劉 慧,曾祥權(quán),蔣世衛(wèi),周玉春,黃 華
(1.北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院,北京 101300;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)呈圓形,大小約為1 μm,是一種兼性厭氧、無孢子形成的革蘭氏陽性菌。該菌廣泛分布于自然界中,并在低溫、干燥、高鹽等不利的生存環(huán)境下仍能生長繁殖。在人體中主要存在于皮膚、黏膜以及鼻咽部,有研究表明30%~80%的人群是金黃色葡萄球菌的攜帶者[1]。作為一種潛在的病原體,金黃色葡萄球菌不僅可以引起皮膚感染,還極易通過各種途徑和方式污染食品從而引起危及生命的感染,如心內(nèi)膜炎、敗血癥、肺炎、骨髓炎和關(guān)節(jié)炎等[2],對食品安全和人類健康造成嚴重威脅。除感染外,金黃色葡萄球菌還可通過產(chǎn)生毒素來誘發(fā)食物中毒,主要癥狀包括嘔吐、腹瀉和腹部絞痛,嚴重時還會出現(xiàn)頭痛、肌肉痙攣甚至休克等[3]。金黃色葡萄球菌分泌的毒素主要包括腸毒素(Staphylococcus aureusenterotoxin,SE)(SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SHE和SEI)、中毒性休克綜合征毒素1及白細胞介素[4]。其中,SEA熱穩(wěn)定性強,對低pH值、干燥和冷凍等不利環(huán)境具有較強的抵抗能力,是引起食物中毒的最常見毒素[5-6]。目前,金黃色葡萄球菌及其毒素正不斷威脅人們的生命健康,與此相關(guān)的食物中毒報道層出不窮。根據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心的報告顯示,由金黃色葡萄球菌是引起的感染占第二位,僅次于大腸桿菌[7];在我國,根據(jù)2015年食源性疾病監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示,由金黃色葡萄球菌引起的食源性疾病占食源性疾病暴發(fā)總數(shù)的12.6%,是造成食源性疾病的第三大致病菌[8];而在世界其他地方,每年也會發(fā)生多起該類食品安全事件,給公共醫(yī)療衛(wèi)生造成巨大壓力。
此外,隨著抗生素在動物養(yǎng)殖和醫(yī)療領(lǐng)域的使用,病原體在抗生素的選擇壓力下不斷進化出新的致病菌。特別是甲氧西林于1959年被引入用于治療耐青霉素的金黃色葡萄球菌引起的感染后,出現(xiàn)了耐甲氧西林的“超級耐藥細菌”(methicillin-resistantS.aureus,MRSA)[9]。MRSA是一種人類病原體,可導(dǎo)致醫(yī)院獲得性感染和社區(qū)獲得性感染,對此尚缺乏有效治療手段,目前已成為一個重大的公共衛(wèi)生問題。值得強調(diào)的是,MRSA已被從世界各地的肉、魚、牛奶及相關(guān)乳制品等食物中分離出來,尤其是食用動物及其相關(guān)制品[10-13]。有研究表明,屠宰攜帶MRSA的動物或感染MRSA的人員處理食物時均可造成食品污染,進而對消費者的健康造成潛在危害[14-16]。
綜上所述,對食品中的金黃色葡萄球菌進行檢測,對降低突發(fā)公共衛(wèi)生事件發(fā)生風(fēng)險及確保食品安全具有重要的現(xiàn)實意義。目前,用于金黃色葡萄球菌檢測的分析方法仍以傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定方法為主。該方法操作復(fù)雜繁瑣、檢測周期長且靈敏度低,無法滿足快速檢測要求。因此,迫切需要探索更加便捷、快速、準確、安全的新型檢測技術(shù)以實現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的實時監(jiān)控。生物傳感器是將生物信號與物理或化學(xué)換能器結(jié)合并轉(zhuǎn)化為可監(jiān)測信號的一類小型、便捷的分析裝置,具備操作簡單、分析速度快,可在線檢測等優(yōu)點,有利于實現(xiàn)金黃色葡萄球菌的現(xiàn)場實時檢測。本文就各類生物傳感器的基本原理及其在金黃色葡萄球菌快速檢測中的應(yīng)用進行了詳細闡述,以期為研發(fā)基于生物傳感器技術(shù)的金黃色葡萄球菌檢測方法提供參考依據(jù)。
