劉 豐，田運(yùn)霞，吳遠(yuǎn)根，陶 菡

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，發(fā)酵工程與生物制藥省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025）

目前，食品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)的問(wèn)題非常普遍和嚴(yán)重，尤其以糧食、果蔬等農(nóng)產(chǎn)品為主，由此帶來(lái)的食品安全問(wèn)題是公共健康面臨的最主要威脅之一[1-2]。因此，農(nóng)殘的監(jiān)控和檢測(cè)成為各國(guó)政府和民眾強(qiáng)烈關(guān)注的問(wèn)題。

農(nóng)藥檢測(cè)當(dāng)前基本依賴(lài)于大型儀器分析技術(shù)，如色譜、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、光譜等[3-5]，以上方法檢測(cè)通量大、靈敏度高，但儀器昂貴、操作復(fù)雜、攜帶不方便，而且需要比較復(fù)雜的前處理過(guò)程，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，所以應(yīng)該開(kāi)發(fā)出快速、準(zhǔn)確且低成本的檢測(cè)方法。相比而言，電化學(xué)傳感技術(shù)不僅具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)[6-7]，而且可以開(kāi)發(fā)成便攜式檢測(cè)儀實(shí)現(xiàn)田間或農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的實(shí)時(shí)檢測(cè)[8-9]。因此，電化學(xué)農(nóng)殘檢測(cè)技術(shù)近年來(lái)受到了廣泛關(guān)注[10-11]。

基于農(nóng)藥對(duì)酶生物活性的抑制可以實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥的快速檢測(cè)[12]。目前用于農(nóng)藥檢測(cè)的酶主要是乙酰膽堿酯酶（EC 3.1.1.7），其來(lái)源于動(dòng)物，提取工藝繁瑣，原材料珍貴，成本高[13]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)來(lái)源于植物的酯酶（EC 3.1.1.X）具有與乙酰膽堿酯酶相似的作用機(jī)理，其酶活也可以被農(nóng)藥所抑制且其對(duì)農(nóng)藥的敏感性不遜于膽堿酯酶[14-15]。此外，植物酯酶存在于各種農(nóng)作物中，來(lái)源十分豐富，提取方法簡(jiǎn)單，價(jià)格也更加低廉[16]，且對(duì)酶的保存條件不像膽堿酯酶那樣苛刻。因此采用植物酯酶代替乙酰膽堿酯酶測(cè)定農(nóng)藥殘留將會(huì)是一種更經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

基于此，本研究以小麥酯酶（plant-esterase from wheat flour，wPLaE）為酶源，構(gòu)建基于酶抑制作用的電化學(xué)農(nóng)藥檢測(cè)技術(shù)。同時(shí)，借助多壁碳納米管（multiwalled carbon nanotubes，MWNT）和納米金（gold nanoparticles，AuNPs）的協(xié)同電催化效應(yīng)增敏傳感信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了有機(jī)磷農(nóng)藥敵敵畏的準(zhǔn)確、低成本檢測(cè)。目前鮮見(jiàn)基于wPLaE結(jié)合AuNPs/MWNT納米材料用于農(nóng)藥檢測(cè)的相關(guān)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建可用于有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)的新型電化學(xué)酶?jìng)鞲衅鱊F/wPLaE-CS/AuNPs/MWNT/GCE，以期為植物酯酶在電化學(xué)傳感領(lǐng)域的應(yīng)用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥、大米、生菜購(gòu)于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

殼聚糖（chitosan，CS）、PEG 1000、硫酸銨、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、濃硫酸、硝酸、檸檬酸鈉、HAuCl4、乙醇、檸檬酸、葡萄糖（均為分析純）和Nafion 117溶液 上海阿拉丁試劑有限公司；敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品、溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品、多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品、林丹標(biāo)準(zhǔn)品、1-乙酸萘酯（1-naphthyl acetate，1-NA）（分析純） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；Al2O3打磨粉 上海辰華有限公司；MWNT 先豐納米有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI660E電化學(xué)工作站 上海辰華儀器有限公司；A-10超純水儀 美國(guó)Milipore公司；SB-5200 DTD超聲清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；S-3400N掃描電鏡 日本日立公司；3K18離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；BSA124S-CW電子天平（可讀精度0.000 1 g）德國(guó)Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 wPLaE的提取與純化

