毛穎津, 高貝樂

1. 中國科學院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室, 廣東省海洋藥物重點實驗室, 中國科學院南海海洋研究所, 廣東 廣州,510301;

2. 中國科學院大學, 北京 100049

群體感應是細菌細胞間化學通訊的一個過程,依賴于細胞外信號分子的產生、檢測以及響應(Mukherjee et al, 2019)。細菌群體通過本底表達產生一定量的信號分子并運出細胞外, 隨著細菌細胞密度的增加, 信號分子濃度也會隨之升高, 當周圍環(huán)境中信號分子濃度達到閾值時便會引發(fā)群體感應,在群體水平調控基因表達(圖1)。這個過程可以使群體內大部分成員的行為同步化, 實現(xiàn)個體無法完成的生理功能或行為, 如生物發(fā)光、毒力因子表達、次級代謝產物合成以及生物膜形成等(De Kievit et al, 2000; Barnard et al, 2007; Scholz et al, 2017;Whiteley et al, 2017)。

根據(jù)信號分子的不同, 目前主要劃分為7 種群體感應通路。在革蘭氏陽性細菌中, 成熟的oligopeptides 信號分子可以被細胞膜上的受體蛋白識別, 或通過轉運系統(tǒng)進入細胞內并與細胞內受體蛋白結合, 調控受體蛋白的構象或活性引發(fā)細胞的生理反應(Monnet et al, 2016; Wu et al, 2020)。其余6種信號分子通路均分布于革蘭氏陰性細菌中(表1),分別為在弧菌中首次發(fā)現(xiàn)的AHL、AI-2 和CAI-1 信號分子通路(Eberhard et al, 1981; Chen et al, 2002;Higgins et al, 2007), 在假單胞菌中發(fā)現(xiàn)的PQS 信號分子通路(Pesci et al, 1999), 在腸出血性大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的AI-3 信號分子通路(Sperandio et al, 2003), 以及在黃單胞菌中發(fā)現(xiàn)的DSF 信號分子通路(Barber et al, 1997)。不同信號分子的受體在細胞內的分布不同,其中AI-2、CAI-1 和AI-3 與細胞膜上相應的受體結合而改變受體的活性(Ng et al, 2011; Moreira et al,2016; Wang Yang et al, 2019), AHL 和PQS 被細胞內受體識別(Cao et al, 2001; Miller et al, 2001), 而DSF既可以被細胞膜上受體RpfCG 識別, 也可以與細胞內受體RpfR 結合(Wang Fangfang et al, 2019)。

群體感應通過調控細菌的毒性、產孢、運動、蛋白水解酶的產生、肽類抗生素的合成、生物膜形成以及熒光產生等過程, 提高細菌適應生境的能力(Lee et al, 2013)。此外, 細菌個體還可以通過產生并分泌公共產物從而利于群體發(fā)展(Rainey et al, 2003;West et al, 2006), 或通過合成并分泌毒素來抑制其他種屬細菌的生長(Hibbing et al, 2010; Cornforth et al, 2013)。上述過程均需要細菌個體合成并分泌信號分子, 這對于個體而言是一個耗能的過程, 親緣選擇理論可以解釋細菌細胞存在群體感應這種利他主義行為。具體來說, 只有當個體感知到環(huán)境中有充足的營養(yǎng)物質以及有足夠多的細菌細胞數(shù)量才會引發(fā)群體感應, 通過使更多的微生物細胞聚集過來并利用營養(yǎng)物質生長繁殖, 從而間接地將個體基因傳遞下去(Whiteley et al, 2017)。

