翟柏宇 謝興文 李鼎鵬 郭云龍 潘勝?gòu)?qiáng) 劉靜

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730030 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030 3.甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身性代謝性骨病，以骨組織微結(jié)構(gòu)退化、骨量減少和骨質(zhì)量降低為特征，其發(fā)病機(jī)制則是由破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收多于成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成引起的骨重塑失衡[1]。截至2019年，我國(guó)OP流行病學(xué)調(diào)查顯示50歲及65歲以上人群OP患病率分別為19.2%和32.0%[2]。OP不僅會(huì)降低生命質(zhì)量，且由于其高致殘率、高致死率給患者及社會(huì)也帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。大量研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)成骨分化及其相關(guān)因子表達(dá)，并抑制破骨細(xì)胞分化及其活性，達(dá)到維持骨重塑平衡的目的[4]。OP在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中無(wú)準(zhǔn)確定義，屬于“骨痿”“痿證”等范疇，中醫(yī)藥防治OP歷史悠久，確有療效，且具有多通路、多靶點(diǎn)協(xié)同治療的特點(diǎn)。本文將通過(guò)闡明Wnt/β-catenin信號(hào)通路在OP發(fā)病中的分子機(jī)制，深入研究中醫(yī)藥基于該信號(hào)通路防治OP的作用及其分子機(jī)制。

1 Wnt/β-catenin信號(hào)通路在OP發(fā)病中的作用

Wnt/β-catenin信號(hào)通路即“經(jīng)典”Wnt途徑，其核心是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子β-catenin的蛋白酶體降解[5]。激活該通路關(guān)鍵在于增加β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性和積累，促進(jìn)β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，使胞內(nèi)穩(wěn)定的β-catenin通過(guò)與T細(xì)胞因子/淋巴樣增強(qiáng)因子(TCF/LEF)結(jié)合來(lái)促進(jìn)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)[4,6]。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在調(diào)節(jié)骨重建機(jī)制中扮演著重要角色。骨重建失衡被認(rèn)為是OP的主要病理機(jī)制，即破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收多于成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成。骨骼在整個(gè)生命中代謝活躍，經(jīng)歷持續(xù)的重建。骨重建體系調(diào)控嚴(yán)格，包括骨吸收周期和骨形成周期，即破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)去除礦化的骨(骨吸收)，然后通過(guò)成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)形成骨基質(zhì)，隨后被礦化(骨形成)，從而確保骨骼微損傷的修復(fù)(靶向重建)，并用新骨取代舊骨。骨吸收和骨形成的周期緊密耦合，每個(gè)骨形成周期后緊隨下一個(gè)骨吸收周期，以保持骨骼完整性[7]。

1.1 Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)成骨分化的影響

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，人類和小鼠的遺傳學(xué)研究已經(jīng)將Wnt/β-catenin信號(hào)通路確立為刺激成骨分化的關(guān)鍵機(jī)制，在實(shí)現(xiàn)骨量峰值中起著關(guān)鍵作用，可影響MSCs向OB譜系的定向分化以及OB合成骨基質(zhì)的代謝能力[8]。

β-catenin在決定MSCs分化方面起著重要作用。當(dāng)β-catenin缺乏時(shí)，MSCs則會(huì)向軟骨細(xì)胞方向分化，而無(wú)法分化為成骨細(xì)胞，進(jìn)行骨鈣素表達(dá)[9]。Holmen等[10]通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀測(cè)到，β-catenin缺陷小鼠會(huì)出現(xiàn)成骨細(xì)胞比例顯著降低和破骨細(xì)胞數(shù)量增多，使骨量總值嚴(yán)重減少，而β-catenin突變體表現(xiàn)出骨過(guò)度生長(zhǎng)。

在經(jīng)典的Wnt配體中，Wnt3a、Wnt6和Wnt10在促進(jìn)成骨分化中發(fā)揮著重要作用。對(duì)基因敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠的觀測(cè)中發(fā)現(xiàn)，Wnt10b可促進(jìn)成骨分化并增加骨量[11]。體外研究表明，Wnt6、Wnt10a和Wnt10b抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化，并通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路刺激MSCs成骨分化[9,12]。Wnt3a可激活Wnt信號(hào)或β-catenin/TCF4過(guò)表達(dá)，從而在啟動(dòng)子和基因水平刺激骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)的轉(zhuǎn)錄，證實(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路可上調(diào)BMP-2表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[13]。這些結(jié)果表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)于MSCs向OB系細(xì)胞分化至關(guān)重要。

