趙子丹，吳 燕，劉 霞，張鋒鋒，陳 翔，張 艷

（寧夏農(nóng)產(chǎn)品質量標準與檢測技術研究所，寧夏 銀川 750002）

馬鈴薯生長適應性強，兼具食用、加工、飼料等多種功能，目前已成為世界第四大糧食作物[1]，在我國國民經(jīng)濟發(fā)展中占有非常重要的地位。隨著馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的提出，伴隨種植規(guī)?；拇罅ν七M，病蟲害已成為嚴重制約馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的因素之一[2]。晚疫病是馬鈴薯的主要病害之一，每年可造成我國馬鈴薯減產(chǎn)約10%～15%[3]。目前，施用高效低毒的化學農(nóng)藥仍是有效防治該病害的主要方式。烯酰嗎啉（Dimethomorph）是通過抑制卵菌細胞壁的形成而殺滅病菌的內(nèi)吸性殺菌劑[4]，對霜霉目真菌類疫病有較好的防治效果[5-8]。氟吡菌胺（Fluopicolide）是一種具有內(nèi)吸傳導活性的新型低毒殺菌劑，通過作用于細胞膜和細胞間的特異性蛋白而殺滅病原菌[9]。氟吡菌胺的殘留物定義為氟吡菌胺及其代謝物2,6-二氯苯甲酰胺（BAM）。因此，在檢測氟吡菌胺時應同時檢測BAM的殘留。有研究表明，氟吡菌胺對葡萄[10-11]、馬鈴薯[12]、番茄[13]、黃瓜[14]、葉用萵苣[15]、節(jié)瓜[16]等多種作物的霜霉病、晚疫病等均具有良好的防治效果。

當前，針對馬鈴薯晚疫病防治的最有效措施是噴施復合殺菌劑[17-18]，既可降低抗性產(chǎn)生的概率，又能提高殺菌效果。關于單獨噴施烯酰嗎啉或氟吡菌胺防治馬鈴薯晚疫病的殘留檢測已有報道[19-20]。但烯酰嗎啉和氟吡菌胺的復合殺菌劑在馬鈴薯中使用后的殘留及代謝物檢測尚未見報道。本文采用超高效液相色譜串聯(lián)質譜技術，結合QuEChERS處理方法，建立了馬鈴薯中烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM的殘留量分析方法，該方法的前處理簡便、分析快速準確，可為馬鈴薯中烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM的檢測分析提供技術支撐。

通常在農(nóng)藥殘留檢測的過程中，含有殘留的樣品會在冷凍條件下儲藏一段時間，在此過程中農(nóng)藥殘留物可能會因為揮發(fā)或與酶等發(fā)生反應而有所損失或變化。因此，需要進行農(nóng)藥在該基質中的儲藏穩(wěn)定性研究。故同時進行了烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM在馬鈴薯中儲藏期間的穩(wěn)定性試驗，以期為烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM在馬鈴薯中的穩(wěn)定性研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

馬鈴薯樣品，采自寧夏農(nóng)林科學院園林場試驗基地，品種為克新1號。

烯酰嗎啉標準品（98.78%）、氟吡菌胺標準品（98.78%）、BAM標準品（99.43%），德國Dr.Ehrenstorfer公司；36%氟吡菌胺·烯酰嗎啉懸浮劑（農(nóng)藥制劑中有效成分含量為：氟吡菌胺6%，烯酰嗎啉30%），江陰蘇利化學股份有限公司。乙腈、甲醇（色譜純），默克股份兩合公司；氯化鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）、石墨化炭黑（GCB），上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.1.2 儀器與設備

AB SCIEX QTRAP 5500超高效液相色譜-三重四級桿質譜聯(lián)用儀，美國應用生物系統(tǒng)公司；PL202-L型電子天平、XS205型電子天平，瑞士Mettler Toledo儀器有限公司；MJ-PB12Power304破壁料理機，廣東美的生活電器制造有限公司；THZ-92C恒溫振蕩器，上海喬躍電子有限公司；TDL-40C低速臺式大容量離心機，上海安亭科學儀器廠；MS3 digital型渦旋混合器，德國IKA公司。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制

將烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM標準品分別用乙腈溶解并定容，配制成1 000 mg/L的標準儲備溶液，再分別用乙腈稀釋配制成10 mg/L的標準儲備液，于-18℃冰箱中保存?zhèn)溆?。樣品分析時，再分別用馬鈴薯空白基質溶液逐級稀釋為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L系列標準溶液。

1.2.2 樣品的提取與凈化

準確稱取勻漿的馬鈴薯樣品10.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，振蕩提取30 min，加入4 g氯化鈉充分振搖1 min后，4 000 r/min離心5 min。吸取上清液2.0 mL，經(jīng)50 mg PSA和50 mg C18的混合凈化劑凈化后，渦旋1 min，4 000 r/min離心5 min。上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾，待測。

1.2.3 液相色譜條件

Waters Acquity BEHC18（2.1 mm×100 mm，1.7μm）色譜柱；柱溫40℃；進樣量2μL；流動相A為甲醇，流動相B為0.1%甲酸水溶液；流速0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～3 min，流動相A 10%～90%，保持0.6 min；3.6～4.0 min，流動相A 90%～10%，保持2 min。

1.2.4 質譜條件

電噴霧離子源，電離方式：ESI+；離子源溫度：500℃；離子化電壓：5 500 V；噴霧氣流速：50 L/h；氣簾氣流速：50 L/h；碰撞氣流速：約200～600 L/h；定量方式：外標法；掃描模式：多重反應監(jiān)測（MRM）。

1.2.5 儲藏穩(wěn)定性試驗設計

稱取馬鈴薯空白樣品10.00 g于50 mL離心管中，按照0.50 mg/kg的添加水平直接在儲藏穩(wěn)定試驗所需的空白樣品中分別單獨添加烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM標準溶液，將所有離心管進行密封，放入低于-18℃冰箱中保存。將樣品制備當天、2周、1個月、2個月、4個月、6個月作為取樣時間點，每次取穩(wěn)定性試驗樣品2個進行測定，同時測定空白樣品1個，質控樣品3個。其中質控樣品為取樣當天對空白樣本分別進行烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM標準溶液的添加。定期取樣，按照建立的檢測方法測定。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用MultiQuantTM軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優(yōu)化

分別配制1 mg/L的烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM標準溶液，通過針泵進樣，在電噴霧電離ESI（+/-）方式下進行全掃描（m/z 50～450）。結果表明，目標化合物均在正離子掃描時出現(xiàn)較強的分子離子峰[M+H]+。因此，本研究選擇正離子掃描方式，以[M+H]+為化合物的母離子碎片峰，分別確定母離子后再依次優(yōu)化子離子。選擇信噪比高、峰形好、干擾小的離子對作為定性定量離子對，以多重反應監(jiān)測正離子模式分別優(yōu)化目標化合物的碰撞能量和去簇電壓等質譜參數(shù)，最終經(jīng)過優(yōu)化后獲得的質譜條件見表1。

表1 目標化合物的液相色譜-二級質譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）參數(shù)Table 1 LC-MS/MS parameters of target pesticide

采用上述確定的色譜條件和質譜條件對0.1 mg/L標準溶液進樣，得到烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM的標準溶液總離子流圖，見圖1。

圖1 烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM的標準溶液總離子流圖Fig.1 Standard solution total ion chromatogram of dimethomorph,fluopicolide and its metabolites

2.2 凈化劑的選擇

通過對PSA、C18和GCB 3種凈化劑的使用方式和用量優(yōu)化馬鈴薯中目標物凈化回收效果。試驗結果表明，GCB對烯酰嗎啉有吸附作用，因此確定選擇PSA和C18為凈化劑。通過對PSA和C18的用量進行不同配比優(yōu)化，得到50 mg PSA和50 mg C18的組合凈化效果最佳。

