徐春暉，王遠興

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

綠茶屬于“非發(fā)酵”型茶葉，干燥和蒸制鮮葉使多酚氧化酶失活，因此含有較低的兒茶素氧化水平（＜1%），相比紅茶和龍井茶（兒茶素氧化水平在5%～16%之間）含有更多的兒茶素[1]。此外富含礦物質、維生素、咖啡因和茶多酚等成分，具有降低心血管疾病風險、抗癌、抗纖維化特性和神經保護能力等健康益處[2--3]，是現今世界上最為廣泛流行的飲料之一[4]。

狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶是江西省的優(yōu)質名茶，生長地區(qū)山高林密、土質肥沃、雨量充沛，生長茶樹的芽葉持嫩性強，氨基酸、咖啡堿、芳香物質等含量豐富，制作出的綠茶滋味醇厚鮮爽，湯色碧綠澄明，色澤翠綠光潤，受到茶葉愛好者的廣泛青睞，現已成為當地地理標志性產品[5]。目前，名優(yōu)茶價值高，市場占有份額較大，利益豐厚，使得一些不法商家將劣質茶葉貼上名優(yōu)茶的標簽以高價出售從而獲取高價利潤[6]，這不僅造成了茶葉市場的混亂，也對茶農的利益以及名茶的名譽造成了損害[7]。目前茶葉的檢測，只針對茶葉的主要成分，如兒茶素或其他元素的檢測，這種方法局限性強，不能全面地反映出茶葉中的代謝物情況；或是依賴于品茶師的感官鑒定，這種人為方法主觀性較強，不具有說服力，缺乏科學客觀的量化依據和精確描述[8]。因此，為保護江西名茶這一寶貴市場，需要對其真實性進行控制，建立一種客觀準確的茶葉品質鑒定方法以打擊假冒偽劣產品和保證江西名茶的品質意義重大。

非靶向代謝組學是針對生物系統(tǒng)內小分子代謝物（＜1 000 Da）全面、系統(tǒng)的定性和定量分析[9]，結合多元統(tǒng)計分析技術不僅可以可視化分析樣本間的差異，還能尋找潛在差異代謝物[10]。探究不同外界因素影響下代謝物水平的變化，例如茶葉體內代謝物通常會受季節(jié)、氣候條件、土壤、肥料、遮陽和地理位置等因素影響，從而導致茶葉的質量和市場價值產生差異[11-13]。在過去十幾年里，非靶向代謝組學結合各種分析方法評估代謝物水平與外界因素之間的關系，如核磁共振、近紅外光譜或基于質譜的平臺。與其他代謝組學平臺相比，超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）具有明顯的優(yōu)勢，分辨率、靈敏度和峰重現性更高，并允許同時對多個化合物進行快速的定性或相對定量分析[14-15]。

本實驗在研究狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶揮發(fā)性成分的基礎上[5]，使用UPLC-QTOF-MS結合非靶向代謝組學技術對狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶的非揮發(fā)性代謝物進行全面高覆蓋檢測分析，探究3種江西名優(yōu)綠茶間的差異并篩選潛在差異物。構建預測模型對狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶品質進行鑒別，為保護這3種江西名茶提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

狗牯腦（26個批次）由遂川縣湯湖鎮(zhèn)遂川之寶生態(tài)農業(yè)開發(fā)有限公司提供；廬山云霧茶（25個批次）產于江西省九江市廬山茶科所茶場；婺源綠茶（25個批次）由婺源縣婺康源有限公司提供；市場茶樣（22個批次）購于茶葉交易市場和淘寶電商平臺。采集時間為2020年5月，所有茶葉樣品置于密封袋中并在4 ℃冰箱中保存。

蒸餾水 屈臣氏食品飲料有限公司；乙腈（色譜級） 德國Merck公司；甲酸 美國ROE公司；甲醇（分析純） 西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

1290 UPLC儀-6538 QTOF-MS儀（配有MassHunter Qualitative Analysis和MassHunter Mass Profiler數據處理軟件） 美國安捷倫公司；AL-104電子天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司；TDL-5-A離心機 北京東方精華苑科技有限公司；KQ5200E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本制備

將茶葉樣本（去除莖干）磨成細粉，過0.425 mm篩。準確稱取0.1 g樣品于10 mL離心管，加入6 mL體積分數70%甲醇溶液，室溫下超聲1 h，隨后以4 800 r/min離心10 min。取上清液過0.22 μm PTFE濾膜于2 mL棕色螺旋進樣瓶中，用于UPLC-QTOF/MS的非靶向代謝組學檢測[16]。

