劉莉芳,羅麗飛，陳宇龍，高澤霞,3

1.華中農業(yè)大學水產學院/農業(yè)農村部淡水生物繁育重點實驗室/農業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室/湖北省名優(yōu)魚育種與健康養(yǎng)殖工程技術研究中心，武漢 430070；2.湖北洪山實驗室，武漢 430070； 3.長江經(jīng)濟帶大宗水生生物產業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心，武漢 430070

雌激素(estrogen)是促進性腺發(fā)育和維持生殖功能必不可少的類固醇激素，也在調節(jié)能量代謝和生長發(fā)育方面起著關鍵的作用[1-2]。在魚類中，已有研究表明雌二醇 (estrogen 2，E2)可通過GH/IGF軸調控IGF的表達，也可通過雌激素受體(estrogen receptor，ER)調控IGF的表達從而影響生長發(fā)育[3]。ER是介導雌激素在多個組織器官中發(fā)揮調節(jié)作用的關鍵受體[4-5]。哺乳動物只有ERα和ERβ兩個雌激素受體基因[6]。由于基因組復制，多數(shù)硬骨魚具有ERα、ERβ1和ERβ2三個雌激素受體基因[7-9]。

團頭魴(Megalobramaamblycephala)，是中國特有的淡水養(yǎng)殖魚類，具有很高的經(jīng)濟價值。自1960年推廣養(yǎng)殖至今，已成為中國第六位大宗養(yǎng)殖淡水魚類[10]。目前，關于雌激素受體與團頭魴生長發(fā)育的關系尚未報道。因此，本研究克隆獲得了雌激素受體基因(ERα、ERβ1和ERβ2)的核心序列，并對其在3個年齡段的團頭魴生長快慢個體肌肉和性腺組織中的表達情況進行定量分析，以期為研究雌激素受體基因在調節(jié)生長與生殖發(fā)育過程中的潛在影響提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的團頭魴人工繁殖樣品來自湖北省黃岡市百榮水產良種公司。其中，挑選出同一家系中3個年齡段的團頭魴：1齡(性腺未成熟)團頭魴、2齡(性腺初次成熟)團頭魴、3齡(性腺第2次成熟)團頭魴。在不同年齡段中，各選取6尾生長快(fast growth， FG)的和生長慢(slow growth， SG)的團頭魴(雌雄各3尾)，其生長數(shù)據(jù)見圖1。魚體經(jīng)100 mg/L MS-222(Tricaine methanesulfonate)麻醉后，冰上采集肌肉、性腺組織，液氮速凍后轉至-80 ℃保存。

FG代表快速生長組，SG代表慢速生長組；FG和SG之間的顯著性差異由*(P<0.05)、 **(P<0.01)、***(P<0.001)表示。FG stands for fast-grow group,SG stands for slow-grow group; the The significant difference between FG and SG is represented by * (P <0.05), ** (P<0.01), *** (P<0.001) respectively.

1.2 總RNA提取及cDNA合成

采用Trizol法(TaKaRa，大連)提取總RNA，并用瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop 2000核酸蛋白儀(Thermo，美國)分別檢測總RNA完整性和濃度。按照HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒(Vazyme，南京)說明書合成cDNA的第一條鏈，稀釋5倍后保存于-20 ℃待用。

1.3 團頭魴ER基因克隆

通過NCBI下載斑馬魚ER基因的cDNA序列，與筆者所在課題組已獲得的團頭魴轉錄組序列進行Blast，獲得多個ER基因亞型片段。利用NCBI的primer design tool (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設計用于拼接的引物(表1)，引物由武漢擎科生物科技有限公司合成。以合成的cDNA為模板進行PCR擴增，電泳檢測擴增產物，將條帶單一的擴增產物送武漢擎科生物科技有限公司測序。測序獲得的目的基因片段用Mega 6.0軟件進行拼接，并與斑馬魚基因序列進行比對，確定團頭魴各ER基因亞型的核心序列。

表1 基因克隆引物 Table 1 Primers for gene clone

1.4 團頭魴ER基因分析及進化樹構建

通過NCBI的ORF finder程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析團頭魴ERβ1基因的開放閱讀框信息。使用ProtPara程序(https://web.expasy.org/protparam/)分析ERβ1的分子質量及等電點等理化性質，同時使用DNAman軟件對團頭魴ERβ1基因與其他脊椎動物進行氨基酸序列比對。使用Mega 6.0軟件構建ER基因系統(tǒng)進化樹。

