宋平麗，李 剛，許建鋒，馬青翠，亓寶秀，2，張玉星

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河北 保定 071000；2.利物浦約翰摩爾斯大學(xué)，利物浦 L3 3AF)

赤霉素(Gibberellin，GA)是植物生長發(fā)育過程中起重要作用的一種植物激素。GA信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程主要是通過形成GA-GID1(Gibberellin insensitive dwarf 1)復(fù)合體后再與DELLA結(jié)合，誘導(dǎo)DELLA被泛素化降解，從而解除DELLA的阻遏作用，引起下游基因的表達，導(dǎo)致GA反應(yīng)[1]。其中赤霉素受體GID1是赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中與赤霉素特異性結(jié)合的關(guān)鍵蛋白，是植物感知赤霉素信號所必需的受體蛋白，對GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起重要作用[2]。

2005年GID1基因首次在水稻GA不敏感的矮化突變體gid1中被鑒定出來[2]。2006年，研究人員在擬南芥基因組中鑒定出3個水稻GID1的同源基因，分別是AtGID1a、AtGID1b和AtGID1c，單基因突變均不會引起矮化表型，但是三突卻表現(xiàn)出GA不敏感的極矮化表型，證明它們功能冗余[3-4]。Hollender等[5]發(fā)現(xiàn)，桃樹(Prunuspersica)發(fā)育遲緩性侏儒癥(Brachytic dwarfism trait)是由于赤霉素受體PpeGID1c無義突變造成的，且改變GID1c的表達可以在不影響果實發(fā)育的情況下控制樹體大小。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，赤霉素受體GID1基因已相繼從楊樹[6]、棉花[7]、茶樹[8]、甘藍型油菜[9]、板栗[10]、葡萄[11]等物種中成功分離和表達。

CRISPR/Cas9 技術(shù)自2013年被發(fā)現(xiàn)以來，迅速被國際生物界關(guān)注并應(yīng)用，已經(jīng)成為基因組定點編輯的首選方法。目前，在園藝植物上也獲得了一些成功案例[12]。Illouz-Eliaz等[13]針對番茄中存在的3個GID1，通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了單突、雙突和三突，發(fā)現(xiàn)在適宜生長條件下，只有三突(gid1TRI)長勢弱小，葉色黑綠，而單突卻沒有明顯的表型，證明3個GA受體在適宜條件下功能冗余。以上研究也為CRISPR編輯技術(shù)在其他植物進行GID1基因編輯提供了重要參考。

杜梨以其抗性強，適應(yīng)性廣，與梨品種嫁接親和力強等優(yōu)點，成為我國北方應(yīng)用最為廣泛的砧木[14]。由于其生長勢強，嫁接品種后樹體高大，給梨樹矮化密植栽培帶來較大的困難。本研究以杜梨為試材，通過克隆PbGID1家族基因，分析其氨基酸序列，設(shè)計相關(guān)突變關(guān)鍵靶位點，構(gòu)建一套可同時編輯PbGID1家族基因的CRISPR/Cas9載體，轉(zhuǎn)化至杜梨子葉并再生出陽性植株，旨在為將來獲得矮化杜梨砧木提供理論和技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用杜梨葉片取自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)梨工程技術(shù)研究中心杜梨資源圃，液氮速凍后，-80 ℃冰箱保存。

試劑及菌株：PrimeSTAR?Max DNA Polymerase高保真DNA聚合酶和T4DNA連接酶訂購于TaKaRa公司，BsaⅠ-HF購自New England Biolabs(NEB)公司，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和pEASY-Blunt Zero Cloning Kit克隆載體購自北京全式金生物，KOD-Plus高保真酶訂購于東洋紡生物科技有限公司，DNA純化和膠回收試劑盒、引物合成和其他試劑均訂購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司。植物表達載體pYLCRISPR/Cas9P35S-N和CRISPR/Cas9中間載體pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU6-1、pYLgRNA-AtU6-29均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光教授課題組提供[15]。農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105為河北農(nóng)業(yè)大學(xué)梨工程技術(shù)研究中心保存。