1.2 Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)破骨分化的影響

破骨細(xì)胞祖細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化受到成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的嚴(yán)格調(diào)控。成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞分別表達(dá)核因子κB受體活化因子配體(RANKL)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，而破骨細(xì)胞祖細(xì)胞表達(dá)的集落刺激因子受體(c-Fms)和核因子κB受體激活因子(RANK)，分別是M-CSF和RANKL的受體，促進(jìn)破骨細(xì)胞祖細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞[14]。此外，成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞分泌骨保護(hù)素(Osteoprotegerin，OPG)是關(guān)鍵破骨細(xì)胞分化因子RANKL的誘餌受體，可抑制RANKL-RANK相互作用以抑制骨吸收[15]。

成骨細(xì)胞系細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活可增強(qiáng)OPG表達(dá)并抑制破骨細(xì)胞分化[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)[17]，Wnt3a可通過(guò)結(jié)合FZD和LRP5/6受體復(fù)合體，抑制GSK-3β，促進(jìn)成骨細(xì)胞內(nèi)β-catenin的積聚，積聚的β-catenin轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，與TcF/LEF一起誘導(dǎo)OPG的表達(dá)，從而抑制骨吸收。因此，Wnt3a可通過(guò)由成骨細(xì)胞介導(dǎo)OPG/RANK/RANKL途徑抑制破骨分化。研究表明，Wnt16可激活成骨細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，通過(guò)提高OPG表達(dá)抑制破骨細(xì)胞分化[18]。除了通過(guò)控制成骨細(xì)胞/骨細(xì)胞的OPG表達(dá)和分泌來(lái)間接影響破骨細(xì)胞的形成外，Wnt16還可直接刺激破骨細(xì)胞前體，抑制RANKL誘導(dǎo)的核因子-κB(NF-κB)和活化T細(xì)胞核因子1(NFATC1)的激活，通過(guò)直接抑制RANK信號(hào)抑制破骨細(xì)胞分化[19]。此外，Wnt/β-catenin信號(hào)還可通過(guò)下調(diào)TRAP、組織蛋白酶K及MMP-9 mRNA的表達(dá)，抑制單核/巨噬細(xì)胞Raw264.7(破骨細(xì)胞前體)分化成熟為破骨細(xì)胞[20]。上述研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響破骨分化的機(jī)制主要是間接影響成骨細(xì)胞介導(dǎo)的OPG/RANK/RANKL途徑和直接干預(yù)破骨細(xì)胞前體分化。

2 中醫(yī)藥介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號(hào)通路防治OP

2.1 中藥單體

中藥淫羊藿在防治OP中應(yīng)用廣泛，研究深入。淫羊藿苷(Icaritin)是從其中提取的一種活性黃酮苷，在調(diào)節(jié)BMSCs的成骨分化，預(yù)防骨質(zhì)流失和促進(jìn)骨再生方面具有潛在的應(yīng)用[21]。Wei等[22]通過(guò)淫羊藿苷干預(yù)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可通過(guò)刺激β-catenin的活化，增加總β-catenin和核易位，顯著上調(diào)Wnt信號(hào)成員(β-catenin、Lef1、TCF7、C-jun、C-myc和Cyclin D)的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨基因(Runx2、骨鉀素、DLX5、骨鈣素、Ⅰ型膠原蛋白和ERα)表達(dá)，通過(guò)激活ERα-Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而促進(jìn)BMSCs增殖及成骨分化。Gao等[23]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin通路，上調(diào)Runx2，β-catenin和c-myc在內(nèi)的成骨基因以及抗氧化因子Prdx1、Cata和Nqo1，增強(qiáng)ALP活性和鈣結(jié)節(jié)的形成，促進(jìn)BMSCs原位增殖和成骨分化，從而有效防治OP。淫羊藿總黃酮具有促進(jìn)成骨分化及骨形成作用。肖文劍等[24]通過(guò)淫羊藿總黃酮干預(yù)去卵巢骨質(zhì)疏松模型(ovariectomized，OVX)大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，淫羊藿總黃酮可顯著上調(diào)，改善大鼠骨密度，提示淫羊藿總黃酮可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路及OPG/RANK/RANKL途徑，達(dá)到促進(jìn)骨形成，抑制OC分化的目的。

