(fā)酵管均購自杭州濱和微生物試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌分離純化及形態(tài)學(xué)觀察 將無菌采集的樣品研磨，涂布SS瓊脂鑒別培養(yǎng)基，37 ℃劃線培養(yǎng)16 h后，觀察固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，符合沙門菌菌落特征的可挑取單菌落，劃線挑取反復(fù)培養(yǎng)5次，觀察到培養(yǎng)基上均為同一種菌落時進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.3.2 生化鑒定 參考《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》[14]將純化后的分離菌單菌落接種于微量生化鑒定管中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.3.3 鞭毛FliC基因擴(kuò)增及序列分析 用DNA提取試劑盒提取的分離株基因組DNA，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。參考馬流產(chǎn)沙門菌鞭毛基因FliC(GenBank登錄號：HE801377.1)使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，引物序列：F：5′-CGCGGATCCTTGACCCAGAAT-3′；R：5′-GTG-CTCGAGTCGGAACCTGGTT-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)總體系25 μL：TaqDNA聚合酶1.25 μL，10×TaqPCR緩沖液6.25 μL，dNTP(2.5 mmol/L)10 μL，DNA模板1.5 μL，上、下游引物各1 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測，取結(jié)果為陽性的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。經(jīng)BLAST比對后，用DNAStar軟件將分離菌株的FliC氨基酸序列與GenBank中收錄的相關(guān)沙門菌參考株進(jìn)行序列及相似性分析，并采用Mega 7.0軟件，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 小鼠致病性試驗 將分離菌株分別接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)，每株菌用分光光度計檢測細(xì)菌數(shù)量分別至1×108、5×108、1×109、5×109CFU/mL 4個梯度組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)。將54只健康昆明小鼠隨機(jī)分成9組,每組6只，每只小鼠腹腔注射1 mL，對照組小鼠注射1 mL PBS，連續(xù)觀察7 d，每12 h記錄一次死亡情況。

1.3.5 臟器荷菌量檢測及病理切片觀察 對死亡小鼠剖檢，每組取3只小鼠無菌采集脾臟和腎臟組織，一部分進(jìn)行研磨，用滅菌生理鹽水梯度稀釋后涂固體培養(yǎng)平板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，統(tǒng)計菌落數(shù)，計算荷菌量；另一部分制作病理切片，通過HE染色觀察小鼠臟器病理組織學(xué)變化。

1.3.6 藥敏試驗 采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法測試分離菌對21種抗菌藥的敏感性。分別取2株分離菌的培養(yǎng)液80 μL，均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，將藥敏試紙片貼于平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，測量其抑菌圈直徑，按照WS/T125-1999標(biāo)準(zhǔn)判定分離菌對抗生素的敏感性，結(jié)果表示為敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行分析，通過單因素LSD法分析各組間差異，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離純化及鑒定

對21份馬流產(chǎn)胎兒內(nèi)臟樣品進(jìn)行培養(yǎng)鑒定，最終分離出2株疑似馬流產(chǎn)沙門菌，分別命名為XD1-2和G1-1，2株菌在SS瓊脂培養(yǎng)基上的菌落呈圓形凸起，中央黑、邊緣透明的圓形菌落(圖1A)。鏡檢為革蘭陰性、散在排列的無莢膜芽胞的桿菌(圖1B)。

2.2 生化鑒定結(jié)果

生化試驗結(jié)果顯示，2株分離菌(G1-1、XD1-2)對H2S、葡磷胨水、半固體、氨基酸脫羧酸空白對照、賴氨酸、鳥氨酸、山梨醇的反應(yīng)均為陽性；G1-1菌株的枸櫞酸鹽鑒定管為陽性，而XD1-2為陰性；2株分離菌的其他6種生化反應(yīng)均為陰性(表1)，符合馬流產(chǎn)沙門菌的特征。

表1 分離菌株生化鑒定結(jié)果

2.3 FliC基因擴(kuò)增及遺傳進(jìn)化分析

對2株分離菌株的FliC基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均獲得了約1 000 bp的目的條帶(圖2)，與預(yù)期大小相符。相似性比對結(jié)果表明，2株分離菌FliC氨基酸序列之間的相似性為99.0%，2株分離菌與Ireland-HE801373、Ireland-HE801378株相似性均最高，且均為99.3%(圖3)，分離菌XD1-2與美國人源腸炎沙門菌分離株USA-EBQ1214032.1的相似性為98.1%。氨基酸進(jìn)化關(guān)系結(jié)果顯示，分離株G1-1與愛爾蘭馬源馬流產(chǎn)沙門菌分離株Ireland-HE801373和Ireland-HE801378及國內(nèi)馬源馬流產(chǎn)沙門菌分離株China-KJ486797.1和China-KJ486769.1親緣關(guān)系較近，而分離株XD1-2則與美國人源腸炎沙門菌分離株USA-EBQ1214032.1親緣關(guān)系較近(圖4)，與相似性分析結(jié)果一致。