常規(guī)培養(yǎng)方法是用于檢測金黃色葡萄球菌的傳統(tǒng)檢測方法,其主要依據(jù)各種行業(yè)標準和國家標準,這些標準檢測方法可靠性高、成本低,但靈敏度較低且檢測周期長,通常需要3~5 d才能出結(jié)果,不能滿足對食源性金黃色葡萄球菌快速、及時、靈敏的檢測要求,不利于食品的監(jiān)督管理和疾病預(yù)防。因此,近年來各種快速檢測技術(shù)不斷發(fā)展,并表現(xiàn)出傳統(tǒng)方法所不具備的明顯優(yōu)勢,如基于抗原/抗體特異性結(jié)合的免疫分析法、基于核酸的分子生物學(xué)方法以及基于光譜的儀器分析方法等[17-19]。這些檢測方法可將檢測時間從數(shù)天縮短至數(shù)小時,但仍存在一定局限性:如免疫分析方法特異性強,但有耗時長、存在交叉反應(yīng)等潛在的缺點[20];核酸分析方法基于對金黃色葡萄球菌的特異核酸序列進行擴增或識別,優(yōu)點是準確性和靈敏度更高,但需要專業(yè)的儀器設(shè)備和操作人員,且樣品制備工作繁瑣、制備時間冗長,主要用于實驗室分析,不適合現(xiàn)場檢測[21];光譜技術(shù)可以無損測定樣品中的金黃色葡萄球菌,但是復(fù)雜的食品基質(zhì)可能影響其穩(wěn)定性[22]。另外,在發(fā)展中國家,高成本和有限的資源也是限制大多數(shù)快速檢測技術(shù)推廣應(yīng)用的關(guān)鍵因素。因此,持續(xù)開發(fā)快速、可行的快速檢測方法對低成本檢測金黃色葡萄球菌和MRSA具有重要意義。生物傳感器在快速檢測領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景,本文將詳細闡述生物傳感器技術(shù)在金黃色葡萄球菌快速檢測中的最新研究進展。
生物傳感器是由識別元件、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件及信號放大裝置構(gòu)成的一種便攜式分析檢測工具。其工作原理是基于生物活性材料(如抗原、抗體、酶、核酸、適配體、噬菌體、細胞、組織、微生物等)的敏感識別元件(生物感受器)與待測目標物發(fā)生生化反應(yīng)產(chǎn)生濃度信號,經(jīng)由基于光學(xué)、電化學(xué)、壓電(piezoelectric,PZ)、磁力和溫度等一種或多種技術(shù)結(jié)合而設(shè)計成的換能器(信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件)轉(zhuǎn)換成可定量分析的光、電等信號,再經(jīng)信號放大裝置放大輸出,從而獲得目標分析物的數(shù)量和濃度信息[23],如圖1所示。目前,生物傳感器在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品工業(yè)和環(huán)境監(jiān)測中得到廣泛應(yīng)用并逐漸形成了商品化體系[24-26]。尤其在食源性致病菌檢測領(lǐng)域,生物傳感器被視為用于食品加工常規(guī)監(jiān)測及應(yīng)對突發(fā)緊急狀況的重要工具[27]。
圖1 生物傳感器的基本組件[23]Fig.1 Basic components of biosensors[23]
電化學(xué)生物傳感器是所有生物傳感器中最具代表性的一類,鑒于高靈敏度、高通用性及較低成本等特點而受到人們的廣泛關(guān)注。其檢測原理基于抗原/抗體、酶、核酸、適配體等生物識別元件捕獲待測目標物后會引起傳感器表面發(fā)生電流、阻抗、電位或電導(dǎo)等參數(shù)的變化,通過監(jiān)測這些化學(xué)信號變化可對目標分析物的濃度做出定量分析[23]。根據(jù)觀察到的不同參數(shù)變化,又可將電化學(xué)生物傳感器細分為電流型生物傳感器、阻抗型生物傳感器、電位型生物傳感器及電導(dǎo)型生物傳感器。表1列出了基于不同模式的電化學(xué)生物傳感器在金黃色葡萄球菌檢測中的應(yīng)用。
表1 不同電化學(xué)生物傳感器在金黃色葡萄球菌檢測中的應(yīng)用Table 1 Application of different electrochemical biosensors in detection of Staphylococcus aureus
2.1.1 電流型生物傳感器