群體感應有許多應用價值, 主要體現(xiàn)在開發(fā)群體感應淬滅劑, 用于治療細菌感染以及合成生物學中的基因回路設計。目前應對病原菌的感染, 主要通過抗生素治療, 由于抗生素有很強的選擇壓力, 極易導致耐藥菌的產生, 因此急需挖掘新的抗生素用于治療耐藥菌。但是在過去的50年里很少有新的抗生素被發(fā)現(xiàn),開發(fā)藥物的途徑也非常有限(Hancock, 2014)。許多重要的植物、動物和人類的病原體都是通過群體感應調節(jié)毒力因子的產生(Papenfort et al, 2016), 因此防止病原體產生毒力因子是控制細菌性疾病的一種重要替代策略。近年來一個重要的研究領域就是開發(fā)群體感應干擾劑, 通過抑制毒力因子的產生來阻斷感染(Defoirdt, 2018)。群體感應干擾劑可以是天然產物或化學合成產物, 用來抑制信號分子合成酶、受體或信號轉導蛋白的活性; 也可以是使信號分子失活的酶;或者是用來隔離信號分子并誘導免疫反應的抗體。群體感應干擾的優(yōu)勢在于它不殺死病原體, 不會造成嚴酷的選擇壓力, 從而最大限度地降低耐藥性產生的風險(von Bodman et al, 2008)。在合成生物學領域, 根據(jù)信號分子濃度達到閾值便會引發(fā)群體感應這一特征,可以將群體感應調控元件設計成分子開關, 用于構建高產目的產物的工程菌株。例如最近的一項研究將AHL 信號分子通路與糖酵解途徑結合起來, 當細胞密度達到一定程度時引發(fā)AHL 信號分子參與群體感應調控, 抑制糖酵解的主合成途徑, 從而使能量代謝流往旁路轉移, 提高了肌醇和葡萄糖酸的產量(Gupta et al, 2017; Stephens et al, 2020)。

弧菌屬細菌是人和水產養(yǎng)殖中重要的病原菌,由于耐藥菌株的出現(xiàn), 傳統(tǒng)抗生素治療效果愈發(fā)不顯著?；【@得耐藥基因后可以通過水平基因轉移傳遞到其他細菌中, 而且水環(huán)境是發(fā)生水平基因傳遞的最佳場所, 因而治療難度增大(鄭林 等, 2019)。近年來, 靶向群體感應通路的抗毒力因子藥物研發(fā)被認為是解決細菌耐藥問題的一個潛在方向。雖然在個別弧菌菌株中發(fā)現(xiàn)了AHL、AI-2 和CAI-1 三種信號分子通路, 但目前還沒有針對弧菌屬的群體感應通路分布情況進行統(tǒng)計的相關報道, 因此有必要調查所有已知的革蘭氏陰性菌的6 種群體感應通路在這個屬中分布的情況, 為后續(xù)針對弧菌的群體感應淬滅劑研發(fā)、藥物靶點選擇等提供信息。

1 實驗方法

1.1 46 株全測序弧菌的基因組信息整理

從 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載弧菌屬中已全基因組測序的菌株信息, 同一物種只選擇一個代表菌株進行分析, 最終確定共有46 株弧菌物種的基因組需要進行下載以及后續(xù)分析(表2)。

表2 菌株信息Tab. 2 Strain information

續(xù)表

1.2 生物信息學分析

根據(jù)最初報道AHL、AI-2、CAI-1、PQS、AI-3和DSF 群體感應通路模式菌株中的合成酶以及受體蛋白的一級結構序列信息(表1), 確定上述6 種群體感應通路各自用來做比對(BLAST)搜索的查詢序列(query)(表3)。本文通過BlastP 2.9.0 進行同源蛋白比對分析(Altschul et al, 1997; Sch?ffer et al, 2001),運用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和HHpred(https://toolkit.tuebingen.mpg.de/tools/ hhpred)生物信息數(shù)據(jù)庫進行蛋白二級結構預測(Letunic et al, 2018; Zimmermann et al, 2018), 分析和觀察是否含有相應的合成酶以及受體蛋白。此外, 在模式菌株中編碼合成酶以及受體蛋白的基因在基因組上位置相鄰, 通常是上下游關系, 可以預測兩個基因的功能相關性。因此對含有相應合成酶以及受體蛋白同源序列的菌株, 如果各自的編碼基因在基因組上的位置相鄰, 可認為該菌含有這種群體感應通路;如果合成酶和受體的編碼基因不相鄰, 而且受體的底物識別結構域未鑒定或者不具備序列特異性, 則認為該菌只是存在潛在的編碼基因, 但不能確定相應群體感應通路的存在。