小麥洗凈晾干后粉碎，稱(chēng)取適量小麥粉，按照1∶5（g/mL）比例加入蒸餾水，攪拌30 min，4 ℃浸提過(guò)夜，離心取上清液，即得到植物酯酶粗酶液。參照文獻(xiàn)[17]進(jìn)行雙水相萃取，得到純化后的wPLaE，冷凍干燥成粉末，儲(chǔ)存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）配制

先分別配制0.2 mol/L Na2HPO4溶液（A液）和0.2 mol/L NaH2PO4溶液（B液），取315 mL A液和685 mL B液混合均勻得pH 6.5的PBS。取720 mL A液和280 mL B液混合均勻得pH 7.2的PBS。

1.3.3 MWNT酸化

將1 g MWNT用80 mL濃硫酸與硝酸（H2SO4∶HNO3=3∶1，V/V）的混合物在80 ℃回流180 min，對(duì)納米碳管進(jìn)行羧基化，離心，棄上層懸浮液，然后水洗至pH值近中性，將產(chǎn)物在65 ℃真空干燥。

1.3.4 AuNPs的制備

150 mL超純水?dāng)嚢杓訜嶂练序v，迅速加入4.5 mL 1%的檸檬酸鈉溶液與1.5 mL 1%的HAuCl4溶液，繼續(xù)反應(yīng)至溶液顏色變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)沸騰15 min后停止加熱，繼續(xù)攪拌至冷卻[18]。將AuNPs溶液儲(chǔ)存于棕色瓶中，4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 酶電極的制備

將玻碳電極（glassy carbon electrodes，GCE）用0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉末打磨并拋光至鏡面，然后依次用水、乙醇、超純水超聲清洗，在PBS（0.2 mol/L、pH 7.2）中活化后備用。首先在GCE表面滴加6 μL 0.5 mg/mL的MWNT溶液，室溫晾干后，依次向電極表面滴加6 μL AuNPs和24 μL wPLaE-CS混合液，最后取4 μL Nafion（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%）滴涂在電極表面，制成NF/wPLaE-CS/AuNPs/MWNT/GCE。

1.3.6 電化學(xué)測(cè)試

采用三電極檢測(cè)裝置：修飾GCE為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，Ag/AgCl為參比電極。以PBS（0.2 mol/L、pH 6.5）溶液為測(cè)試底液，將制備好的電極首先在含有0.8 mmol/L 1-NA的PBS（0.2 mol/L、pH 6.5）中進(jìn)行方波伏安（square wave voltammetry，SWV）檢測(cè)得電流值I0，電極清洗后，將電極浸入不同質(zhì)量濃度的敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)液中孵育10 min，再次將其浸入含有同濃度底物的PBS（0.2 mol/L、pH 6.5）中進(jìn)行SWV檢測(cè)得電流值I1，根據(jù)下式計(jì)算抑制率Y：

1.3.7 實(shí)際樣品的制備

稱(chēng)取25 g（精確至0.000 1 g）生菜樣品，加入100 mL PBS（0.2 mol/L、pH 6.5）粉碎至漿，然后將生菜勻漿在8 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液，稀釋20 倍后作為生菜汁實(shí)際樣品。

大米磨至粉末，過(guò)80 目篩，稱(chēng)取0.03 g（精確至0.000 1 g）大米粉與100 mL PBS（0.2 mol/L、pH 6.5）混合均勻，并在8 000 r/min離心30 min，離心后取0.2 mL上清液用20 mL超純水稀釋作為大米實(shí)際樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米材料表征