從每個樣品吸取50 μL混合制成質量控制（quality control，QC）樣本。在樣品序列分析開始前，將QC樣品連續(xù)注入10 次以平衡系統(tǒng)，確保所收集數據的可重復性，然后在整個分析過程中定期進行QC樣品分析（每隔5個茶葉樣本），以監(jiān)測儀器的穩(wěn)定性[17]。同時，在QC樣本分析后，注入空白樣品（甲醇-水（70∶30，V/V）），以減少序列分析過程中的殘留效應[18]。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫35 ℃；流動相：A為體積分數0.1%甲酸-水溶液，B為體積分數0.1%甲酸-乙腈溶液；流速0.3 mL/min；進樣量3 μL；梯度洗脫：0～25 min，98%～75% A、2%～25% B；25～35 min，75%～25% A、25%～75% B；后運行時間2 min。

1.3.3 質譜條件

模式：負離子模式；電子電離：電噴霧電離；干燥氣（N2）溫度325 ℃；干燥氣流速10.0 L/min；霧化器壓力40 psig；毛細電壓3 500 V；碰撞電壓175 V；質量掃描范圍m/z50～1 700；二級碰撞能10～50 eV；參比離子：m/z112.985 587、1 033.988 109。

1.4 數據處理

使用Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.0 4.00軟件將UPLC-QTOF-MS采集的原始數據文件（.d）通過“按分子特征查找化合物”功能進行解卷積，參數如下：峰過濾器-峰高（輪廓和質心質譜圖）：≥100 counts；離子種類-負離子：-H、+HCOO、+CH3COO；峰高-相對峰高：≥2.5%；質量過濾器：m/z112.985 587、1033.988 109。解卷積后將文件導出轉換為.cef文件，導入到MPP（MassHunter Mass Profiler）軟件中。MPP作為化學計量學軟件，可用于數據對齊、歸一化和過濾，以篩選在狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶中具有顯著差異貢獻的特征化合物。隨后，將特征化合物進行多元統(tǒng)計分析，包括主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚類分析、偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）以及熱圖分析，這些方法在之前研究中證明是可行的[19]。采用MPP軟件進行PCA和PLS-DA，聚類分析和熱圖分別采用metaboanalyst（https://www.metaboanalyst.ca）和TBtools軟件[20]繪制。

特征化合物通過準確質量、二級質譜圖、標準品以及代謝組學數據庫Massbank（https://massbank.eu/MassBank/）、ChemSpider（http://www.chemspider.com/）、Metlin（http://metlin.scripps.edu）和文獻[21-26]鑒定差異代謝物[27-28]。

2 結果與分析

選擇狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶3種江西名茶作為實驗樣本，探討不同江西名茶之間的代謝物差異。為保證茶葉來源的真實性，所有茶葉樣本均采集于當地茶園。狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶的總離子流圖如圖1所示。

圖1 狗牯腦（A）、廬山云霧茶（B）和婺源綠茶（C）的UPLC-QTOF-MS總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of UPLC-QTOF-MS of Gougunao tea (A), Lu Mountain Clouds-Mist tea (B) and Wuyuan green tea (C)

2.1 方法學驗證

獲得高質量和可靠的數據是非靶向代謝組學研究的主要前提。本研究對樣品分析方法的穩(wěn)定性和數據的可靠性進行監(jiān)測：從QC樣本中隨機挑選m/z345.081 54（3.312 min，為保留時間，下同）、195.087 12（9.266 min）、459.092 2（13.107 min）、757.219 86（18.188 min）、922.009 8（23.576 min）、1 274.273 92（32.396 min）6個特征離子，計算離子峰面積和保留時間的相對標準偏差（relative standard deviations，RSD），評估分析方法和儀器的重復性和穩(wěn)定性。結果顯示，保留時間的RSD為0.03%～0.35%，峰面積的RSD為2.90%～6.07%。此結果表明儀器具有很好的穩(wěn)定性和重復性，所采集的數據可用于進一步研究與分析。本研究認為通過多元數據分析造成的數據誤差是由樣本本身代謝物差異造成的，而非系統(tǒng)或分析造成的誤差。

2.2 數據挖掘與預處理

采用UPLC-QTOF-MS對3種茶葉的代謝物在負離子模式下進行高覆蓋檢測和分析，共檢測到2 994個代謝物。為去除無效且低濃度的代謝物，具體處理參數為：保留時間范圍0～35 min；最小絕對豐度為5 000 counts；對齊參數RT Window＝0.0%+0.15 min，Mass Window＝10×106+2.0 mDa；以所有樣品的中位數為基準線。

