王濤王鋼汪湛東姜剛剛漆文霞

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以滑膜炎和血管炎為特征的最終引起關(guān)節(jié)軟骨及骨破壞的自身免疫性疾病。RA的發(fā)生與免疫功能紊亂、免疫細(xì)胞過渡活化以及免疫細(xì)胞亞群比例失衡密切相關(guān)[1]，其中CD4+T細(xì)胞直接與該疾病有關(guān)[2]。最近研究發(fā)現(xiàn)Th17/Treg的不平衡可能在RA的發(fā)展過程中起作用，Th17細(xì)胞主要通過分泌IL-17，加速自身免疫性疾病的發(fā)生。IL-17能夠誘導(dǎo)促炎因子(如TNF-α、IL-6和IL-1β)、趨化因子[如單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1和MCP-2]和MMP的產(chǎn)生，導(dǎo)致組織的炎性改變，以及關(guān)節(jié)軟骨和骨的損傷[3]。Treg細(xì)胞分泌的IL-10和TGF-β介導(dǎo)抗炎反應(yīng)，維持自身免疫耐受狀態(tài)[4]，在RA的發(fā)展過程中，Treg細(xì)胞比例降低，功能受到抑制，而Th17細(xì)胞比例增加。TNF-α誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞功能障礙與RA滑膜內(nèi)IL-17和IFN-γ數(shù)量增加相關(guān)。TNF-α可抑制Treg細(xì)胞增殖及功能性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β的分泌[5]，用TNF-α特異性抗體治療可恢復(fù)RA患者的Treg細(xì)胞功能。Th17/Treg失衡可能是RA發(fā)生發(fā)展的原因。因此調(diào)節(jié)Th17/Treg之間的平衡成為治療RA的一個靶點。本文將對Th17/Treg失衡在RA發(fā)病機制中的調(diào)節(jié)作用進行綜述。

1 Th17生物學(xué)特性

Th17細(xì)胞于2005年被首次提出，是由原始T淋巴細(xì)胞在IL-6和TGF-β的刺激下誘導(dǎo)分化形成的，Th17細(xì)胞的分化分為3個階段：①分化階段由IL-6和TGF-β啟動；②擴增階段由IL-21介導(dǎo)；③維持階段由IL-23維持Th17穩(wěn)定與成熟[6]。在體內(nèi)幼稚Th細(xì)胞在低濃度的TGF-β和IL-6共同作用下，激活JAK1進而磷酸化STAT3，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤兒受體γt(RORγt)和視黃酸相關(guān)孤兒受體α(RORα)的表達(dá)，促進Th17細(xì)胞的分化。IL-21由Th17細(xì)胞分泌產(chǎn)生，IL-21可以促進Th17細(xì)胞表面IL-23R的表達(dá)，IL-23與IL-23R結(jié)合后依賴STAT3信號上調(diào)RORα和RORγt的表達(dá)促進Th17細(xì)胞的增殖，以自反饋方式調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的增殖[7]。IL-23并不影響Th17細(xì)胞分化，但可以促進Th17細(xì)胞的穩(wěn)定與擴增，IL-23缺乏時無法檢測Th17細(xì)胞的存在。敲除IL-23亞基p19會下調(diào)Th17細(xì)胞數(shù)量，提示IL-23對于體內(nèi)Th17細(xì)胞的增殖和存活有重要作用[8]。

Th17細(xì)胞主要通過對細(xì)胞因子的影響來發(fā)揮其生物活性的。Th17細(xì)胞可以產(chǎn)生IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23、TNF-α等細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子能夠刺激不同的細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生CXCL1、CXCL2、CXCL5、CCL2和CCL5這些趨化因子，也可產(chǎn)生NOS-2、MMP-3、GM-CSF以及致炎性細(xì)胞因子如IL-6、IL-1和TNF-α發(fā)揮其生物學(xué)作用[9]。此外，PGE2在IL-23存在下刺激了Th17細(xì)胞擴增，Th17細(xì)胞擴增又可以增加IL-23及IL-17的表達(dá)，進一步加重炎癥反應(yīng)[10]。