如圖1a所示，MWNT呈細(xì)長(zhǎng)的管狀，直徑在30 nm左右，且多個(gè)管狀結(jié)構(gòu)堆疊纏繞形成中空的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可為后續(xù)材料的修飾提供更多的附著位點(diǎn)。

如圖1b所示，紫外-可見(jiàn)光譜在518 nm波長(zhǎng)處有最大吸光度，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[19]，不同粒徑、不同濃度的AuNPs有不同的特征峰與最大吸收波長(zhǎng)，且AuNPs的最大吸收波長(zhǎng)與其粒徑呈線(xiàn)性相關(guān)：λ=0.786D+505.53，其中λ為最大吸收波長(zhǎng)，D為AuNPs的粒徑，通過(guò)計(jì)算得到AuNPs的粒徑為（15±2）nm，與透射電鏡圖基本一致。

圖1 MWNT和AuNPs電鏡圖Fig. 1 Electron microscopic images of MWNT and AuNPs

2.2 酶電極修飾過(guò)程的電化學(xué)表征

在5 mmol/L的鐵氰化鉀探針溶液中對(duì)電極的修飾過(guò)程進(jìn)行循環(huán)伏安（cyclic voltammetry，CV）法表征，結(jié)果如圖2所示，在-0.2～0.6 V區(qū)間，所有電極都出現(xiàn)了一對(duì)氧化還原峰，對(duì)應(yīng)的反應(yīng)歷程為[Fe(CN)6]3-+e=[Fe(CN)6]4-。與裸電極（曲線(xiàn)a）相對(duì)比，修飾MWNT之后（曲線(xiàn)b）氧化還原峰電流明顯增加，這說(shuō)明MWNT具有良好的導(dǎo)電性和電催化活性，能夠促進(jìn)電子傳遞；繼續(xù)修飾AuNPs后（曲線(xiàn)c），響應(yīng)電流又出現(xiàn)小幅度提升，這得益于AuNPs的良好導(dǎo)電性。而在修飾了wPLaE和Nafion后（曲線(xiàn)d），電極的響應(yīng)電流值明顯減小，這是因?yàn)閣PLaE為蛋白質(zhì)，導(dǎo)電性能差，因而阻礙了電子的傳遞。圖2表明wPLaE被成功地修飾于電極上，且修飾后的電極比裸電極具有更好的電化學(xué)響應(yīng)。

圖2 不同修飾電極在探針溶液中的CV曲線(xiàn)圖Fig. 2 CV curves of different modified electrodes in probe solution

2.3 傳感電極對(duì)1-NA的酶催化電化學(xué)響應(yīng)

采用CV技術(shù)考察wPLaE對(duì)其底物1-NA的電化學(xué)響應(yīng)，結(jié)果如圖3所示。修飾了wPLaE的傳感器在不含底物1-NA的溶液中無(wú)任何峰出現(xiàn)（曲線(xiàn)b），加入1-NA后在0.55 V附近出現(xiàn)了一個(gè)明顯的氧化峰（曲線(xiàn)c），這是wPLaE水解底物1-NA生成了具有電化學(xué)活性的1-萘酚，隨后1-萘酚被電化學(xué)氧化產(chǎn)生相應(yīng)的氧化峰，反應(yīng)歷程如圖4所示。曲線(xiàn)a為無(wú)wPLaE的傳感器在PBS（0.2 mol/L、pH 6.5）底液中的CV圖，發(fā)現(xiàn)無(wú)任何氧化還原峰出現(xiàn)，進(jìn)一步證明曲線(xiàn)b中的氧化峰就是wPLaE催化1-NA所致。以上現(xiàn)象表明wPLaE被成功固載在電極上且保持了其酶催化活性。