為獲取狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶間的差異代謝物，設置以下過濾參數：1）按標志過濾，保留在76個樣品中至少在2個樣品中出現的代謝物，以此排除“一次命中”的化合物，即該代謝物僅在1個樣品中出現，其對于數據統(tǒng)計分析沒有實質性意義；2）按頻率過濾，保留在所有樣品中至少出現80%以上的代謝物；3）按樣品變異性過濾，保留變異系數小于25%的代謝物；4）按顯著性分析過濾，包括單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）和倍數分析（fold change，FC）。采用ANOVA計算P值，使用Benjamini Hochberg進行多重測試校正，Tukey HSD作為事后檢驗，以P＜0.5為閾值；計算狗牯腦與廬山云霧茶、廬山云霧茶與婺源綠茶或狗牯腦與婺源綠茶（反之亦然）之間的FC值，以FC≥2為閾值[29]。如圖2所示，經過以上參數設置進行逐步過濾，原始代謝物的數量明顯減少，最終篩選出221個差異代謝物。

圖2 采用MPP對狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶進行數據過濾得到差異代謝物Fig. 2 Data filtration to identify characteristic differential metabolites among Gougunao tea, Lu Mountain Clouds-Mist tea and Wuyuan green tea by using MPP analysis

為驗證最終篩選出的差異代謝物的真實性和避免假陽性，利用遞歸特征提取[30]，從原始數據中自動提取221個差異代謝物。檢驗核對生成的提取化合物色譜圖，發(fā)現僅有1個假陽性（2個相同的差異代謝物），將其移除，故最終篩選出220 個差異性代謝物。

2.3 狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶的化學計量學分析

2.3.1 PCA

在上述數據預處理后，對220 個差異代謝物進行PCA，對狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶的差異情況進行總體概覽。從圖3可以看出，前2個PC的累計貢獻率達80%，這說明前2個PC可以解釋80%的全部信息，該PCA可為鑒別3種江西名茶差異提供足夠的可信度。3種江西名茶根據類別分別被投影為不同顏色的小球，狗牯腦、廬山云霧茶與婺源綠茶明顯聚為3 組，基本得到了有效區(qū)分，說明這3種茶葉的代謝物在種類和相對含量上存在明顯差異。

圖3 狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶PCA三維得分圖Fig. 3 PCA score plot of Gougunao tea, Lu Mountain Clouds-Mist tea and Wuyuan green tea

2.3.2 聚類分析

根據各組代謝物豐度的相似性對樣品進行聚類，聚類分析結果如圖4所示，狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶三者明顯被區(qū)分開，這與PCA結果相對應。狗牯腦與廬山云霧茶距離較近，距離婺源綠茶較遠，說明狗牯腦與廬山云霧茶的代謝物質相近，與婺源綠茶代謝物質差異較大。在同一大類中，由于茶樹品種、氣候和加工制作方法等因素的不同又分成了不同小類，代謝物質相近的茶葉在樹狀圖中相距較近，該結果與之前研究狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶之間的揮發(fā)性成分結果一致[5]。

圖4 狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶的聚類樹狀圖Fig. 4 Hierarchical cluster analysis of Gougunao tea, Lu Mountain Clouds-Mist tea and Wuyuan green tea

2.3.3 PLS-DA構建分類模型

為證明上述數據提供的判別潛力，利用MPP構建PLS-DA模型，PLS-DA是一種廣泛使用的監(jiān)督模式識別方法，能夠驗證3種江西名茶分類結果以及預測茶葉的類別。如圖5所示，本研究的PLS-DA模型由每個真實的江西名茶構建，3種茶葉具有良好的分類。在預測之前，首先對該模型進行訓練，判斷模型的準確度，如表1所示，準確度均為100%，說明該模型準確度高，可用于下一步的樣本預測[31]。為了證明該模型的預測能力，除用于尋找特征差異物和建立分類模型的76 種江西名茶樣品之外，又在當地收集了7 種江西名茶，并另外在市面購買22 種茶葉樣品。這29種樣本在未告知分類的情況下，導入PLS-DA模型進行預測，模型預測結果與實際樣本分類結果一致，準確度為100%。這些結果表明本實驗構建的PLS-DA模型具有良好的預測能力，能夠對狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶進行正確分類，可用于對市面上3種江西名茶進行真?zhèn)闻袆e。