1.2 杜梨總RNA提取、cDNA合成和基因組DNA提取

杜梨總RNA提取參照TIANGEN RNA prep Pure Plant Kit提供的方法(天根生化科技有限公司)；cDNA合成參照TIANGEN FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒提供的方法(天根生化科技有限公司)；gDNA采用M5 HiPer Plus多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒提取(北京聚合美生物科技有限公司)。

1.3 基因結(jié)構(gòu)及氨基酸序列分析

根據(jù)杜梨測序基因組數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，利用擬南芥AtGID1基因序列進行同源搜索，針對搜索的序列設(shè)計相關(guān)克隆引物(表1)。分別以杜梨cDNA和gDNA為模板擴增PbGID1家族基因。擴增程序為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 延伸 2 min。PCR產(chǎn)物進行膠回收后，連接至pEASY-Blunt Zero Cloning Kit克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，挑取單克隆測序。

利用GSDS(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn)在線軟件[16]，對測序的cDNA序列和基因組DNA序列構(gòu)建基因結(jié)構(gòu)；采用ClustalW 2(https：// www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)進行多序列比對，并利用 GeneDoc軟件對序列比對結(jié)果進行編輯并輸出。

1.4 CRISPR/Cas9靶點設(shè)計及載體構(gòu)建

根據(jù)克隆的杜梨PbGID1s基因序列，使用CRISPR-P v2.0(crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2.0/)在線軟件尋找潛在靶位點。靶點序列應(yīng)位于基因外顯子區(qū)域且不跨越內(nèi)含子；靶點序列盡量不要包含4個及以上連續(xù)的胸腺嘧啶T；根據(jù)靶點GC含量和位置選擇潛在靶點，最終確定8個靶點T1～T8。

根據(jù)唐雨薇等[17]報道的方法進行載體構(gòu)建，載體系統(tǒng)包含雙元植物表達載體pYLCRISPR/Cas9P35S-N和針對8個靶點的sgRNA表達盒中間載體pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU6-1和pYLgRNA-AtU6-29。引物參照表2合成，共需要進行2輪PCR，第1輪PCR針對每一個靶點進行2個獨立的反應(yīng)，T1～T8的2個反應(yīng)依次為：U-F/AtU3dT1(反應(yīng)①)和gRT1/gR-R(反應(yīng)②)；U-F/AtU3bT2(反應(yīng)①)和gRT2/gR-R(反應(yīng)②)；U-F/AtU6-1T3(反應(yīng)①)和gRT3/gR-R(反應(yīng)②)；U-F/AtU6-29T4(反應(yīng)①)和gRT4/gR-R(反應(yīng)②)；U-F/AtU3bT5(反應(yīng)①)和gRT5/gR-R(反應(yīng)②)；U-F/AtU6-1T6(反應(yīng)①)和gRT6/gR-R(反應(yīng)②)；U-F/AtU6-29T7(反應(yīng)①)和gRT7/gR-R(反應(yīng)②)；U-F/AtU3dT8(反應(yīng)①)和gRT8/gR-R(反應(yīng)②)；第2輪PCR取第1輪反應(yīng)①和②的PCR產(chǎn)物混合為模板，用Pps-GGL/Pgs-GG2、Pps-GG2/Pgs-GG3、Pps-GG3/Pgs-GG4、Pps-GG4/Pgs-GG5、Pps-GG5/Pgs-GG6、Pps-GG6/Pgs-GG7、Pps-GG7/Pgs-GG8、Pps-GG8/Pgs-GGL擴增，PCR產(chǎn)物純化回收，即獲得相應(yīng)的T1-gRNA至T8-sgRNA表達盒片段。

將雙元載體pYLCRISPR/Cas9P35S-N質(zhì)粒與8個sgRNA表達盒回收片段，按表3提供的試劑比例添加，采用酶切-連接方法進行構(gòu)建，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，以卡那霉素(Kanamycin，Kan)篩選陽性菌落，并挑取單克隆，利用SP-L2/SP-R-C特異引物檢測目標(biāo)條帶大小，菌液測序后提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105備用。

表2 CRISPR/Cas9-PbGID1s 載體構(gòu)建所需引物Tab.2 Primers for CRISPR/Cas9-PbGID1s vector construction

表3 表達載體構(gòu)建體系Tab.3 Expression vector construction system

1.5 杜梨子葉浸染及遺傳轉(zhuǎn)化

杜梨子葉再生參照林靜[18]的方法，遺傳轉(zhuǎn)化參照龐宏光[19]的方法，主要操作包括：杜梨種子消毒、子葉誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)4個步驟。