電流型生物傳感器的工作原理是通過測量電極表面發(fā)生的生化反應(yīng)引起的電流變化來確定目標物的濃度,即目標分析物的濃度與生物傳感器的電流響應(yīng)成正比[20]。近年來,已開發(fā)出多種電流型生物傳感器應(yīng)用于金黃色葡萄球菌的檢測(表1)。常用的電流型生物傳感器主要以免疫學(xué)檢測為基礎(chǔ),由于抗原/抗體生物分子本身不具備電活性,一般需要對抗原/抗體進行標記,堿性磷酸酶是常用的酶標記。Escamilla-Gómez等[29]利用巰基丙酸在金電極表面自組裝單分子層上固定金黃色葡萄球菌抗體和酪氨酸酶作為免疫傳感平臺,測定時金黃色葡萄球菌和堿性磷酸酶標記的二抗會與電極上固定化抗體的結(jié)合位點發(fā)生競爭性免疫反應(yīng),堿性磷酸酶水解產(chǎn)生的苯酚在酪氨酸酶的作用下氧化為鄰醌,將其作為安培法的監(jiān)測信號可實現(xiàn)在較低的正電勢下靈敏地檢測金黃色葡萄球菌,該免疫傳感器的檢出限為1.7×105CFU/mL;此外,通過對待測樣品進行加熱處理以破壞金黃色葡萄球菌的細胞壁,可將檢出限降低至2.3×103CFU/mL。Escamilla-Gómez等[30]還報道了另一種利用3,3’-二巰基丙酸(N-琥珀酰酯)作為交聯(lián)劑將抗體共價固定在金電極表面構(gòu)建的電流型免疫傳感器用來檢測金黃色葡萄球菌的方法,該方法的線性范圍為1.3×103~7.6×104CFU/mL,檢出限低至3.7×102CFU/mL。de ávila等[31]基于功能化磁珠(magnetic beads,MBs)和金絲網(wǎng)印刷電極(gold screen-printed electrodes,Au/SPEs)的特性,開發(fā)了一種可用于生乳中金黃色葡萄球菌特異性檢測和定量分析的一次性安培型磁免疫傳感器(圖2),即將抗體固定在經(jīng)金黃色葡萄球菌細胞壁蛋白A(ProtA)修飾的功能化免疫磁珠上,辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的ProtA和金黃色葡萄球菌會與功能化免疫磁珠上的抗體發(fā)生競爭性免疫反應(yīng),通過監(jiān)測辣根過氧化物酶催化H2O2的氧化還原反應(yīng)引起的電化學(xué)信號變化可實現(xiàn)金黃色葡萄球菌的檢測。該方法分析時間短(2 h),可用于現(xiàn)場快速檢測,且選擇性良好、靈敏度高,生乳中檢測限低至1 CFU/mL。Majumdar等[32]采用預(yù)包覆聚乙烯亞胺層的戊二醛交聯(lián)劑將抗體固定在鉑電極表面上,開發(fā)了一種用于檢測不同食品樣品(牛奶、奶酪和肉制品)中金黃色葡萄球菌的安培免疫傳感,該方法的檢出限可低至10 CFU/mL。這些電化學(xué)生物傳感器的一個共同缺點是不同的電活性化合物會產(chǎn)生假電流值從而對結(jié)果造成潛在干擾。然而,可通過使用選擇性膜,根據(jù)質(zhì)量或電荷控制化合物進入電極的途徑來克服這一缺點[41]。
圖2 金黃色葡萄球菌安培型磁免疫傳感器[31]Fig.2 Schematic diagram of magnetoimmunosensor to detect S.aureus[31]
2.1.2 阻抗型生物傳感器
阻抗型生物傳感器靈敏度高、成本低、功耗低、測定簡單,近年來廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測[42-43]。該類型的生物傳感器主要基于兩種原理,一種是病原菌生長產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可引起電導(dǎo)率變化;一種是病原菌與電極表面發(fā)生相互作用會引起阻抗變化。目前,電化學(xué)阻抗譜(electrochemical impedance spectroscopy,EIS)由于體積小、成本低、檢測快速等優(yōu)點,已成為應(yīng)用最廣泛的生物傳感器技術(shù)。近年來,有關(guān)阻抗法檢測食源性病原菌的方法已有很多文獻報道,但只有少數(shù)專門針對金黃色葡萄球菌檢測(表1)。Tan Fei等[34]通過將抗體固定在氧化鋁納米多孔膜修飾電極上構(gòu)建了一種微流控免疫傳感器,抗體與金黃色葡萄球菌的特異性結(jié)合會引起電極表面阻抗的變化,利用電化學(xué)阻抗譜可快速檢測金黃色葡萄球菌的濃度,其分析時間短(2 h)、交叉反應(yīng)性極小,檢測靈敏度高達102CFU/mL。Braiek等[35]使用3-巰基丙酸在金電極自組裝單分子層上固定抗體,并利用電化學(xué)阻抗譜檢測金黃色葡萄球菌,該方法特異性和重現(xiàn)性良好,檢出限為10 CFU/mL。Bekir等[37]同樣采用自組裝單分子層方法將抗體固定在修飾的金電極表面,以亞鐵/亞鐵氰化物作為氧化還原探針監(jiān)測固/液界面的電荷轉(zhuǎn)移電阻,并利用阻抗譜技術(shù)建立了一種可用于檢測應(yīng)激條件下和復(fù)蘇狀態(tài)的金黃色葡萄球菌的阻抗免疫傳感器方法,該方法穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好,線性范圍為101~107CFU/mL,檢出限低至10 CFU/mL,即使在應(yīng)激條件下也能檢測到食品樣品中的金黃色葡萄球菌。與其他電化學(xué)生物傳感器技術(shù)相比,電化學(xué)阻抗譜作為一種無標簽的檢測方法,其檢測限仍然不夠低[44]。