表3 查詢序列蛋白的結構域組成Tab. 3 Domain composition of the query protein

1.3 構建系統(tǒng)進化樹

UBCG 程序包共采用92 個蛋白進行比對、串聯(lián)、構建進化樹, 這92 個蛋白在Na 等(2018)的研究中有列出。UBCG 程序包選擇這92 個蛋白的標準是: 廣泛存在、高度保守且在基因組中是單拷貝的。這些蛋白主要參與DNA 復制、轉錄、翻譯等重要的生化過程, 包括核糖體蛋白、DNA 連接酶、DNA 重組和修復蛋白、RNA 聚合酶等。

基于上述92 個保守蛋白, 用UBCG 程序包獲取并構建本文確定的46 株弧菌的多保守蛋白串聯(lián)序列, 同時以此作為物種進化的分子標記。選擇與弧菌屬親緣關系相近的同一個綱中的另一個屬Thiomicrospira作為外群, 利用MEGA7.0 的Pairwise Distances 計算進化距離, 選擇泊松修正模型(Poisson correction model), 運用最大似然法(Maximum-likelihood) 計算并構建系統(tǒng)進化樹(Kumar et al, 2016)。除了氨基酸序列比對過程中的缺失位置采用全刪除的方式以外, 其余所有分析均采用默認參數(shù)。

2 結果與分析

2.1 構建系統(tǒng)進化樹

基于92 個串聯(lián)保守蛋白序列, 選擇與弧菌屬親緣關系相近的同一個綱中的另一個屬Thiomicrospira作為外群, 對46 株已全基因組測序的弧菌構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。從構建的系統(tǒng)進化樹(圖2)可以看出,所有弧菌的分支長度相似, 進化距離較短。該進化樹展示的不同物種的分支關系為下文的群體感應通路分析提供了一個系統(tǒng)發(fā)育框架, 可以用來推理每個通路的分布特點和進化過程。

2.2 46 株全基因組測序弧菌各群體感應通路的統(tǒng)計情況

2.2.1 AHL 信號分子群體感應通路

合成酶LuxI 將信號分子前體S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)乙酰化, 最終生成?；呓z氨酸內酯(Acylated Homoserine Lactones, AHL)信號分子。受體蛋白LuxR 是轉錄調控因子, 結合AHL 信號分子后調控相關基因表達(Miller et al,2001)。

根據(jù)是否含有LuxI 和LuxR 的同源蛋白以及編碼這兩種蛋白的基因在基因組上的位置是否相鄰來進行比對分析, 發(fā)現(xiàn)共有5 株弧菌含有AHL 群體感應通路(表4)。結合圖2 的系統(tǒng)進化樹, 發(fā)現(xiàn)其中Vibrio cincinnatiensis和Vibrio metschnikovii的親緣關系相近,Vibrio fluvialis和Vibrio furnissii形成一個獨立的分支, 而Vibrio mediterranei與前述4 株弧菌的親緣關系較遠。整體來看, AHL 通路在弧菌中屬零星分布, 可能通過水平基因轉移獲得。將找到的同源蛋白通過在線BLAST 比對, 發(fā)現(xiàn)最相似的同源蛋白中除了來自于上述5 株弧菌外, 其余均來源于Aliivibrio屬的物種, 因此推測這5 株弧菌含有的AHL 信號通路可能來源于Aliivibrio屬, 該屬與弧菌屬的16S rRNA 基因的序列相似性高達94.6%。此外,基于gyrB、rpoA、recA、pyrH和編碼16S rRNA 這5 個基因構建系統(tǒng)進化樹, 發(fā)現(xiàn)Aliivibrio屬與弧菌屬聚類在一起的置信度達85, 表明兩個屬的親緣關系相近(Urbanczyk et al, 2007)。但目前無法確定這兩類菌的進化次序, 本次調查的46 個弧菌屬物種中只有5 個物種有AHL 通路, 而Aliivibrio屬有超過一半的物種含有該通路。根據(jù)它們的分布情況, 推測弧菌屬的AHL 通路很有可能來自水平基因的轉移而非祖先細胞的垂直傳遞。