2 Treg細(xì)胞生物學(xué)特性

Treg細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞亞群之一，具有免疫抑制功能，它分為在胸腺的Treg(natural Treg，nTreg)和外周型Treg(induced Treg，iTreg)。nTreg直接從胸腺發(fā)育而來，iTreg在外周由幼稚的CD4+T細(xì)胞分化而來[11]。Treg細(xì)胞的標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子是叉頭盒蛋白P3(FoxP3)，F(xiàn)oxp3對于維持Treg細(xì)胞的分化成熟和功能發(fā)揮重要的作用，F(xiàn)oxp3基因敲除可導(dǎo)致nTreg細(xì)胞生成障礙，可導(dǎo)致免疫細(xì)胞增生性自身免疫病或消耗綜合征[12]。Foxp3表達(dá)增強，可導(dǎo)致部分CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg細(xì)胞，進而發(fā)揮抑制功能。在外周TGF-β可通過Smad2/Samd3磷酸化誘導(dǎo)Foxp3的表達(dá)，從而促進iTreg增殖[13]。

Treg細(xì)胞一方面分泌IL-10、TGF-β、IL-35等抗炎因子，IL-10、TGF-β二者共同誘導(dǎo)Treg細(xì)胞不斷成熟分化，使效應(yīng)性T細(xì)胞的活化、增殖受到抑制，從而維持了機體的免疫平衡[14]，Treg細(xì)胞還可降低IL-17和IFN-γ的水平，抑制炎癥進展[15]。另一方面，Treg細(xì)胞能夠上調(diào)IL-2R的表達(dá)，通過IL-2R與IL-2競爭性結(jié)合，對其他T細(xì)胞的增殖發(fā)揮阻斷作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)，成熟的Treg細(xì)胞需要持續(xù)的IL-2信號傳導(dǎo)來維持生存和抑制功能[17]?？傊?，Treg細(xì)胞在免疫自穩(wěn)和免疫耐受的維持中發(fā)揮重要的作用，對預(yù)防自身免疫性疾病的發(fā)生具有重要的意義。

3 Th17/Treg細(xì)胞平衡

Th17和Treg細(xì)胞具有同源性，皆由初始CD4+T細(xì)胞分化而來。Th17細(xì)胞分泌促炎因子引起炎癥反應(yīng)激發(fā)自身免疫，Treg細(xì)胞具有免疫抑制功能，兩者相互制約共同維護著機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。不同的細(xì)胞因子對Th17/Treg細(xì)胞平衡有影響，其中TGF-β具有調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞分化和發(fā)育、免疫耐受及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用[18]。TGF-β既可誘導(dǎo)RORγt又可誘導(dǎo)Foxp3，是Th17和Treg細(xì)胞共同產(chǎn)生的關(guān)鍵細(xì)胞因子[19]，在組織微環(huán)境中低水平TGF-β與炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、IL-21和IL-23共刺激時，初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，而高水平TGF-β能抑制RORγt的活化及功能，進而上調(diào)Foxp3的表達(dá)導(dǎo)致Treg細(xì)胞分化[20]。Th17和Treg細(xì)胞分化過程中主要轉(zhuǎn)錄因子STAT3 和STAT5也參與調(diào)節(jié)Th17/Treg的平衡。IL-6在幼稚CD4+T細(xì)胞中通過STAT3通路活化增強Th17的分化，而且在TGF-β和IL-1存在下促進Tregs分化成Th17細(xì)胞。IL-2和IL-15誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞向Treg分化，是通過STAT5通路上調(diào)Foxp3表達(dá)而實現(xiàn)的[21]。低氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)也具有調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡的作用，HIF-1可以下調(diào)Foxp3基因的表達(dá)，抑制初始CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化，還可以通過STAT3通路，使初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞方向分化[11]。某些自身免疫性疾病如RA、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥等的發(fā)生發(fā)展與Th17/Treg細(xì)胞失衡密切相關(guān)，探討Th17/Treg失衡與自身免疫性疾病的關(guān)系具有重要的意義。