1.5 qRT-PCR

基于獲得的團頭魴ER基因序列信息，利用NCBI的primer design tool設計定量引物(表2)，并由武漢擎科生物科技有限公司合成。選擇團頭魴β-actin作為內參基因，以團頭魴3個年齡階段2個組織的cDNA為模板，按照Hieff? qPCR SYBR Green Master Mix(Low Rox)試劑盒(翊圣，上海)說明書進行qRT-PCR反應。

表2 qRT-PCR引物 Table 2 Primers of qRT-PCR

1.6 數(shù)據(jù)分析

各基因的相對表達水平以2-△△Ct法進行計算，使用SPSS Statistics 22和GraphPad Prism 8軟件進行數(shù)據(jù)分析及作圖。采用獨立樣本t檢驗進行顯著性分析。將P>0.05描述為統(tǒng)計學差異不顯著(用“ns”表示)，P<0.05描述為統(tǒng)計學差異顯著(用“*”表示)，P<0.01描述為統(tǒng)計學差異極顯著(用“**”表示)，P<0.001描述為統(tǒng)計學差異極顯著(用“***”表示)。

2 結果與分析

2.1 團頭魴ER理化性質分析

利用同源克隆拼接核心序列，獲得了部分團頭魴ERα和ERβ2的CDS(coding sequencing)序列，以及團頭魴ERβ1基因的完整的CDS序列。ProtParam軟件預測結果顯示，團頭魴ERβ1基因的開放閱讀框為1 704 bp，其編碼的蛋白質由567個氨基酸殘基構成，分子質量為63.75 ku，理論等電點(pI)為7.54，為堿性蛋白。氨基酸殘基中Leu(11.6%)、Ser(10.8%)、Pro(6.2%)、Glu(5.8%)、Gly(5.8%)的頻率較高，極性氨基酸占59.6%，非極性氨基酸占40.4%(圖2)。消光系數(shù)(M-1cm-1γ=280 nm)為62.225，其不穩(wěn)定系數(shù)為61.78，屬不穩(wěn)定蛋白。疏水指數(shù)為77.72，平均親水性為-0.30，屬可溶性蛋白。

2.2 團頭魴ER同源性分析

使用DNAman軟件對人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)、雞(Gallusgallus)、團頭魴及其他魚類ER氨基酸序列進行同源性分析，并使用Mega軟件構建系統(tǒng)進化樹。結果顯示，團頭魴ERβ1蛋白的氨基酸序列與鯉(88.43%)、金魚(87.37%)和斑馬魚(86.39%)具有較高的同源性，與大西洋鮭(66.72%)、日本青鳉(65.14%)和大黃魚(62.06%)具有中度同源性，與小鼠(50.96%)、非洲爪蟾(50.87%)、歐亞野豬(50.00%)、雞(47.99%)和人(46.95%)具有低度同源性(圖3)。系統(tǒng)進化樹中ERα和ERβ亞型各聚成一類，形成兩大分支。團頭魴ER基因各亞型分別與鯉、金魚和斑馬魚中相應亞型的同源性較高，在進化樹中距離最近(圖4)。

圖2 ERβ1氨基酸頻率分布圖Fig.2 Amino acid frequency distribution of ERβ1

a：鯉Cyprinus carpio； b：金魚 Carassius auratus； c：斑馬魚 Danio rerio；d：大西洋鮭 Salmo salar；e：日本青鳉 Oryzias latipes；f：大黃魚 Larimichthys crocea；g：小鼠 Mus musculus；h：非洲爪蟾 Xenopus tropicalis；i：歐亞野豬 Sus scrofa；j：雞 Gallus gallus；k：人 Homo sapiens.

2.3 ER基因在生長快慢個體各組織中的表達

1)雌激素受體基因在肌肉中的表達。在1齡到3齡團頭魴肌肉中，ERα和ERβ1在生長快組(FG)中的表達量整體高于生長慢組(SG)(P<0.05)，并且ERα在1齡FG組和SG組團頭魴中的表達量差異比2齡和3齡團頭魴更為明顯(P<0.05)。然而，ERβ2在FG組和SG組團頭魴中的表達量差異與ERα和ERβ1相反(P<0.05)。在3齡雄性團頭魴中，ERβ2在FG組中的表達量顯著高于SG組(P<0.001)(圖5)。

團頭魴ERβ2為部分CDS序列 Megalobrama amblycephala ERβ2 is part of the CDS sequence.圖4 基于氨基酸序列的ER基因的系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of ER genes based on their amino acid sequences

2)雌激素受體基因在性腺中的表達。在1齡和2齡雌性團頭魴中，雌激素受體基因ERα、ERβ1和ERβ2在FG組的表達量顯著高于SG組。在雄性團頭魴中，ERα在1齡FG組的性腺中的表達量高于SG組；在2齡階段，F(xiàn)G組的性腺中的表達量低于SG；在3齡階段，F(xiàn)G組的性腺中的表達量高于SG組。1齡和2齡雄性團頭魴性腺中，ERβ2在FG組的表達量顯著低于SG組，但在3齡雄性性腺中，ERβ2在FG組的表達量顯著高于SG組。