2.3 方法的線性范圍和檢出限

為了消除基質效應的影響，使用馬鈴薯空白樣品提取液，配制基質標準溶液。將10 mg/L的烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM標準溶液分別稀釋配制成濃度為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L系列基質標準溶液，上機測定。根據(jù)測定結果，以標準溶液濃度為橫坐標（x），響應峰峰面積為縱坐標（y），繪制烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM的標準曲線。由表2可知，烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM在0.01～0.50 mg/L濃度范圍內(nèi)線性良好，相關系數(shù)r值均大于0.999。以稱樣量為10 g，定容體積為20 mL計，通過3倍信噪比計算檢出限（LOD），烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM的檢出限均為0.002 mg/kg。

表2 烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM的線性方程、r值及檢出限Table 2 Linear regression equations,correlation coef cients(r)and LOD of dimethomorph,fluopicolide and its metabolites BAM

2.4 方法的準確度和精密度

在馬鈴薯空白樣品中分別添加濃度為0.01、0.10、0.50 mg/kg的烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM的標準溶液，每個濃度重復5次，按照上述方法對樣品進行測定。由表3可知，在0.01～0.50 mg/kg添加水平范圍內(nèi)，烯酰嗎啉在馬鈴薯中平均添加回收率為90%～96%，相對標準偏差（RSD）為3.6%～5.5%；氟吡菌胺在馬鈴薯中的平均添加回收率為94%～96%，相對標準偏差為1.9%～3.2%；BAM在馬鈴薯中的平均添加回收率為93%～96%，相對標準偏差為0.6%～2.7%。上述結果表明，方法的準確度和精密度均能夠滿足農(nóng)藥殘留試驗準則的要求（NY/T 788—2018[21]），且目標峰無雜質干擾。

表3 烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM在馬鈴薯中的添加回收率和相對標準偏差（n=5）Table 3 Recoveries and relative standard deviations of dimethomorph,fluopicolide and its metabolites BAM in potato(n=5)

2.5 儲藏穩(wěn)定性試驗

由表4可知，在低于-18℃條件下儲藏6個月的試驗期間，馬鈴薯基質中烯酰嗎啉的平均降解率為7%～19%，質控結果為92%～97%；氟吡菌胺的降解率為0～16%，質控結果為92%～100%；BAM的降解率為0～13%，質控結果為93%～101%，其中質控樣品檢測結果以平均回收率表示，結果符合農(nóng)藥殘留試驗準則的要求。根據(jù)NY/T 3094—2017[22]的規(guī)定，每個取樣時間點的儲藏試驗樣品中烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM的降解率均小于30%，表明在儲藏溫度低于-18℃、儲藏時間為6個月的試驗期間，烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM在馬鈴薯基質中均比較穩(wěn)定。

表4 烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM在馬鈴薯中的儲藏穩(wěn)定性結果Table 4 Storage stability results of dimethomorph,fluopicolide and its metabolites in potatoes 單位：%

3 結論

本試驗以乙腈為提取試劑，建立了馬鈴薯中烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM檢測的超高效液相色譜串聯(lián)質譜分析方法。方法采用QuEChERS前處理，乙腈用量少，分析時間短，節(jié)約了試驗成本，提高了試驗效率，可為其他農(nóng)產(chǎn)品及食品中烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM的殘留檢測提供參考依據(jù)。烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM在0.01～0.50 mg/kg濃度范圍內(nèi)的平均添加回收率為90%～96%，表明方法的準確度高，精密度好，符合農(nóng)藥殘留檢測分析要求。儲藏穩(wěn)定性試驗結果表明，儲藏溫度低于-18℃、儲藏時間為6個月的試驗期間，烯酰嗎啉、氟吡菌胺及其代謝物BAM在馬鈴薯中均比較穩(wěn)定。