表1 使用PLS-DA預測模型的分類結果Table 1 Results of classification using PLS-DA model

圖5 狗牯腦、廬山云霧茶與婺源綠茶的PLS-DA得分圖Fig. 5 PLS-DA score plot of Gougunao tea, Lu Mountain Clouds-Mist tea and Wuyuan green tea

2.4 狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶特征差異代謝物鑒定

QTOF-MS儀中的四極桿和碰撞池以及TOF可以提供精確的二級質譜碎片信息，用于鑒定差異代謝物。例如，在本實驗中，基于一級母離子和二級碎片離子信息鑒定m/z441.080 7、保留時間17.899 min的特征差異物。如圖6所示，在碰撞能為20 eV的狀態(tài)下母離子被轟擊碎裂為二級碎片，僅有2個片段離子（m/z169.013 7、289.072 9）與母離子具有相同的保留時間和洗脫譜。在分子式估計過程中，根據未知化合物的同位素模式，只使用C（n≤40）、H（n≤100）、N（n≤20）、O（n≤30）、P（n≤15）和S（n≤5），不考慮Br、Cl、I和F，因為這些元素在茶葉化合物中發(fā)生的概率相當低。以質量誤差（Δm/z≤5×106）為閾值，根據上述設置條件，MassHunter Qualitative Analysis為母離子m/z441.080 7生成56 種潛在分子式，為碎片離子m/z169.013 7、289.072 9分別提供6個和18個潛在分子式。在這兩種情況下，Qualitative Analysis軟件對生成的分子式進行分數評估（在0～100之間）。分子式的評分根據測量質量與精確質量、同位素豐度與預測豐度的比較，以及同位素間距與預測間距的比較，而不僅僅依賴于精確的質量測量。最終評分從高至低進行排序，得分最高的分子式很有可能是正確的分子式。通過這種方式，最終選定4個候選分子式（分子式評分大于85.0）：C22H18O10、C20H16N3O9、C19H10N10O4、C18H14N6O8。使用Metlin等在線數據庫對上述候選分子式進行搜索，并與二級碎片離子信息進行比對，發(fā)現上述成分只有1 種陽性，即為表兒茶素-3-O-沒食子酸酯（C22H18O10），這是一種存在于綠茶中的黃酮類（黃酮-3-醇）物質。碎片離子m/z169.013 7 [M-C15H13O6]和m/z289.072 9 [M-C7H5O5]對應的離子片段分別是去質子化的兒茶素（或表兒茶素）和沒食子酸[22]。

圖6 表兒茶素-3-O-沒食子酸酯的二級質譜圖Fig. 6 Secondary mass spectrum of (-)-epicatechin gallate

通過以上鑒定方法，從3種茶葉樣品中共鑒定出22 種特征差異代謝物，結果見表2。將相對含量經MPP歸一化處理后導入到TBtools軟件中，再經過scale處理繪制熱圖，圖7顯示了狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶中的含量差異。

表2 狗牯腦、廬山云霧茶與婺源綠茶中22 種特征差異代謝物Table 2 Twenty-two characteristic differential metabolites among Gougunao tea, Lu Mountain Clouds-Mist tea and Wuyuan green tea

續(xù)表2

圖7 狗牯腦、廬山云霧茶與婺源綠茶中22 種特征差異代謝物含量的熱圖Fig. 7 Heatmap analysis of 22 characteristic differential metabolites among Gougunao tea, Lu Mountain Clouds-Mist tea and Wuyuan green tea

3 結 論

通過UPLC-QTOF-MS建立一種狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶品質鑒別的非靶向代謝組學分析方法，結果表明非靶向代謝組學研究在分析茶葉等復雜食品時是一種有價值的工具。使用MassHunter Qualitative Analysis和MPP進行數據挖掘、篩選，最終確定狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶中220 個特征差異代謝物，使用這些差異物進行可視化差異分析包括PCA和聚類分析，以及PLS-DA預測模型對3種茶葉依據品質進行分類。該預測模型基于當地廣泛收集的真實樣本建立，并對市面上的茶葉進行預測，結果表明其總體準確率達到100%，預測準確。該模型可應用于3種江西名茶品質的真?zhèn)闻袆e，替代繁瑣且主觀的感官評價，為打擊假冒偽劣產品和保護正宗的江西名茶提供一定的理論依據和指導意義。同時，可見將UPLC-QTOF-MS應用于食品代謝組學的鑒定和其他目的是非?？尚械目茖W方法。