M，DL2000 DNA Marker；1,陰性對照；2、3，菌株XD1-2；4、5，菌株G1-1M，DL2000 DNA Marker；1,Negative control;2 and 3,Strain XD1-2;4 and 5，Strain G1-1圖2 分離株FliC基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of FliC genes of isolated strains

圖3 分離菌株與參考菌株FliC氨基酸相似性比對Fig.3 Similarity comparison of FliC amino acid between isolated strains and reference strains

2.4 分離菌株致病性試驗

試驗組小鼠分別注射2株分離菌后，不同劑量組小鼠均出現(xiàn)不同程度的精神沉郁、被毛松亂、采食量下降、腹瀉等癥狀，以上癥狀與馬流產(chǎn)沙門菌感染的臨床癥狀一致，再次確認(rèn)是該菌感染。除G1-1Ⅰ組死亡率為83%外，其余試驗組死亡率均為100%，其中G1-1 Ⅳ組小鼠全部死亡的時間為注射菌液后12 h，而XD1-2 Ⅳ組為9 h，對照組小鼠無發(fā)病死亡(表2)。無菌條件下采取G1-1 Ⅳ及XD1-2 Ⅳ組死亡小鼠腎臟及脾臟進(jìn)行荷菌量檢測，結(jié)果表明XD1-2菌攻擊后脾臟荷菌量顯著高于G1-1菌(P<0.01)，但腎臟荷菌量在2株分離菌間無顯著差異(P>0.05)(圖5)。G1-1 Ⅳ組及XD1-2 Ⅳ組小鼠腎臟及脾臟經(jīng)HE染色觀察，可見XD1-2菌攻擊后小鼠腎臟和脾臟出血均較G1-1菌明顯(圖6)。

表2 小鼠致病性試驗結(jié)果

數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相同字母或無字母標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)Values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05)；While with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)圖5 小鼠內(nèi)臟荷菌量檢測結(jié)果Fig.5 Detection results of visceral bacterial load in mice

圖6 死亡小鼠病理組織變化(HE,400×)Fig.6 Histopathological changes in dead mice (HE，400×)

2.5 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果顯示，分離菌XD1-2對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素敏感，對頭孢呋辛、利福平、頭孢噻呋、諾氟沙星、頭孢曲松鈉中介，對其余11種抗菌藥物耐藥。分離菌G1-1對阿莫西林、頭孢呋辛、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素、諾氟沙星、土霉素、氨芐西林、恩諾沙星、頭孢曲松鈉、鏈霉素敏感，對頭孢噻呋中介，對其余9種抗菌藥物耐藥(表3)。

表3 分離菌株藥物敏感性試驗結(jié)果

續(xù)表

3 討 論

近年來新疆驢養(yǎng)殖數(shù)量不斷上升，由馬流產(chǎn)沙門菌引起的流產(chǎn)在新疆持續(xù)散發(fā)，偶有地方暴發(fā)，且造成很多馬匹呈隱性感染，很難凈化，已給驢產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。楊康等[15]在2013-2014年對新疆地區(qū)的馬流產(chǎn)沙門菌病的流行情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示馬血清中該菌抗體陽性率為28.28%。袁貝等[16]對新疆伊犁地區(qū)馬匹開展馬流產(chǎn)沙門菌血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該菌抗體陽性率為25.31%。劉英玉等[17]對新疆地區(qū)市售驢肉常見致病菌檢測與調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，沙門菌檢出率為20%。

馬流產(chǎn)沙門菌的致病性依賴于多種毒力因子，鞭毛蛋白FliC就是其中的一種重要毒力因子[18]，可在該菌黏附和侵襲腸上皮細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要的作用[19-20]。孫慧瑩等[21]對9株驢源馬流產(chǎn)沙門菌的10種毒力因子檢測分析后得出，毒力基因表現(xiàn)為多樣性的組合現(xiàn)象且呈高攜帶率。李陽等[3]對新疆地區(qū)馬源馬流產(chǎn)沙門菌的FliC基因進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明，新疆地區(qū)2株馬源馬流產(chǎn)沙門菌和愛爾蘭馬流產(chǎn)沙門菌分離株Ireland-HE801373、Ireland-HE801374和Ireland-HE801378，還與腸炎沙門菌HE801385親緣關(guān)系較近。程相朝等[22]對腸炎沙門菌FliC基因進(jìn)行同源性比較分析后得出該基因在同一物種屬內(nèi)同源性較高且保守性較好。本試驗中對驢源馬流產(chǎn)沙門菌的FliC基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增與遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果表明，這2株分離菌在進(jìn)化上有一定的差異，分離株G1-1與愛爾蘭馬源馬流產(chǎn)沙門菌分離株Ireland-HE801373和Ireland-HE801378及國內(nèi)馬源馬流產(chǎn)沙門菌分離株China-KJ486797.1和China-KJ486769.1親緣關(guān)系較近，而分離株XD1-2則與美國人源腸炎沙門菌分離株USA-EBQ1214032.1親緣關(guān)系較近。表明該地區(qū)馬流產(chǎn)沙門菌來源不同，可能是跨區(qū)域引種或貿(mào)易造成。