4 Th17/Treg細(xì)胞的相關(guān)因子與RA

4.1 Th17細(xì)胞的相關(guān)因子與RA

Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子包括IL-17、IL-21、IL-22、TNF-α等細(xì)胞炎性因子，介導(dǎo)自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[22]。其中IL-17是Th17細(xì)胞特征性細(xì)胞因子，IL-17是導(dǎo)致慢性炎癥最主要的細(xì)胞因子，能夠引發(fā)皮膚、肌腱和滑膜的炎癥反應(yīng)[23]，在RA關(guān)節(jié)炎癥和骨破壞中發(fā)揮重要作用。RA患者的關(guān)節(jié)液、滑膜組織、外周血以及外周淋巴結(jié)等處廣泛存在IL-17[24]，Bunte等[25]通過檢測28例早期RA患者血清中IL-13和IL-17水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，早期RA患者血清中IL-13、IL-17濃度均顯著升高。IL-17協(xié)同TNF-α促進成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS)和上皮細(xì)胞產(chǎn)生VEGF，促進血管翳生成，并大量分泌IL-6、IL-8、PGE2和GM-CSF等炎癥因子，IL-17還可刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β和 TNF-α，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。研究證明IL-17A/F通過上調(diào)RUNX2蛋白表達(dá)并增強IL-6和MMP3 mRNA的水平來降低RA軟骨形成潛能[26]。IL-17A通過誘導(dǎo)FLS中MMP-13的表達(dá)，抑制共培養(yǎng)體系中軟骨細(xì)胞COL2A1 mRNA和蛋白的表達(dá)，從而促進膠原降解，參與RA相關(guān)軟骨損傷[27]。IL-17通過IL-17/IL-17RA/STAT-3信號通路上調(diào)RANKL的表達(dá)，進而刺激滑膜部位的破骨細(xì)胞的生成與分化[28]。IL-17A還可激活MAPK家族 p38、ERK、JNK 等信號通路，促進滑膜炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)骨與軟骨破壞[29]。抑制RA患者的IL-17水平對于控制RA的炎癥及骨破壞具有重要的意義。Th17細(xì)胞分泌的另一個重要促炎性細(xì)胞因子是IL-21，IL-21在各種免疫細(xì)胞的激活和增殖中起著中心作用包括Th17細(xì)胞、Tfh細(xì)胞、B細(xì)胞、FLS細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，這些細(xì)胞都參與RA發(fā)病[30]。RA患者外周血IL-21+CD4+T細(xì)胞頻率與疾病活動評分DAS28、血清抗環(huán)瓜氨酸肽(anti-CCP)抗體和類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)呈正相關(guān)[31]。IL-21能夠刺激中性粒細(xì)胞可增強STAT3磷酸化水平，促進IL-17A和IL-17F的產(chǎn)生，能上調(diào)RORC而促進Th17細(xì)胞分化與增殖。研究證明RA患者滑膜液中存在的Th17細(xì)胞產(chǎn)生大量的IL-21和IL-17，為IL-21的共刺激性提供了證據(jù)[32]。IL-21可激活ERK1/2、PI3K/AKT和STAT3通路，阻斷這些通路可抑制IL-21誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6的增殖和分泌。這些結(jié)果提示IL-21可以促進RA-FLS的增殖和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[33]，IL-21還可以通過在CD4+T細(xì)胞和FLS中誘導(dǎo)RANKL表達(dá)，可促進RA中的破骨細(xì)胞生成，同時IL-21可以促進RA-FLS中的遷移、侵襲和MMP(MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13)的產(chǎn)生，其中MMP3、MMP9的活化與PI3K、STAT-3及ERK1/2有關(guān)[34]，這些通路激活后進而介導(dǎo)骨破壞。

4.2 Treg細(xì)胞的相關(guān)因子與RA

Tregs分泌抑制性細(xì)胞因子，包括IL-10、TGF-β等，杜文靜等[35]檢測CIA小鼠血清和滑膜組織中IL-10和TGF-β，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠血清和滑膜組織中IL-10和TGF-β表達(dá)水平均顯著升高。TGF-β通過減少RA患者炎性反應(yīng)抑制免疫應(yīng)答，減輕局部滑膜炎癥、抑制軟骨及骨組織的破壞[36]，Zhu等[37]在體內(nèi)從RA或骨關(guān)節(jié)炎患者的滑膜中分離出成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞，并培養(yǎng)4～8代。免疫熒光和Western blotting檢測(上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化)EMT標(biāo)記物。TGF-β1或Smad2/3 siRNA處理RA-FLSs后，檢測EMT標(biāo)志物，Transwell法檢測RA-FLSs的遷移和侵襲能力，論證了TGF-β1通過激活RA纖維母細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(RA-FLSs)中的Smad2/3誘導(dǎo)EMT，增強了RA-FLSs的遷移和侵襲能力。Xu等[38]研究發(fā)現(xiàn)在RA關(guān)節(jié)軟骨變性開始時，軟骨下骨中TGF-β的異常激活通過向RA影響的軟骨下骨髓中招募間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和骨祖細(xì)胞，破壞了正常的骨重塑過程。Li等[39]發(fā)現(xiàn)TGF-β 1通過誘導(dǎo)Tregs的產(chǎn)生來抑制軟骨的吸。IL-10可以調(diào)節(jié)Tregs的細(xì)胞凋亡并控制RA患者的自身免疫反應(yīng)。IL-10對介導(dǎo)的免疫耐受至關(guān)重要，通過抑制抗原呈遞和促炎細(xì)胞因子分泌而發(fā)揮作用，是一種具有抗炎及免疫抑制功能的細(xì)胞因子。Luo等[40]發(fā)現(xiàn)從PBMC中分離出的Tregs可以通過IL-10和TGF-β 1防止破骨細(xì)胞分化和骨再吸收。IL-10通過降低RORγt的表達(dá)，抑制Th17 細(xì)胞，減少IL-17的分泌，并促進Treg細(xì)胞產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)[41]IL-10能夠減輕RA患者關(guān)節(jié)的腫脹和骨質(zhì)的異常增生，其機制主要是IL-10通過激活STAT3信號通路進而調(diào)控2型巨噬細(xì)胞的分化。IL-10和IL-4還可同時抑制NF-κB 信號通路的活性，抑制局部的炎癥反應(yīng)[42]。