2.1.3 電位型生物傳感器
電位法是電化學(xué)檢測食源性病原體方法中最不常用的一種,通常使用高阻抗電壓表測量在零電流流動條件下兩個使用電極(工作電極和參比電極)的離子性質(zhì)變化所引起的電勢差[45]。電位型生物傳感器檢測食源性病原體的原理主要是基于電解液中玻璃電極的pH值或離子濃度變化。Zelada-Guillén等[39]以適配體作為識別元件,單壁碳納米管作為離子-電子電位傳感元件,構(gòu)建了一種無標記的金黃色葡萄球菌檢測方法。該生物傳感器分別采用共價結(jié)合和非共價吸附兩種方法對碳納米管進行適配體功能化,結(jié)果表明,非共價功能化的生物傳感器具有更高的靈敏度,檢出限為8×102CFU/mL。Hernández等[40]通過在石墨烯修飾的電極上連接DNA適配體作為金黃色葡萄球菌的檢測探針,首次構(gòu)建了新一代電位型生物傳感器,該方法選擇性強、重現(xiàn)性好,并且能在非常短的響應(yīng)時間內(nèi)提供超低的檢測限(1 CFU/mL)。
繼電化學(xué)檢測方法之后,光學(xué)生物傳感器因其靈敏度高、特異性強、檢測速度快等優(yōu)點逐漸發(fā)展起來并廣泛應(yīng)用于金黃色葡萄球菌的檢測(表2)。此外,利用光纖和集成光學(xué)傳感器的優(yōu)勢還可實現(xiàn)可視化檢測分析。光學(xué)檢測技術(shù)主要分為無標簽檢測和近實時檢測兩大類,根據(jù)吸收、反射、折射和色散等參數(shù)還可進一步分為比色生物傳感器、熒光生物傳感器、表面等離子體共振(surface plasmon resonance methods,SPR)生物傳感器、表面增強拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy methods,SERS)生物傳感器等。
表2 不同光學(xué)生物傳感器在金黃色葡萄球菌檢測中的應(yīng)用Table 2 Application of different optical biosensors in detection of Staphylococcus aureus
2.2.1 比色生物傳感器
比色法是基于待測樣品對光的選擇性吸收而產(chǎn)生的可視化顏色變化或借助光譜學(xué)儀器檢測光學(xué)變化的一種分析方法。利用比色方法獨特的光學(xué)特性可實現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的快速檢測。同時,納米顆粒的引入在金黃色葡萄球菌檢測中發(fā)揮了重要作用。以抗原抗體特異性結(jié)合的免疫學(xué)分析方法與生物傳感器相結(jié)合,可實現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的高特異性和高靈敏度檢測,比色生物傳感器可進一步分為基于平面基板和溶液測量兩種形式。平面基板格式通常使用紙或玻璃作為基板,其代表類型是側(cè)向免疫分析法(lateral flow immunoassay,LFA)。Li Chenzhong等[46]基于LFA原理開發(fā)了一種多重免疫盤生物傳感器,可特異性檢測金黃色葡萄球菌,該傳感器上的免疫盤被金納米粒子修飾作為基板,并在金納米粒子上固定抗體作為生物識別元件,利用金納米粒子的光學(xué)特性,在給樣5 min內(nèi)通過測試區(qū)域的顏色變化可檢測金黃色葡萄球菌,檢出限為5.0×102~5.0×103CFU/mL?;贚FA的比色傳感器具有分析迅速的優(yōu)點,但靈敏度較低,通常僅提供半定量結(jié)果[68]。而利用膠體金納米顆粒(Au nanoparticles,AuNPs)等開發(fā)的基于溶液格式的比色傳感器具有能夠?qū)Υ笕萘繕悠愤M行簡單快速分析的優(yōu)點。Sung等[47]使用牛血清白蛋白包被磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles,MNP),并將其與AuNP和金黃色葡萄球菌抗體吸附組合成納米復(fù)合材料,利用這種新型的抗體/AuNP/MNP納米復(fù)合材料研究了基于溶液測定的比色生物傳感器在磷酸鹽緩液(phosphate buffered saline,PBS)和牛奶中檢測金黃色葡萄球菌的效率。