陽性植株檢測：將在篩選培養(yǎng)基上生長的抗性芽及對照正常培養(yǎng)40 d后，對抗性苗和對照植株進行編號，提取基因組DNA，根據(jù)表達載體序列設(shè)計特異引物VecF/VecR(表4)，凝膠成像后根據(jù)條帶大小判斷抗性苗是否為轉(zhuǎn)基因陽性苗。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜梨PbGID1s基因克隆

以杜梨cDNA和基因組DNA為底物進行PbGID1s的克隆，利用特異引物(表1)，克隆到杜梨PbGID1家族的4個成員，分別命名為PbGID1b-1、PbGID1b-2、PbGID1c-1和PbGID1c-2，如圖1所示，PbGID1b-1、PbGID1b-2，PbGID1c-1和PbGID1c-2的CDS序列分別為1 041，1 041，1 095，1 035 bp，DNA全長分別為1 401，1 373，1 706，1 640 bp?；蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，PbGID1s家族成員均含有2個外顯和1個內(nèi)含子(圖1-C)。

2.2 PbGID1s氨基酸序列分析

對4個杜梨PbGID1s氨基酸序列進行比對發(fā)現(xiàn)(圖2)，4個PbGID1蛋白中均存在激素敏感酯酶家族保守的HGG和GXSXG保守域。擬南芥AtGID1s蛋白序列包含13個與GA或 DELLA的結(jié)合區(qū)，N端至C端依次為TWVLIS、LDR、FFHGGSF、HS、IYD、YRR、DGW、GDSSGGNI、GNI、MF、LDGKYF、WYW和 GFY[20]，對PbGID1s的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，除PbGID1b-1蛋白LDR結(jié)構(gòu)域中的D被E取代外，其他結(jié)合區(qū)序列一致。以上結(jié)果表明，杜梨4個PbGID1s蛋白均具有GID1家族特有的保守結(jié)構(gòu)，且在GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要功能的氨基酸結(jié)構(gòu)域與模式植物高度相似，屬于GID1家族成員。

表4 陽性植株檢測引物Tab.4 Primers for detection of positive plantlets and gene editing effect

A、B.分別以杜梨cDNA(A)和gDNA(B)為模板的PCR電泳圖。1.PbGID1c-1；2.PbGID1c-2；3.PbGID1b-1；4.PbGID1b-2。C.PbGID1s基因結(jié)構(gòu)。A，B.Gel electrophoresis of PCR products amplified using cDNA(A)or gnomonic DNA(B)of Pyrus betulifolia as template.1.PbGID1c-1；2.PbGID1c-2；3.PbGID1b-1；4.PbGID1b-2.C.Gene structure of PbGID1s.

2.3 基因編輯打靶位點的設(shè)計

針對杜梨PbGID1家族的每個基因分別設(shè)計2～3個靶點，以此降低脫靶風(fēng)險，且靶點位置應(yīng)在保守結(jié)構(gòu)域HGG、GXSXG或關(guān)鍵結(jié)合區(qū)域上游，使PbGID1s發(fā)生關(guān)鍵位點的缺失或突變，進而失去功能。PbGID1s靶點選擇如圖3所示，共設(shè)計8個靶點，其中靶點T2、T6靶向PbGID1c-1，T1靶向PbGID1c-2，T3靶向PbGID1c-1和PbGID1c-2；T7靶向PbGID1b-1，T4、T8靶向PbGID1b-2，T5靶向PbGID1b-1和PbGID1b-2。

2.4 sgRNA表達盒和PbGID1s基因編輯載體構(gòu)建

sgRNA表達盒的構(gòu)建采用2輪PCR的方法，第1輪PCR擴增結(jié)果如圖4-A所示，靶點T1/T8、T2/T5、T3/T6和T4/T7分別以pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU6-1和pYLgRNA-AtU6-29為底物各進行2個反應(yīng)，前后2段(前段用F表示，后段用R表示)PCR產(chǎn)物分別均為150/130 bp，400/130 bp，350/130 bp，370/130 bp左右。

右側(cè)數(shù)字表示氨基酸位置。HSL家族的HGG和GXSXG保守域由星號標(biāo)出；橫線區(qū)域為GA或DELLA蛋白的結(jié)合位點。The numbers in the right indicate positions of the amino acid sequences of cDNA.The HGG and GXSXG conserved domains of the HSL family are marked by asterisks；the underlined regions are the binding sites for GA or DELLA proteins.

