明瑤，張露丹，周敏，溫翠娟，霍朝勇，呂曉華*

（1.四川大學(xué) 華西公共衛(wèi)生學(xué)院/華西第四醫(yī)院，四川 成都 610041；2.成都雨瑞藍(lán)果果農(nóng)業(yè)科技有限公司，四川 成都 610200）

藍(lán)莓原產(chǎn)美洲，目前在國內(nèi)廣泛種植。藍(lán)莓果實含有豐富的維生素C，硒含量高于一般水果，花青素含量高居水果之首，還含有超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、熊果苷、類黃酮、鞣花酸等活性成分[1-2]，有助于改善視力、預(yù)防心血管疾病、改善記憶力[3-4]。隨著藍(lán)莓產(chǎn)量增加，鮮果貯藏期短等問題日漸凸顯，以及消費(fèi)者對水果的食用、感官、營養(yǎng)等多方面需求，藍(lán)莓的深加工和綜合開發(fā)利用備受關(guān)注[5-7]。其中藍(lán)莓發(fā)酵制品不僅能延長藍(lán)莓的保質(zhì)期，改善其風(fēng)味，還能提供多種小分子活性物質(zhì)，更有利于人體吸收。本文通過動物實驗觀察藍(lán)莓發(fā)酵制品對免疫功能的影響，為藍(lán)莓的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉：成都雨瑞藍(lán)果果農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，人體推薦劑量為4.5 g/d（75 mg/kg bw），實驗前樣品用純水配制成所需濃度。綿羊紅細(xì)胞（sheep red blood cell，SRBC）：采自健康綿羊頸靜脈；雞紅細(xì)胞（chicken red blood cell，CRBC）：采自健康公雞心臟；刀豆蛋白 A（ConA）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 [3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]、氧化型輔酶Ⅰ：美國Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基：美國Gibco公司；AC-1細(xì)胞：中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫；墨汁：北京一得閣工貿(mào)公司產(chǎn)品；補(bǔ)體：由健康豚鼠血清制得；小牛血清：浙江天杭生物科技股份有限公司；乳酸鋰：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙基苯基聚乙二醇（nonidet P-40，NP-40）、吩嗪二甲酯硫酸鹽：Biosharp公司；含雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液：成都哈里生物科技有限公司。

1.2 實驗動物

SPF級雄性Balb/c小鼠 [許可證號：SCXK（京）2019-0008]，6 周齡～8 周齡，18 g～22 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)SPF級動物房[許可證號：四川省實驗動物管理委員會SYXK（川）2018-011]，溫度20℃～26℃，相對濕度40%～70%。飼料由成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供，飲水為純水，實驗期間動物自由攝食和飲水。

1.3 儀器與設(shè)備

BSA223S電子天平：德國賽多利斯股份公司；數(shù)顯游標(biāo)卡尺：桂林廣陸數(shù)字測控股份有限公司；Multiskan GO全波長多功能酶標(biāo)儀：Thermo公司；MCO-15AC CO2培養(yǎng)箱：三洋電機(jī)國際貿(mào)易有限公司；、UV8100B紫外可見分光光度計：北京萊伯泰科儀器股份有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 功效成分檢測

藍(lán)莓發(fā)酵原漿中的熊果酸含量檢測參照文獻(xiàn)[8]，鞣花酸含量測定參照DB32/T 1879—2011《黑莓中鞣花酸含量的測定高效液相色譜法》，花青素（包含飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、錦葵色素）含量測定參照NY/T 2640—2014《植物源性食品中花青素的測定高效液相色譜法》，多糖含量檢測參照文獻(xiàn)[9]，SOD含量測定參照GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定》，低聚肽含量測定參照GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽粉》。

1.4.2 增強(qiáng)免疫力功能實驗

實驗動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為空白對照組和3個藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉實驗組。參照文獻(xiàn)[10]方法，確定受試物劑量分別為0.75 g/kg bw（低劑量組）、1.50 g/kg bw（中劑量組）和 2.25 g/kg bw（高劑量組）（分別相當(dāng)于人體推薦攝入量的10、20、30倍）。實驗動物按20 mL/kg bw灌胃。空白對照組動物以純水灌胃，每日1次。每周稱1次實驗動物體質(zhì)量，調(diào)節(jié)灌胃體積，連續(xù)灌胃30 d后進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.4.2.1 臟器指數(shù)測定

實驗結(jié)束后處死小鼠，取胸腺、脾臟稱重，計算臟器指數(shù)。

1.4.2.2 脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗

處死小鼠后無菌取脾，制成單個細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個/mL。按照MTT法[10]在570 nm波長處測OD值，用ConA孔的OD值與不加ConA孔的OD值的差值表示淋巴細(xì)胞的增殖能力。

1.4.2.3 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗

采用足跖增厚法進(jìn)行遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗。小鼠腹腔注射0.2 mL 2%SRBC進(jìn)行免疫，4 d后測量左后足跖部厚度，再在測量部位皮下注射20 μL 20%SRBC，24 h后測量左后足趾部厚度，測量3次，取平均值。計算攻擊前后足跖厚度差值。足跖腫脹程度可反映遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度。