與沒有吸附AuNP的抗體偶聯(lián)MNPs相比,抗體/AuNP/MNPs的捕獲效率顯著提高。利用AuNP的優(yōu)勢,該傳感器在PBS和牛奶中的檢出限分別為1.5×103CFU/mL和1.5×105CFU/mL。Liu Pei等[49]將金黃色葡萄球菌特異性融合蛋白pVIII的特異性識別能力與半胱氨酸(cysteine,CS)修飾的AuNPs(CS-AuNPs)的獨特SPR光學(xué)特性相結(jié)合,開發(fā)了一種新型的雙功能金納米探針(CS-AuNPs@fusion-pVIII)用于金黃色葡萄球菌的比色檢測。該比色生物傳感器分析時間短(30 min)、選擇性強、靈敏度高,實現(xiàn)了檢測限低至19 CFU/mL金黃色葡萄球菌的檢測。Suaifan等[50]基于金黃色葡萄球菌蛋白酶對特定肽底物具有水解活性的原理開發(fā)了一種新型紙基生物傳感器,以特定肽底物作為生物識別元件,并將其固定在納米磁珠和紙質(zhì)支持物頂部的金電極表面之間,當測試樣品(純培養(yǎng)和食品樣品)滴至傳感器表面時,可通過肉眼檢測顏色變化,并使用圖像處理軟件進行分析以進行定量測定。該方法無需昂貴的專業(yè)設(shè)備,操作更簡便,符合現(xiàn)場實時檢測的要求,在純培養(yǎng)和接種的食品樣品中金黃色葡萄球菌檢測限分別為7 CFU/mL和40 CFU/mL。
2.2.2 熒光生物傳感器
當某種物質(zhì)經(jīng)過一定波長的入射光(通常是紫外線)照射,吸收光能后進入激發(fā)態(tài),處于激發(fā)態(tài)的原子發(fā)生能級躍遷從而發(fā)出各種可見光,這種光學(xué)現(xiàn)象稱為熒光。熒光生物傳感器是一種功能強大且相對容易構(gòu)建的生物傳感技術(shù),通常將熒光生物識別元件與光學(xué)傳感器相結(jié)合,測定時需要使用熒光染料、量子點(quantum dot,QDs)或其他具有熒光效應(yīng)的材料作為標記物。另外,基于熒光發(fā)光原理,利用物質(zhì)之間的相互作用產(chǎn)生的催化熒光、熒光猝滅、熒光增強等現(xiàn)象可實現(xiàn)對食源性病原菌的檢測。Xue Xiuheng等[51]以巰基乙酸為配體制備高發(fā)光水溶性量子點(CdSe QDs),將其為熒光標記物共價偶聯(lián)靶標菌,并利用熒光光譜儀建立了可同時對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌快速檢測的細菌計數(shù)法,該方法的最低檢測限為102CFU/mL。Wang Xiaole等[55]構(gòu)建了多色鑭系元素摻雜的時間分辨熒光(time-resolved fluorescence,TEFL)生物傳感器,用于檢測鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)和金黃色葡萄球菌(圖3)。該傳感器將針對鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌特異性的適配體修飾在NaGdF4:Eu和NaYF4∶Ce/Tb納米材料上作為信號探針,并將兩者的適配體修飾在Fe3O4磁性納米粒子上用于捕獲探針;加入樣品后,適配體與靶標菌結(jié)合從而形成既帶有熒光納米材料又帶有磁性納米顆粒的“夾心”式復(fù)合物,經(jīng)過磁分離作用后,對復(fù)合物的熒光進行檢測以實現(xiàn)對這兩種病原菌的定量檢測,結(jié)果表明該方法對PBS中金黃色葡萄球菌的檢測限為20 CFU/mL,在加標牛奶中的檢測也顯示出其優(yōu)異的分析性能。Zuo Peng等[56]利用適配體功能化氧化石墨烯開發(fā)了一種聚二甲基硅氧烷/紙/玻璃混合微流體系統(tǒng),可一次性對包括金黃色葡萄球菌在內(nèi)的多種病原菌進行多重檢測。測定時,熒光標記適配體與金黃色葡萄球菌發(fā)生特異性結(jié)合并從氧化石墨烯中釋放出來,導(dǎo)致熒光強度增強,樣品中金黃色葡萄球菌濃度與熒光強度呈線性關(guān)系,該方法的檢測限為8×102CFU/mL。He Xiaoxiao等[57]構(gòu)建了一種雙色流式細胞術(shù)可快速靈敏地檢測金黃色葡萄球菌,該方法以適配體修飾的熒光二氧化硅納米顆粒(FSiNPs)作為捕獲探針,在適配體特異性捕獲金黃色葡萄球菌并使用SYBR Green I染料進行核酸染色后,利用雙色流式細胞儀進行檢測。