圖3 不同修飾電極的CV圖Fig. 3 CV curves of different modified electrodes

圖4 酶催化反應(yīng)（a）和1-萘酚氧化反應(yīng)（b）Fig. 4 Enzyme catalyzed reaction (a) and oxidation reaction of 1-naphthol (b)

考察3種不同酶電極對(duì)同一濃度1-NA的電化學(xué)響應(yīng)（圖5）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，電極上沒(méi)有修飾納米材料時(shí)只出現(xiàn)了很小的一個(gè)氧化峰（曲線(xiàn)a）。修飾MWNT后，該氧化峰有所增大，繼續(xù)修飾AuNPs后氧化峰明顯增大且峰電位負(fù)移，這表明AuNPs和MWNT具有協(xié)同電催化效應(yīng)，能有效地促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移，從而對(duì)wPLaE的生物催化電化學(xué)響應(yīng)有顯著增敏作用。此外，AuNPs具有良好的生物相容性[20]，這有利于保持電極上wPLaE的生物活性。

圖5 不同修飾電極在含0.8 mmol/L 1-NA的PBS（0.2 mol/L、pH 6.5）中CV曲線(xiàn)Fig. 5 CV curves of different modified electrodes in PBS (0.2 mol/L,pH 6.5) containing 0.8 mmol/L 1-NA

2.4 敵敵畏對(duì)酶催化響應(yīng)信號(hào)的影響

圖6NF/wPLaE-CS/AuNPs/MWNT/GCE在不同條件下的CV曲線(xiàn)Fig. 6 CV curves of NF/wPLaE-CS/AuNPs/MWNT/GCE under different conditions

考察敵敵畏對(duì)電極上wPLaE生物催化活性的影響。由圖6可知，酶電極在未加入底物1-NA的空白PBS中未出現(xiàn)氧化峰（曲線(xiàn)a），加入底物1-NA后，出現(xiàn)了明顯的電化學(xué)氧化峰（曲線(xiàn)b），用80 μg/L敵敵畏農(nóng)藥作用后，氧化峰電流的響應(yīng)值減?。ㄇ€(xiàn)c），以上實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象說(shuō)明敵敵畏可以抑制wPLaE的活性，使得體系中生成的1-萘酚的量減少，從而導(dǎo)致1-萘酚氧化峰響應(yīng)電流也隨之減小，據(jù)此可以建立基于酶抑制作用的敵敵畏農(nóng)藥檢測(cè)新技術(shù)，檢測(cè)原理如圖7所示。

圖7 敵敵畏檢測(cè)原理示意圖Fig. 7 Schematic illustration of the principle of dichlorvos detection

2.5 敵敵畏檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

如圖8所示，隨敵敵畏質(zhì)量濃度增加，峰電流值減小，即隨敵敵畏質(zhì)量濃度增加，對(duì)wPLaE活性的抑制作用也增強(qiáng)。結(jié)果表明在10～100 μg/L范圍內(nèi)，敵敵畏質(zhì)量濃度（C）與抑制率（Y）之間呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性回歸方程為Y=0.778C+6.248，R2=0.995，檢出限為4 μg/L（RSN=3）。

圖8 不同質(zhì)量濃度敵敵畏作用后的SWV圖Fig. 8 SWV curves after treatment with different concentrations of dichlorvos

2.6 重復(fù)性和穩(wěn)定性結(jié)果

同一支電極測(cè)定5 次0.8 mmol/L 1-NA，峰電流值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%（n=5）。此外，同一批制備的5 支電極，分別測(cè)定0.8 mmol/L 1-NA，峰電流值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.3%（n=5）。

考察所制酶電極的穩(wěn)定性，每隔5 d對(duì)同一濃度的1-NA進(jìn)行測(cè)試，不用時(shí)放在4 ℃避光保存。結(jié)果表明，第5天響應(yīng)電流值減小為初始電流值的93%；第10天響應(yīng)電流值降至88%；第15天仍保持初始電流值的78%，說(shuō)明制備的酶電極具有良好的穩(wěn)定性。