紅色NGG代表PAM序列。NGG highlighted in red are PAMs.

第2輪PCR將含有靶點序列的2個PCR產(chǎn)物混合后共同作為底物，使2個片段疊加成一個表達盒，擴增結(jié)果如圖4-B所示，其中攜帶T1、T2/T5、T3/T6、T4/T7和T8靶點序列的表達盒片段分別依次為288，532，488，503，289 bp，通過電泳檢查8段產(chǎn)物大小均符合預(yù)期，測序后證明sgRNA表達盒構(gòu)建成功。

將8個sgRNA表達盒按表4體系構(gòu)建至載體后，通過對陽性單克隆的菌液測序發(fā)現(xiàn)在pYLCRISPR/Cas9P35S-N載體中包含數(shù)目不等的靶點序列，其中最多包含5個靶點，分別是T1、T5、T6、T7、T8(圖4-C)，目標(biāo)靶點與啟動子在載體連接順序為AtU3d+T1-AtU3b+T5-AtU6-1+T6-AtU6-29+T7-AtU3d+T8。該序列位于pYLCRISPR/Cas9P35S-N載體2個BsaⅠ酶切位點之間，以上結(jié)果證明成功將帶有5個靶點的sgRNA表達盒構(gòu)入CRISPR/Cas9載體序列當(dāng)中，且能同時靶向PbGID1家族的4個基因。

A.第1輪PCR跑膠圖；B.第2輪PCR跑膠圖；C.重組質(zhì)粒示意圖。A.First round PCR electropherogram；B.Second round PCR electropherogram；C.Schematic diagram of plasmid recombination.

2.5 杜梨子葉遺傳轉(zhuǎn)化

將上述成功構(gòu)入5個靶點的CRISPR/Cas9載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌EHA105中用于浸染杜梨子葉，試驗重復(fù)3次，分別對浸染子葉數(shù)目、抗性子葉數(shù)目、抗性芽數(shù)目、陽性苗數(shù)目進行統(tǒng)計，統(tǒng)計結(jié)果如表5所示：第1次試驗共浸染杜梨子葉195粒，具有抗性芽的子葉為32粒，占總數(shù)的16.41%，每粒子葉再生抗性芽數(shù)目為2.01，陽性苗為10株；第2次試驗共浸染杜梨子葉200粒，具有抗性芽的子葉為21粒，占總數(shù)的10.50%，每粒子葉再生抗性芽數(shù)目為2，陽性苗為8株；第3次試驗浸染杜梨子葉200粒，具有抗性芽的子葉為33粒，占總數(shù)的16.50%，每粒子葉再生抗性芽數(shù)目為2.15，陽性苗15株。3次試驗共計浸染595粒杜梨子葉，獲得抗性芽176個，陽性植株33株，轉(zhuǎn)化效率達到5.55%。對第2次試驗結(jié)果中的抗性苗及對照苗提取基因組gDNA，用載體特異序列VecF和VecR(表4)為引物擴增，部分結(jié)果如圖5所示，空載體序列(22)為1 750 bp左右；共篩選出8株陽性苗分別編號3、6、7、11、12、15、20、23，因?qū)gRNA表達盒構(gòu)建入載體，使得PCR擴增片段為3 000 bp左右，以上結(jié)果證明該CRISPR/Cas9表達載體已成功轉(zhuǎn)入杜梨基因組。

表5 杜梨遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果Tab.5 Genetic transformation result analysis of Pyrus betulifolia

1～21，23.部分轉(zhuǎn)化植株；22.陽性對照(空載體)；24.未轉(zhuǎn)化植株。1—21，23.Partially transformed plantlets；22.Positive control(empty vector)；24.Untransformed negative control plantlet.