1.4.2.4 血清溶血素測定

采用血凝法進(jìn)行血清溶血素測定實驗，免疫方法同1.4.2.3。5 d后于小鼠眼球取血，收集血清。將血清用生理鹽水按照所需濃度稀釋，將其分別置于血凝實驗板內(nèi)，加入等量SRBC懸液，置于37℃CO2培養(yǎng)箱3 h，觀察血球凝集程度，并計算抗體積數(shù)，抗體積數(shù)越大，表示血清溶血素（抗體）水平越高。

式中：1、2、3……n代表血清稀釋的指數(shù)；S代表凝集程度的級別。

1.4.2.5 抗體生成細(xì)胞檢測

抗體生成細(xì)胞檢測的免疫方法同1.4.2.3。5 d后處死小鼠，無菌取脾制成單個細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個/mL。按照J(rèn)erne改良玻片法，計數(shù)溶血空斑數(shù)。

1.4.2.6 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗

采用半體內(nèi)法進(jìn)行小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗。小鼠腹腔注射1 mL 20%雞紅細(xì)胞懸液，0.5 h后處死，固定于鼠板，剪開腹壁皮膚，注射2 mL生理鹽水，轉(zhuǎn)動鼠板1 min，吸出腹腔洗液1 mL，平均分滴于載玻片上，置于37℃CO2培養(yǎng)箱30 min。用生理鹽水漂洗晾干，在油鏡下計數(shù)吞噬細(xì)胞，計算吞噬率和吞噬指數(shù)。吞噬率或吞噬指數(shù)表示小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力。

1.4.2.7 碳廓清實驗

小鼠尾靜脈注射稀釋的墨汁，2 min（t1）和10 min（t2）后分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，將其加入Na2CO3溶液中，以Na2CO3溶液作空白對照，在600 nm波長處測光密度值，以吞噬指數(shù)a表示小鼠碳廓清的能力。

式中：K為碳廓清指數(shù)；OD1和OD2分別為2 min和10 min所取血樣的光密度值。

1.4.2.8 NK細(xì)胞活性測定

處死小鼠后無菌取脾，制成單個細(xì)胞懸液，按乳酸脫氫酶法[10]，用酶標(biāo)儀在490 nm處測OD值，計算NK細(xì)胞活性。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以便結(jié)果與分析使用。實驗數(shù)據(jù)用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，方差不齊者用秩和檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓鮮果及發(fā)酵原漿凍干粉功效成分含量

藍(lán)莓鮮果及發(fā)酵原漿凍干粉中功效成分含量見表1。

2.2 藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠臟器指數(shù)的影響

藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠臟器指數(shù)的影響見表2。

表2 藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 2 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on organ index of mice

如表2所示，藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉3個劑量組小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)與空白對照組相比無顯著性差異。表明藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠免疫器官的質(zhì)量無明顯影響。

2.3 藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響見表3。

表3 藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響Table 3 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on ConA-induced transformation of splenic lymphocytes in mice

如表3所示，藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉3個劑量組的OD差值與空白對照組相比無顯著性差異。說明藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠的淋巴細(xì)胞增殖能力無明顯影響。

2.4 藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響見表4。

表4 藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響Table 4 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on delayed type hypersensitivity in mice

如表4所示，藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉1.50 g/kg bw和2.25 g/kg bw劑量組小鼠足跖增厚程度顯著高于空白對照組（P＜0.05）。說明藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉可顯著提高小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度。

2.5 藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠血清溶血素產(chǎn)生的影響

藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠血清溶血素產(chǎn)生的影響見表5。

表5 藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠血清溶血素產(chǎn)生的影響Table 5 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on the production of serum hemolysin in mice

如表5所示，藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉3個劑量組的小鼠抗體積數(shù)均顯著高于空白對照組（P＜0.05）。說明藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉能明顯提高小鼠血清溶血素水平。

2.6 藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠抗體生成細(xì)胞產(chǎn)生的影響

藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠抗體生成細(xì)胞產(chǎn)生的影響見表6。

如表6所示，藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉1.50 g/kg bw和2.25 g/kg bw劑量組的小鼠溶血空斑數(shù)顯著高于空白對照組（P＜0.05）。溶血空斑數(shù)反映抗體生成細(xì)胞數(shù)，結(jié)果表明藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠抗體生成細(xì)胞增殖有明顯作用。

表6 藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠抗體生成細(xì)胞產(chǎn)生的影響Table 6 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on antibody-producing cells in mice

2.7 藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響

藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響見表7。

表7 藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響Table 7 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on phagocytosis of chicken red blood cells by peritoneal macrophages in mice

如表7所示，藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉3個劑量組的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)與空白對照組相比無顯著性差異。說明藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能無明顯影響。

2.8 藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠碳廓清的影響

藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠碳廓清的影響見表8。

表8 藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠碳廓清的影響Table 8 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on carbon clearance in mice