2.7 抗干擾性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

考察實(shí)際樣品中可能共存的常見(jiàn)離子、有機(jī)物和其他類(lèi)型農(nóng)藥對(duì)測(cè)定的影響，結(jié)果如圖9所示（以只有敵敵畏時(shí)的響應(yīng)信號(hào)為100%）。結(jié)果表明，3 mg/L的Cl-、檸檬酸和葡萄糖與30 μg/L敵敵畏共存時(shí)，響應(yīng)信號(hào)沒(méi)有明顯改變，說(shuō)明所建方法具有良好的抗干擾能力。但當(dāng)300 μg/L的Pb2+與30 μg/L的敵敵畏共存時(shí)，響應(yīng)信號(hào)降低為原來(lái)的63%，說(shuō)明Pb2+也能抑制wPLaE活性，對(duì)測(cè)定有干擾。此外，30 μg/L的林丹（有機(jī)氯類(lèi)農(nóng)藥）和溴氰菊酯（擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥）共存對(duì)測(cè)定幾乎無(wú)干擾，但30 μg/L多菌靈（氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥）共存時(shí)，響應(yīng)信號(hào)明顯下降，表明其對(duì)wPLaE活性有抑制。但同樣的抑制作用也在其他植物酯酶型和乙酰膽堿酯酶型傳感器中出現(xiàn)。

圖9 NF/wPLaE-CS/AuNPs/MWNT/GCE傳感器的抗干擾性Fig. 9 Anti-interference ability of NF/wPLaE-CS/AuNPs/MWNT/GCE

2.8 與其他方法比對(duì)結(jié)果

對(duì)所建方法與近年來(lái)其他方法進(jìn)行比較。由表1可知，所建方法具有較低的檢出限。此外，雖然本法的檢出限仍高于超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜，但與昂貴的大型儀器相比，本法的具有儀器便宜、操作簡(jiǎn)單，樣品無(wú)需預(yù)處理的優(yōu)勢(shì)。

表1 本法與其他敵敵畏檢測(cè)方法比較Table 1 Comparison of this method with other dichlorvos detection methods

2.9 方法的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用NF/WPLaE-CS/AuNPs/MWNT/GCE傳感器對(duì)實(shí)際樣品（生菜和大米）中敵敵畏的檢測(cè)性能進(jìn)行考察。在實(shí)際樣品中添加不同質(zhì)量濃度的敵敵畏進(jìn)行檢測(cè)，每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3 次。從表2可以看出，對(duì)敵敵畏的檢測(cè)回收率在95.4%～107.2%之間，具有良好的回收率，表明該傳感器可以用于實(shí)際樣品中敵敵畏檢測(cè)。

表2 NF/wPLaE-CS/AuNPs/MWNT/GCE實(shí)際樣品中敵敵畏檢測(cè)結(jié)果Table 2 Recoveries and precision of dichlorvos spiked in real samples with NF/wPLaE-CS/AuNPs/MWNT/GCE

3 結(jié) 論

以來(lái)源于植物的wPLaE代替來(lái)源于動(dòng)物的乙酰膽堿酯酶為酶源，構(gòu)建了一種新型生物傳感電極NF/wPLaECS/AuNPs/MWNT/GCE，將其用于農(nóng)藥敵敵畏的簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確檢測(cè)，檢出限為4 μg/L（RSN=3）。該生物傳感電極具有良好的穩(wěn)定性，這得益于AuNPs和CS良好的生物相容性及植物酯酶自身較好的穩(wěn)定性。與大型儀器分析方法相比，所建電化學(xué)檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速、樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。該研究也可為食品中農(nóng)殘電化學(xué)傳感器的實(shí)際應(yīng)用開(kāi)發(fā)和后續(xù)便攜式電化學(xué)傳感器的研發(fā)提供一定的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。