A：ERα，B：ERβ1，C：ERβ2；FG：快速生長組，SG：慢速生長組；FG與SG之間的統(tǒng)計學差異由“ns”(P>0.05)，“*”(P<0.05)，“**”(P<0.01)，“***”(P<0.001)表示。下同。 FG stands for fast-grow group,SG stands for slow-grow group; the significant difference between FG and SG was represented by “ns”(P>0.05)，“*”(P<0.05)，“**”(P<0.01)，“***”(P<0.001),respectively.The same as below.

A：ERα； B：ERβ1； C：ERβ2.圖6 雌激素受體基因在性腺中的表達Fig.6 Expression of estrogen receptor genes in the gonad tissue

3 討 論

同源性在一定程度上反映了物種之間的親緣關系，本研究中團頭魴ER基因與鯉科魚類同源性較高，與其他科魚類次之，與其他脊椎動物同源性較低。說明ER基因同源性高低與物種親緣關系有關，在親緣關系接近的物種中具有較高的同源性，奧利亞羅非魚的同源性比對結果證實了這一推測[11]。本研究中系統(tǒng)進化分析結果表明ERα和ERβ亞型分成2類。ERβ亞型中ERβ1和ERβ2各聚成一類，與張民等[12]對海水青鳉的研究結果一致。

已有研究表明，莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambicus)在性腺切除術后出現(xiàn)生長遲緩的現(xiàn)象，在異位性腺移植后生長恢復[13],表明內源雌激素一定程度上促進了魚體生長，這種促進作用主要通過ER介導，推測ERs表達上調對于性腺已發(fā)育成熟的團頭魴具有一定的促進生長的作用。因此，我們挑選不同年齡階段中生長快(FG)和生長慢(SG)的團頭魴，檢測了雌激素受體基因ERα、ERβ1和ERβ2在肌肉和性腺組織中的表達情況。結果顯示，在性腺發(fā)育早期(1齡團頭魴)，ERα在FG組的性腺和肌肉中的表達量顯著高于SG組(P<0.05)，但是在FG組和SG組的肌肉中，ERα的表達量差異顯著高于在性腺中的表達量差異(P<0.001)。表明在性腺早期發(fā)育過程中，ERα更傾向于在生長方面而不是性腺方面發(fā)揮作用。在性腺發(fā)育成熟時期(2齡團頭魴)，ERα在FG組和SG組中的表達量差異在性腺中更明顯。該結果表明，在性腺中期發(fā)育過程中，ERα更傾向于在性腺發(fā)育方面發(fā)揮作用；并且ERβ1替代了ERα在生長方面的作用。在性腺發(fā)育成熟后(3齡團頭魴)，ERα和ERβ1同時在生長方面發(fā)揮作用，但是ERβ1只在雄性個體中發(fā)揮作用，而ERα在雄性和雌性個體中均發(fā)揮作用。此外，ERβ2與ERα、ERβ1的表達結果相反，在性腺發(fā)育早期和中期，ERβ2在雄性FG組的肌肉和性腺中表達量顯著低于SG組，但是在性腺發(fā)育早期的雌性個體中，ERβ2在FG組的性腺中的表達量顯著高于SG組，與肌肉中的結果相反(P<0.05)。其結果表明ERβ2的作用與ERα和ERβ1相反，在性腺發(fā)育早期和中期，對生長起到抑制作用。因此我們推測，ERα和ERβ1在肌肉組織中的上調可一定程度上促進肌肉生長，而ERβ2的功能可能與ERα、ERβ1存在一定拮抗作用。有研究結果顯示，對小鼠使用ERα的激動劑丙吡唑三醇(propylpyrazole triol)，可促進糖脂代謝通路中重要基因的表達[14]，這表明ERα在生長代謝方面發(fā)揮作用。

綜上，本研究克隆了團頭魴ER基因的CDS序列，該序列與鯉科魚類具有較高的同源性。對ERs在團頭魴3個年齡階段生長快慢個體的肌肉和性腺組織中的表達情況進行分析，結果表明ERs在一定程度上可促進性腺已發(fā)育成熟的魚類生長，對尚未性成熟的魚類則偏向于促進其性腺發(fā)育。同時ERα、ERβ1和ERβ2可能組成一個復雜的調控體系，彼此相互影響，在生長發(fā)育過程中共同調節(jié)機體生長和性腺發(fā)育。