5 Th17/Treg細(xì)胞失衡與RA

RA是一種慢性自身免疫性疾病，T淋巴細(xì)胞浸潤是其發(fā)病的關(guān)鍵。在整個疾病過程中Th17/Treg細(xì)胞呈現(xiàn)平衡失調(diào)狀態(tài)。吳曉亮[43]通過對40例RA患者Th17和Treg細(xì)胞的分化平衡進行研究，發(fā)現(xiàn)Th17/Treg水平與RA發(fā)生、發(fā)展具有一定相關(guān)性，RA患者Th17/Treg 水平顯著高于對照組，并且研究組中活動期患者Th17/Treg水平顯著高于穩(wěn)定期。Niu等[44]研究表明RA患者外周血以CD4+T細(xì)胞增加為特征。Th17細(xì)胞比例增加和Treg細(xì)胞比例降低導(dǎo)致Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞之間的失衡在RA進展中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)[45]IL-21可抑制Foxp3的表達(dá)，引起Treg細(xì)胞功能障礙，在自身免疫反應(yīng)條件下，它可以建立正反饋來放大Th17細(xì)胞打破Th17/Treg平衡，導(dǎo)致RA病情加重。Dong等[46]發(fā)現(xiàn)RA患者的miR-21水平顯著降低，miR-21參與調(diào)控Th17和Treg細(xì)胞分化的調(diào)控因子STAT3和STAT5，使STAT3表達(dá)的增加，STAT5及Foxp3 mRNA表達(dá)的下降，導(dǎo)致Th17/Treg平衡失調(diào)。在治療RA過程中，調(diào)節(jié)Th17/Treg的平衡是控制病情的作用靶點。Duarte等[47]研究發(fā)現(xiàn)，增加RA小鼠模型中滑膜Treg細(xì)胞，減少Th17細(xì)胞，糾正Th17/Treg 的比例，可在一定程度上延緩RA的病程。Wang等[48]發(fā)現(xiàn)酪氨酸羥化酶(TH)在CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)有助于緩解RA大鼠模型中Th17/Treg失衡，CIA小鼠CD4+T細(xì)胞中TH基因過表達(dá)降低了Th17細(xì)胞百分率增加了Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌，而TH基因敲除增強了Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌，降低了Treg細(xì)胞的百分率。Duarte等[47]研究發(fā)現(xiàn)，RA小鼠模型中Th17/Treg的比例失衡，通過增加滑膜 Foxp3表達(dá)，減少Th17細(xì)胞的表達(dá)，糾正Th17/Treg的失衡，在一定程度上延緩RA的進展。Nie等[49]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可通過誘導(dǎo)Foxp3去磷酸化導(dǎo)致Treg細(xì)胞功能障礙，這與RA滑膜炎癥中產(chǎn)生IL-17和IFN-γ的CD4+T細(xì)胞數(shù)量增加相關(guān)。TNF-α特異性抗體治療后可恢復(fù)RA患者的Treg細(xì)胞功能，使Th17/Treg平衡，進而有利于控制RA。

綜上所述，眾多研究已經(jīng)證實Th17/Treg失衡與RA的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，Th17/Treg失衡最終導(dǎo)致滑膜炎癥及軟骨及骨的破壞，加重RA的病情。Th17細(xì)胞促進炎癥反應(yīng)，而Treg 細(xì)胞維持自身免疫耐受，抑制炎癥反應(yīng)。二者之間的動態(tài)平衡對于控制RA的病情具有重要的意義，減少Th17細(xì)胞和增加Treg細(xì)胞是目前治療RA的一個方向，但在治療過程中如何把握Th17/Treg細(xì)胞的平衡點，以及Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞之間的相互聯(lián)系仍不清楚。因此，對Th17/Treg平衡及失衡在RA作用中進行深入研究，有利于揭示RA的滑膜炎癥與骨破壞的機制，對于尋找防治RA新的作用靶點具有重要意義。