3 結(jié)論與討論

赤霉素受體蛋白GID1在GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起重要作用，負(fù)調(diào)控因子DELLA蛋白阻遏GA信號，而GA-GID1-DELLA復(fù)合體的形成是阻遏蛋白DELLA被降解的前提[21]，并且該復(fù)合體的形成也會一定程度降低植物體內(nèi)游走的DELLA蛋白含量，從而降低DELLA蛋白對植物生長的抑制作用[22]。Cheng等[23]發(fā)現(xiàn)，壽星桃作為一種對GA處理不敏感的矮化突變體就是因為PpGID1c的第191位氨基酸發(fā)生突變，導(dǎo)致其不能與DELLA發(fā)生互作引起的矮化。因此GID1功能喪失或改變，使其不能形成復(fù)合體，可能會抑制或阻遏GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使植株出現(xiàn)對GA不敏感的矮生表型。本研究利用同源克隆方法克隆得到4個杜梨GID1家族基因，通過序列比對及保守結(jié)構(gòu)分析推測該家族基因均符合GID1蛋白特征，可能對杜梨GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起重要作用。

CRISPR/Cas9 作為一種由sgRNA介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，能在全基因組水平有選擇性地調(diào)控目的基因表達，通過特異性識別具有PAM序列的目標(biāo)DNA序列，對特定的靶點進行高效編輯；CRISPR/Cas9可以同時對任意數(shù)量基因進行編輯，因其具有高效、精準(zhǔn)和便捷等特點，已經(jīng)逐漸發(fā)展成為研究基因功能及物種定向改造的常用工具。但是，受限于遺傳轉(zhuǎn)化體系的不成熟，在木本植物尤其是在梨樹上的應(yīng)用仍存在很大困難。杜梨作為實生砧木在梨樹生產(chǎn)中具有重要作用，但是以杜梨為砧木的嫁接品種生長后期往往樹體高大，不利于矮化密植栽培的應(yīng)用。所以通過利用CRISPR基因編輯技術(shù)定向突變杜梨PbGID1s基因，使其獲得矮生性狀成為可能。目前，楊鋒等[24]已經(jīng)通過構(gòu)建雙靶點的CRISPR/Cas9基因編輯載體，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法，將GUS轉(zhuǎn)基因紅茄梨愈傷組織的GUS基因敲除。Pang等[25]利用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法敲除杜梨PbPAT14基因。本研究在以上研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了含有5個靶點的CRISPR/Cas9編輯載體，并成功利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式將該載體轉(zhuǎn)入杜梨基因組，為杜梨遺傳轉(zhuǎn)化提供方法支持。

盡管經(jīng)過多次嘗試和改良，本研究中心將該表達載體成功轉(zhuǎn)入杜梨子葉并獲得陽性植株。但遺憾的是，通過對陽性植株P(guān)bGID1s基因靶點前后約200～300 bp區(qū)域克隆并測序發(fā)現(xiàn)陽性植株均未發(fā)生編輯事件。究其原因，可能與本研究選用載體的啟動子非杜梨內(nèi)源啟動子而是擬南芥特異啟動子有關(guān)。Charrier等[26]在蘋果中，利用蘋果內(nèi)源啟動子U3和U6改造的CRISPR載體編輯效率顯著提高；Ren等[27]通過在葡萄中克隆本源啟動子VvU3/U6啟動sgRNA和UBQ2啟動子啟動Cas9蛋白后，也顯著提高CRISPR/Cas9載體在葡萄中的編輯效率。所以針對以上問題，接下來河北省梨工程技術(shù)研究中心將圍繞杜梨本源啟動子改造CRISPR/Cas9載體進行研究，在完善遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)上，為獲得杜梨矮生資源提供保障。

本研究克隆了4個杜梨PbGID1基因家族成員，PbGID1b-1、PbGID1b-2、PbGID1c-1和PbGID1c-2，均由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成，且PbGID1s的氨基酸序列均含有HGG和GXSXG特征保守結(jié)構(gòu)域和能與GA、DELLA結(jié)合的關(guān)鍵序列，具有赤霉素受體功能；成功將含有5個靶點的sgRNA表達盒構(gòu)建至CRISPR/Cas9基因編輯載體，并可同時靶向PbGID1家族的4個基因；利用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)，將CRISPR/Cas9-PbGID1s基因編輯載體轉(zhuǎn)入杜梨子葉，成功再生出陽性植株。