此熒光生物傳感器綜合利用了適配體的高特異性、FSiNPs標記的信號放大性及雙色流式細胞儀假陽性低的優(yōu)勢,檢測靈敏度高,在測定緩沖液和牛奶樣品中金黃色葡萄球菌的檢測限分別低至1.5×102CFU/mL和7.6×102CFU/mL。Shangguan Jingfang等[59]在另一項研究中提出了正向介電電泳(positive dielectrophoresis,pDEP)驅(qū)動在線富集與適配體-熒光二氧化硅納米顆粒標記相結(jié)合的方法,用于快速、靈敏地檢測微流體通道中的金黃色葡萄球菌。該方法將金黃色葡萄球菌適配體固定在氯丙基修飾的熒光二氧化硅納米顆粒上形成適配體/熒光二氧化硅納米顆粒偶聯(lián)物,并以此作為納米探針;該探針與樣品中的金黃色葡萄球菌一起孵育后被直接引入基于pDEP的微流體系統(tǒng),通過在pDEP頻率區(qū)域施加交流電壓,納米探針標記的金黃色葡萄球菌向最強電場區(qū)域移動并在電極間隙中富集,使用熒光顯微鏡成像系統(tǒng)可檢測富集的金黃色葡萄球菌。該檢測方法得益于適配體的高特異性、熒光二氧化硅納米顆粒標記的信號放大性以及pDEP的在線富集性,檢測靈敏度高,在去離子水和人工接種水樣中金黃色葡萄球菌的檢測限分別為9.3×101CFU/mL和2.7×102CFU/mL。
圖3 同時檢測鼠傷寒沙門氏菌與金黃色葡萄球菌的時間分辨熒光生物傳感器[55]Fig.3 Time-resolved fluorescence biosensor for simultaneous detection of S.typhimurium and S.aureus[55]
2.2.3 表面等離子體共振生物傳感器
SPR是入射光以特定的共振角度撞擊到金屬膜-液體界面上,金屬膜內(nèi)由于自由電子共振增強了對入射光的吸收,從而導(dǎo)致折射率發(fā)生改變的一種物理光學(xué)現(xiàn)象。SPR傳感器是基于SPR光學(xué)特性的超靈敏檢測儀器,測定時目標分析物與固定在SPR傳感器上的生物識別元件相結(jié)合從而引起金屬膜表面折射率變化,進而導(dǎo)致SPR角度發(fā)生位移,通過目標分析物含量與SPR角度變化之間的線性關(guān)系可定量分析樣品中金黃色葡萄球菌的濃度[69]。在光學(xué)檢測方法中,基于SPR的方法是檢測金黃色葡萄球菌最常用的方法。表2總結(jié)了用于檢測金黃色葡萄球菌的SPR生物傳感器。Subramanian等[60]利用SPR傳感器表面的硫醇自組裝單分子層固定金黃色葡萄球菌抗體,捕獲抗體與金黃色葡萄球菌特異性結(jié)合引起SPR角度的變化,以此檢測金黃色葡萄球菌,檢測限為105CFU/mL。除抗體外,其他靈敏、耐用且易于獲得的生物識別元件(如裂解噬菌體)也在SPR生物傳感器中得到了應(yīng)用。Balasubramanian等[62]首次報道了以裂解溶菌體作為高度特異性和選擇性生物識別元件,使用SPR SPREERA?傳感器作為檢測平臺,實現(xiàn)了對低濃度金黃色葡萄球菌的無標簽檢測,檢測限為104CFU/mL。Tawil等[63]采用新型特異性噬菌體作為生物識別元件建立的SPR方法可以在不到20 min的短時間內(nèi)完成對MRSA的無標記、實時、特異和快速檢測,檢測限為103CFU/mL。目前,已報道的關(guān)于MRSA的耐藥機制是其產(chǎn)生獨特的青霉素結(jié)合蛋白2a,該蛋白對β-內(nèi)酰胺的親和力較低?;诖?,Tawil等[64]在另一篇報道中采用自組裝單分子層修飾的金電極固定抗青霉素結(jié)合蛋白2a的抗體,用于檢測和區(qū)分MRSA,該方法檢測時間短(20 min內(nèi)),檢測限低至10 CFU/mL。SPR是光學(xué)生物傳感器中最常用的方法,具有無標記檢測,多重分析和定量功能的優(yōu)點。但是,SPR生物傳感器在檢測整個微生物細胞等相對較大的目標物時存在一定缺點,如靈敏度相對較低。此外,SPR生物傳感器還需要復(fù)雜、大型且昂貴的設(shè)備來進行實驗室檢測。
2.2.4 表面增強拉曼光譜生物傳感器