目前已知的沙門氏菌血清型有2 500多種。本次試驗與孫陽陽等[7]鑒定的7株驢源沙門菌種類不同，其鑒定了山東地區(qū)的5株分離菌為鼠傷寒沙門氏菌，1株為愛丁堡或湯姆遜沙門菌，另1株則為阿邦尼或愛丁堡沙門菌，本試驗中驢源分離株XD1-2與G1-1均為馬流產(chǎn)沙門菌。其次，孫陽陽等[7]對山東驢源沙門菌的致病性分析結(jié)果表明，這7株驢源菌株致病性較低，攻擊小鼠后僅表現(xiàn)輕度腹瀉，2周后好轉(zhuǎn)。王芷晴等[23]研究結(jié)果表明，其分離鑒定的鵝源沙門菌對小鼠致死率為90%，同時發(fā)現(xiàn)小鼠脾臟、肝臟、肺臟等器官均有出血。劉勃興等[24]從水貂分離的9株沙門菌中有6株對小鼠的致死率為100%。本試驗中的分離菌株接種小鼠后具有明顯的致病性，且分離株XD1-2的致病性強(qiáng)于G1-1，該結(jié)果與山東地區(qū)分離的驢源沙門菌對小鼠的致病性不同。馮蘭等[25]研究牦牛德爾卑沙門菌時發(fā)現(xiàn)該菌以1×109CFU的劑量接種小鼠后，其脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少，紅髓面積比例相對增加。本試驗中2株分離菌攻擊小鼠后均出現(xiàn)了腎臟水腫、出血，脾臟出血等病變，推測本次分離的驢源馬流產(chǎn)沙門菌毒性更強(qiáng)。

孫陽陽等[7]對山東地區(qū)7株驢源沙門菌的耐藥表型檢測結(jié)果顯示，7株菌對所檢測24種抗菌藥物均比較敏感。孫瑩慧等[21]對9株驢源馬流產(chǎn)沙門菌進(jìn)行了11種臨床常用抗菌藥物的敏感性測試，證明9株菌的耐藥譜較窄，對阿莫西林和鏈霉素耐藥。李帆等[26]分析發(fā)現(xiàn)豬源沙門菌對四環(huán)素具有普遍耐藥性。本試驗中分離菌XD1-2對11種抗菌藥物耐藥，對5種抗菌藥物敏感，對4種抗菌藥物已開始表現(xiàn)出中介的特性；分離菌G1-1對9種抗菌藥物耐藥，對11種抗菌藥物敏感。2株分離株(XD1-2與G1-1)對臨床上廣泛使用的青霉素、四環(huán)素、磺胺等抗菌藥物均產(chǎn)生了較高的耐藥性，此外還發(fā)現(xiàn)，2株分離菌分別對土霉素和氨芐西林表現(xiàn)出不同的敏感性，該結(jié)果與以上國內(nèi)報道的藥物敏感性結(jié)果差異較大，2株驢源馬流產(chǎn)沙門氏菌出現(xiàn)了多重耐藥的現(xiàn)象，提示在臨床治療中對耐藥性的監(jiān)測和用藥需要引起重視。Chung等[27]報道鏈霉素為馬屬動物革蘭氏陰性菌治療首選抗菌藥，本試驗藥敏結(jié)果與其一致，2株分離菌均對鏈霉素敏感。因此，養(yǎng)殖場內(nèi)應(yīng)嚴(yán)格遵循藥物使用原則，規(guī)范藥物治療和利用高品質(zhì)的疫苗防控沙門菌病，將對控制該菌耐藥性的進(jìn)一步發(fā)展具有重要的價值。

4 結(jié) 論

本試驗從驢流產(chǎn)胎兒肝臟及脾臟中分離得到2株菌，分別命名為XD1-2與G1-1，經(jīng)氨基酸序列比對、相似性分析、構(gòu)建進(jìn)化樹以及致病性分析確定此2株菌均為馬流產(chǎn)沙門氏菌。這2株菌對小鼠的致病性較強(qiáng)且致病性存在差異，XD1-2對小鼠的致病性強(qiáng)于G1-1。2株分離菌具有多重耐藥特點，且對21種抗菌藥物的耐藥性存在差異。