如表8所示，藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉3個劑量組的吞噬指數(shù)a與空白對照組相比無顯著性差異。說明藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠碳廓清能力無明顯影響。

2.9 藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠的NK細(xì)胞活性的影響

藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠NK細(xì)胞活性的影響見表9。

表9 藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠NK細(xì)胞活性的影響Table 9 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on NK cells activity in mice

如表9所示，藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉3個劑量組小鼠NK細(xì)胞活性與空白對照組相比無顯著性差異。結(jié)合其腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力實驗結(jié)果，表明藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對機(jī)體的非特異性免疫功能無明顯影響。

3 討論

與鮮果相比，藍(lán)莓發(fā)酵原漿中的多糖含量和SOD含量增多。發(fā)酵初期，藍(lán)莓中的單糖以碳源形式被微生物代謝分解，產(chǎn)生胞外多糖，這些胞外多糖一般是由單種或多種單糖組成的重復(fù)單元，大部分胞外多糖不再被微生物利用，進(jìn)入機(jī)體后可發(fā)揮其抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等生理功能[14-15]。生物體內(nèi)SOD基因的表達(dá)調(diào)控與所處環(huán)境和細(xì)胞的新陳代謝變化有關(guān)[16]，可能是發(fā)酵環(huán)境使發(fā)酵菌株的SOD表達(dá)增加，進(jìn)而藍(lán)莓發(fā)酵原漿中的SOD含量增多。鞣花酸和花青素屬于酚類化合物，發(fā)酵過程中不斷被氧化分解[17-18]，二者含量減少。這也使得藍(lán)莓發(fā)酵原漿苦澀味減少，口感更加柔和[19]。

本文設(shè)計了臟器指數(shù)測定、脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗、血清溶血素和抗體生成細(xì)胞測定、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗、碳廓清實驗和NK細(xì)胞活性測定等實驗，觀察藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉的增強(qiáng)免疫力作用。胸腺和脾臟是重要的免疫器官，脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗反映機(jī)體細(xì)胞免疫水平；血清溶血素測定和抗體生成細(xì)胞檢測反映機(jī)體體液免疫水平；腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗和碳廓清實驗反映吞噬細(xì)胞功能；NK細(xì)胞活性則反映非特異性免疫功能[20-22]。結(jié)果顯示，藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉能夠增強(qiáng)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，促進(jìn)小鼠抗體生成細(xì)胞產(chǎn)生，故具有增強(qiáng)免疫力功能。

遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)是由致敏T細(xì)胞與相應(yīng)抗原結(jié)合而引起的一種免疫應(yīng)答[20]，分為識別、激活和效應(yīng)3個階段。當(dāng)抗原攻擊機(jī)體時，首先被識別，再誘導(dǎo)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為致敏T細(xì)胞。藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉中的營養(yǎng)成分能為T細(xì)胞的增殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，熊果酸、藍(lán)莓多糖、花青素具有提高機(jī)體免疫的能力。其中熊果酸和藍(lán)莓多糖已被證實能在遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)激活階段促進(jìn)細(xì)胞因子分泌[23-24]。藍(lán)莓中的花青素具有極強(qiáng)的抗氧化活性和自由基清除功能[25]，可間接提高機(jī)體免疫功能，但有關(guān)其特異性免疫機(jī)制目前所見報道較少。

體液免疫依靠B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)B細(xì)胞和記憶細(xì)胞，效應(yīng)B細(xì)胞分泌抗體清除抗原，記憶細(xì)胞不分泌抗體，參與二次免疫反應(yīng)[26]。紅細(xì)胞與血清溶血素混合后，血清溶血素可與紅細(xì)胞表面的抗原結(jié)合，誘導(dǎo)補(bǔ)體系統(tǒng)激活。溶血反應(yīng)程度越高，血清抗體的水平越高，機(jī)體免疫功能越高[27]?？贵w生成細(xì)胞檢測用于測定效應(yīng)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力。本研究顯示血清溶血素的抗體積數(shù)和抗體生成細(xì)胞檢測的溶血空斑數(shù)顯著升高，側(cè)面反映藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉能提高B淋巴細(xì)胞的增殖分化能力和效應(yīng)B細(xì)胞抗體釋放能力。具體可能是因為藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉中的多種功效成分通過免疫細(xì)胞和免疫分子兩方面提高小鼠免疫功能。關(guān)于藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠的臟器指數(shù)、淋巴細(xì)胞增殖能力、巨噬細(xì)胞吞噬功能、碳廓清能力和NK細(xì)胞活性方面無明顯影響，目前原因尚不明確，有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉在中、高劑量水平上可顯著提高小鼠足跖腫脹程度，各劑量組均可顯著提高小鼠血清溶血素水平，中、高劑量水平上可顯著提高小鼠抗體生成細(xì)胞增殖能力。因此該藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉對小鼠細(xì)胞免疫和體液免疫有一定增強(qiáng)作用。綜上所述，藍(lán)莓發(fā)酵原漿凍干粉具有增強(qiáng)免疫力的功能，有望進(jìn)一步開發(fā)利用。