SERS的檢測是基于在合適頻率的入射光照射下,吸附在SERS基底上的分子與納米金屬表面等離子體發(fā)生等離子共振而引起分子拉曼信號顯著增強的原理。SERS基本上是拉曼光譜和納米技術(shù)兩種技術(shù)的結(jié)合,可彌補傳統(tǒng)拉曼光譜檢測靈敏度低的不足,是一種極具潛力的快速、無損檢測技術(shù)。Zhang Hui等[66]利用金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌的適配體分別對Fe3O4磁性金納米顆粒和經(jīng)拉曼分子(巰基苯甲酸和5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB))標記的金納米顆粒進行功能化修飾,一個作為捕獲探針,一個作為SERS信號探針,基于適配體與病原菌特異性結(jié)合的原理,建立了一種夾心式的適配體生物傳感器檢測平臺,可用于同時檢測金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌(圖4)。該SERS生物傳感器分析時間短(3 h)、選擇性強、靈敏度高,檢測限為35 CFU/mL。Wang Junfeng等[67]采用相同的策略構(gòu)建了另一種新型夾心式適配體生物傳感器檢測平臺,其在DTNB標記分子修飾的金納米顆粒外包覆適當厚度的DTNB標記分子修飾的銀殼層,合成金銀核殼等離子納米顆粒(AuNR-DTNB@Ag-DTNB),作為SERS信號增強探針。該方法可實現(xiàn)金黃色葡萄球菌的單細胞檢測,檢測限低至10 細胞/mL,線性范圍為101~105細胞/mL。盡管目前已有SERS生物傳感器應(yīng)用于食源性病原菌檢測的相關(guān)報道,但其在實際應(yīng)用中仍存在一定局限性,如定量能力有限以及對光學(xué)顯微鏡、激光、單色儀等復(fù)雜專業(yè)設(shè)備的依賴性強[70]。
圖4 同時檢測金黃色葡萄球菌與鼠傷寒沙門氏菌的SERS生物傳感器[66]Fig.4 Surface-enhanced Raman biosensors for simultaneous detection of S.aureus and S.typhimurium[66]
質(zhì)量(mass-based)生物傳感器的測定原理是利用共振現(xiàn)象感知傳感器表面質(zhì)量的微小變化,共振現(xiàn)象可以通過頻率、振幅、相位等多種參數(shù)來測量。質(zhì)量生物傳感器作為一種無標記型傳感器,具有成本低且相對容易操作等優(yōu)點,但與電化學(xué)和光學(xué)生物傳感器相比,其在食源性病原體檢測領(lǐng)域的應(yīng)用仍十分有限。根據(jù)換能器的不同類型,質(zhì)量生物傳感器可進一步分為PZ生物傳感器和磁彈性(magnetoelastic,ME)生物傳感器。
表3列出了部分關(guān)于PZ生物傳感器在金黃色葡萄球菌檢測方面的研究報道。
表3 不同質(zhì)量學(xué)生物傳感器在金黃色葡萄球菌檢測中的應(yīng)用Table 3 Application of different mass-based biosensors in detection of Staphylococcus aureus
2.3.1 壓電生物傳感器
PZ效應(yīng)是指晶體在電場作用下會隨電信號以特定頻率振動,振動的頻率取決于晶體的質(zhì)量以及施加在晶體上的電頻率。20世紀50年代PZ效應(yīng)被引入傳感技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域,其中石英微天平傳感器是常見的PZ型生物傳感器。石英晶體微天平具有非常高的靈敏度,其基本工作原理是在晶體表面涂上一種特異性結(jié)合物質(zhì),例如靶標菌的抗體,然后將其放入含有靶標菌的待測溶液中;抗原(靶標菌)與晶體表面的抗體發(fā)生特異性結(jié)合,導(dǎo)致晶體質(zhì)量增加,共振頻率相應(yīng)減小,根據(jù)沉積質(zhì)量與共振頻率響應(yīng)之間的線性關(guān)系可對靶標菌進行痕量分析。目前,這種PZ生物傳感技術(shù)主要處于實驗室研究階段,還未在實際中得到應(yīng)用。He Fengjiao等[72]通過聯(lián)合使用叉指電極和石英晶體,建立了一種PZ生物傳感器可用于銅綠假單胞菌的檢測,該方法在101~106CFU/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,檢測限為10 CFU/mL,同時還被成功用于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的檢測。Lian Yan等[73]以金黃色葡萄球菌適配體作為生物識別元件開發(fā)了一種新型適配體/石墨烯叉指金電極PZ生物傳感器,用于快速、特異性地檢測金黃色葡萄球菌。該方法采用分子交聯(lián)劑將石墨烯鍵合到與石英晶體串聯(lián)的叉指金電極表面,并將金黃色葡萄球菌適配體固定在石墨烯上。由于金黃色葡萄球菌和適配體的特異性結(jié)合,使得適配體從石墨烯表面解離出來,從而引起電極表面的電參數(shù)發(fā)生變化,進而導(dǎo)致石英晶體的共振頻率發(fā)生變化,通過頻率變化與細菌濃度之間的線性關(guān)系檢測樣品中的金黃色葡萄球菌。該生物傳感器的檢測限為41 CFU/mL,在4.1×101~4.1×105CFU/mL范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。