牛膝作為傳統(tǒng)補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的中草藥，在防治“骨痿”“痿證”中應(yīng)用廣泛。牛膝多糖(achyranthes bidentata polysaccharide，ABP)是從牛膝中提取的一種生物活性多糖。楊豪等[25]通過(guò)牛膝多糖干預(yù)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠，觀察到骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨小梁增多，骨密度增強(qiáng)，其機(jī)制可能是牛膝多糖通過(guò)上調(diào)β-catenin、Runx2、Osterix的基因表達(dá)，調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，改善骨代謝。

葛根素(Puerarin)是從葛根中提取的一種異黃酮，葛根是一種用于治療骨質(zhì)疏松癥等多種疾病的傳統(tǒng)中草藥。李蘭[26]通過(guò)中藥活性成分葛根素干預(yù)OVX大鼠，觀察葛根素通過(guò)Wnt4/β-catenin通路在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的影響。研究表明，葛根素還可抑制可溶性卷曲蛋白2(sFRP2)表達(dá)進(jìn)而上調(diào)骨質(zhì)疏松骨組織中Wnt4/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路因子Wnt4、β-catenin、TCF1、Cyclin D1、C-myc的表達(dá)，抑制OC增殖，進(jìn)而延緩骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。羅智等[27]通過(guò)葛根素干預(yù)成骨細(xì)胞體外增殖及Wnt/β-catenin通路相關(guān)因子表達(dá)中觀測(cè)到，葛根素可顯著上調(diào)Wnt1、Wnt2、Wnt3a、Wnt10b、β-catenin的表達(dá)，通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和增殖。上述結(jié)果表明，葛根素可通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和抑制破骨細(xì)胞增殖。

白藜蘆醇(resveratrol，RES)是虎杖、藜蘆等中藥的有效活性成分之一，具有類雌激素效應(yīng)，是一種天然植物雌激素。喻琴云等[28]通過(guò)白藜蘆醇介導(dǎo)Wnt/β-catenin通路干預(yù)OVX大鼠中得出結(jié)論，白藜蘆醇可通過(guò)刺激Runx2的表達(dá)，下調(diào)Gsk3β的表達(dá)水平，使β-catenin的降解復(fù)合體無(wú)法有效形成，進(jìn)一步確保β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定積累，并向細(xì)胞核移位，從而激活Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)成骨分化，增強(qiáng)骨密度，起到防治OP的作用。

此外，骨碎補(bǔ)[29]、杜仲醇[30]、蛇床子素[31]、老鸛草素[32]等可通過(guò)激活Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)BMSCs增殖及分化、抑制破骨細(xì)胞活性，從而有效防治OP。

2.2 中藥復(fù)方

中醫(yī)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐得出“左歸丸滋腎陰，右歸丸補(bǔ)腎陽(yáng)”的理論總結(jié)[33]。左歸丸具有滋陰補(bǔ)腎的功效，長(zhǎng)期臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，左歸丸在防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中療效顯著[34]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，左歸丸可通過(guò)刺激Wnt2、LRP5表達(dá)，下調(diào)GSK3β的表達(dá)水平，確保β-catenin積累和核移位，使Wnt/β-catenin信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)揮效應(yīng)，并可上調(diào)雌激素水平，改善骨骼生物力學(xué)性能及形態(tài)，使骨吸收和骨形成周期緊密耦合，恢復(fù)骨代謝平衡，確保骨骼的靶向重建[35]。章建華等[36]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，右歸丸含藥血清可上調(diào)腎陽(yáng)虛型去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠成骨細(xì)胞中β-catenin、ERK1、ERK2 mRNA及蛋白表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，提示右歸丸防治腎陽(yáng)虛證OP的機(jī)制可能與Wnt/β-catenin、ERK1/2信號(hào)通路密切相關(guān)。對(duì)加味身痛逐瘀湯的研究中也有發(fā)現(xiàn)，加味身痛逐瘀湯可上調(diào)Wnt、Wnt1、β-catenin、Cyclin D1蛋白表達(dá)，提高骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨密度以及改善骨組織形態(tài)[37]。此外，中藥成方益腎健脾方能夠上調(diào)腎組織Wnt3a、β-catenin mRNA及其蛋白水平，提高OPG、BMP-7并降低ALP、TrACP的血清水平，增強(qiáng)去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨密度，表明益腎健脾方防治OP的機(jī)制，可能是通過(guò)干預(yù)Wnt/β-catenin通路，起到改善骨組織形態(tài)及恢復(fù)骨平衡的作用[38]。