2.3.2 磁彈性生物傳感器
近年來,ME無標記型生物傳感器在傳感領(lǐng)域備受關(guān)注,其主要采用磁致伸縮材料帶作為傳感元件,具有成本低、使用方便、靈敏度高、無線傳感等優(yōu)點。磁致伸縮材料受到外加交變磁場的作用會沿磁場方向伸長或收縮,從而將磁能轉(zhuǎn)化為機械振動,通過感應(yīng)線圈可以從遠處無線檢測到這種機械振動[25]。ME生物傳感器本身是磁致伸縮的,對ME材料的質(zhì)量變化非常敏感,其基本工作原理是目標分析物與固定在帶狀ME傳感器表面上的生物受體會發(fā)生特異性結(jié)合,從而引起傳感器的質(zhì)量負載發(fā)生變化,進而相應(yīng)地引起傳感器共振頻率的變化,通過測定共振頻率變化可以對目標分析物進行快速而準確地測量。Hiremath等[74]利用裂解噬菌體作為生物識別元件開發(fā)了一種ME生物傳感器用于檢測MRSA,檢測限為103CFU/mL。Byeon等[75]在另一篇報道中同樣采用裂解噬菌體作為生物識別元件建立了ME生物傳感器用于現(xiàn)場檢測菠菜葉片中的MRSA,該方法檢測限為1.76×102CFU/mL。Rahman等[78]建立了基于金黃色葡萄球菌適配體結(jié)合的ME生物傳感器來檢測樣品中的金黃色葡萄球菌,該傳感器具有良好的選擇性和靈敏度,檢測限低至5 CFU/mL。
近年來,由金黃色葡萄球菌及其毒素引起的食源性疾病越來越多,特別是隨著MRSA的出現(xiàn),人們對金黃色葡萄球菌的檢測更加關(guān)注。傳統(tǒng)的金黃色葡萄球菌檢測的方法,如培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法、核酸分析法等均具有一定局限性。而基于免疫學(xué)的生物傳感器技術(shù)由于快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)勢逐漸發(fā)展起來。本文系統(tǒng)闡述了基于電化學(xué)、光學(xué)和質(zhì)量學(xué)分析的應(yīng)用于金黃色葡萄球菌檢測的生物傳感器的最新研究進展。電化學(xué)生物傳感器具有強大的理論背景支撐,響應(yīng)速度快、成本相對較低,還具有微型化、便攜式以及可再生等方面的研發(fā)潛力,在金黃色葡萄球菌生物傳感器應(yīng)用領(lǐng)域處于領(lǐng)先地位并持續(xù)迅速發(fā)展。光學(xué)生物傳感器充分發(fā)揮了光纖和集成光學(xué)傳感器的優(yōu)勢,可實現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的可視化、無標簽、實時檢測分析。而質(zhì)量學(xué)生物傳感器與電化學(xué)和光學(xué)生物傳感器相比,目前在金黃色葡萄球菌檢測上的應(yīng)用還很少,但鑒于其無標記、成本低且相對容易操作等特點,在未來生物傳感器研發(fā)和應(yīng)用領(lǐng)域仍有很大潛力。盡管不同類型的生物傳感器各有優(yōu)勢,同時對其應(yīng)用使得檢測特異性、靈敏度和抗外界干擾能力大大提高,檢測時間進一步縮短。然而,目前所研發(fā)的傳感器仍然存在一些問題亟待改進:無法滿足對多種金黃色葡萄球菌的同時檢測;傳感器的生物識別元件以抗體為主,穩(wěn)定性差、容易失活且制備周期長;非特異性吸附會影響檢測結(jié)果的準確性;只有少數(shù)實現(xiàn)了區(qū)分活細胞和死細胞的功能;樣品基質(zhì)(pH值、溫度、離子黏度和強度等)對生物傳感器的應(yīng)用產(chǎn)生較大的影響等。因此,在設(shè)計生物傳感器時,采用諸如適配體、分子印跡聚合物、納米材料、噬菌體等新型生物識別元件,能明顯改善生物識別元件的易變性及選擇特異性;運用免疫磁珠等分離技術(shù)可有效去除樣品基質(zhì)干擾,富集靶標菌,對提高傳感器的適用性具有重大意義;與納米技術(shù)或其他學(xué)科的融合,有望進一步降低檢測成本和時間,大大提高生物傳感器的靈敏度、穩(wěn)定性,并實現(xiàn)同時檢測包括金黃色葡萄球菌在內(nèi)的多種食源性病原體。