除上述諸方以外，其他中藥復(fù)方如隴中損傷膠囊[39]、生髓健骨膠囊[40]、地黃飲子[41]等均能夠干預(yù)Wnt/β-catenin通路介導(dǎo)防治骨質(zhì)疏松。

2.3 針灸

針灸在治療“骨痿”“痿證”等疾病中療效顯著，可有效改善其臨床癥狀，達(dá)到較好的治療效果。Fan等[42]研究發(fā)現(xiàn)，電針大鼠“關(guān)元”穴可顯著上調(diào)β-catenin、Wnt3a和Runx2的表達(dá)水平，影響絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨形成和骨代謝，該研究表明電針“關(guān)元”穴防治OP機(jī)制可能與Wnt/β-catenin通路密切相關(guān)。Zheng等[43]研究發(fā)現(xiàn)，電針大鼠“脾俞”“腎俞”“命門”及“脊中”穴可激活LRP5、β-catenin和Runx2的表達(dá)，提高血清雌二醇(E2)和骨鈣素的血清水平，降低TRACP 5b的血清水平，并有效改善大鼠腰椎骨密度。表明在“脾俞”“腎俞”“命門”及“脊中”穴位長(zhǎng)期電針治療能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)緩解絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。王亞軍等[44]研究發(fā)現(xiàn)，針刺OVX大鼠“腎俞”“脾俞” “三陰交”和“足三里”穴，可上調(diào)其股骨和脛骨中Wnt3a和β-catenin的表達(dá)水平，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，恢復(fù)骨重建平衡。綜上，Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制已成為針灸靶向治療OP的重要途徑。

艾灸是針刺的重要輔助療法，與針刺相輔相成。研究指出[45]，艾灸“關(guān)元”“三陰交”穴位可刺激大鼠BMSCs成骨分化，并促進(jìn)BGP表達(dá)。其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)Wnt3a、β-catenin和TCF mRNA及BMSCs中的LRP5、LRP6 mRNA的水平，激活Wnt/β-catenin通路，從而促進(jìn)骨髓間基質(zhì)細(xì)胞成骨分化及增殖。該研究探討了艾灸防治OP的內(nèi)在機(jī)理，為OP的輔助療法提供了新的理論依據(jù)。

綜上所述，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在骨重建的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用。作為OP發(fā)病機(jī)制中重要的細(xì)胞信息傳導(dǎo)途徑之一，該通路通過(guò)在細(xì)胞核中激活β-catenin，影響MSCs向成骨細(xì)胞定向分化，刺激BMP2的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及分化，影響骨形成。此外，通過(guò)上調(diào)OPG的表達(dá)和下調(diào)RANKL的表達(dá)來(lái)間接抑制破骨分化及直接抑制破骨細(xì)胞前體分化，進(jìn)而影響骨吸收，達(dá)到骨重建平衡。

中醫(yī)藥在防治OP方面歷史悠久，療效顯著。綜上總結(jié)可發(fā)現(xiàn)，中藥單體、中藥復(fù)方及針灸等療法可通過(guò)調(diào)控Wnt配體、β-catenin、Runx2、C-myc和Cyclin D等上游因子表達(dá)，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)OB增殖分化和抑制OC的增殖，達(dá)到治療OP的目的，為中醫(yī)藥靶向治療OP提供了研究方向。然而，現(xiàn)階段中醫(yī)藥防治OP的相關(guān)研究仍體現(xiàn)出部分不足：(1)在分子機(jī)制研究中，僅以信號(hào)通路及OP相關(guān)指標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)，忽視了中醫(yī)證型的重要性；(2)缺乏對(duì)具體中藥復(fù)方防治OP的多通路研究，不能更好地發(fā)揮中醫(yī)藥多通路、多靶點(diǎn)的治療優(yōu)勢(shì)。因此，在今后的研究中，應(yīng)以Wnt/β-catenin信號(hào)通路為支點(diǎn)，深入研究中醫(yī)藥防治OP的分子機(jī)制，并對(duì)涉及單一復(fù)方的所有通路進(jìn)行研究總結(jié)，從而挖掘更多OP治療手段，為中醫(yī)藥防治OP提供更多思路。