表4 AHL 信號分子群體感應通路統(tǒng)計Tab. 4 Statistics of quorum sensing pathways directed by AHL signal

本文的比對分析還發(fā)現(xiàn)Vibrio anguillarum只含有LuxI 同源蛋白, 而Vibrio coralliilyticus則只含有LuxR 同源蛋白, 其余均不含兩種同源蛋白。

2.2.2 AI-2 信號分子群體感應通路

合成酶LuxS催化前體SRH(S-ribosylhomocysteine)生成AI-2 信號分子。受體蛋白LuxPQ 結合AI-2 后調控相關基因的表達(Ng et al, 2009; Pereira et al,2013), 或者受體蛋白LsrB/RbsB 轉運AI-2 進入細胞內并引發(fā)群體感應相關基因的表達(Pereira et al,2009; Novak et al, 2010)。

分析發(fā)現(xiàn)46 株弧菌中只有3 株弧菌沒有AI-2群體感應通路, 分別為Vibrio alfacsensis、Vibrio aphrogenes和Vibrio taketomensis, 而其他弧菌均有該通路。結合圖 2 的系統(tǒng)進化樹, 發(fā)現(xiàn)與V.aphrogenes親緣關系相近的物種都含有AI-2 群體感應通路, 且本地BLASTp 比對分析能夠在該基因組找到相應的合成酶LuxS 以及受體蛋白RbsB 的同源蛋白的編碼基因。由于rbsB不在rbs開放閱讀框內,因此推測V. aphrogenes基因組編碼的RbsB 可能是潛在的受體蛋白, 該菌株可能含有AI-2 群體感應通路。另外兩株弧菌沒有相應的受體蛋白, 故推測沒有AI-2 群體感應通路(表5)。

表5 AI-2 信號分子群體感應通路統(tǒng)計Tab. 5 Statistics of quorum sensing pathways directed by AI-2 signal

續(xù)表

圖2 46 株弧菌的系統(tǒng)進化樹線段0.05 代表1/200 進化距離單位; 分支上的數(shù)值為自舉1000 次的結果; 分支上數(shù)值的閾值設置為70, 低于70 不顯示; 左側進化樹上用紅色字體標注表明在Vibrio cholerae 中分別發(fā)現(xiàn)了AI-2 和CAI-1 兩種信號分子通路; 進化樹選擇目前已全基因組測序的3 株Thiomicrospira 作為進化樹的外枝。右側表格中藍色、紅色和綠色方格分別表示目的菌株含有對應的AHL、AI-2 或CAI-1 信號分子通路, 黃色方格代表根據(jù)進化樹上與目的菌株親緣關系相近的其他弧菌含有AI-2 或CAI-1 信號分子通路而推測目的菌株可能也含有相應的信號通路, 但該通路的合成酶和受體編碼基因在基因組上沒有相鄰分布; 白色方格表示不含該種信號通路的菌株Fig. 2 Phylogenetic tree of 46 Vibrio species

2.2.3 CAI-1 信號分子群體感應通路

合成酶 CqsA 催化前體 S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)生成CAI-1 信號分子(Kelly et al, 2009), 受體蛋白CqsS 與CAI-1 結合后調控群體感應的相關基因表達(Wei et al, 2012)。

根據(jù)是否含有CqsA 和CqsS 的同源蛋白以及編碼這兩種蛋白的基因在基因組上位置是否相鄰來進行統(tǒng)計, 發(fā)現(xiàn)有 31 株弧菌同時含有兩種同源蛋白, 且兩種同源蛋白的編碼基因在基因組上位置相鄰。此外, 有11 株弧菌雖然含有相應的同源蛋白, 但是其編碼基因在基因組上位置不相鄰, 說明可能是潛在的受體。比如, 與Vibrio breoganii和Vibrio chagasii親緣關系相近的物種都含有 CAI-1 群體感應通路, 與Vibrio astriarenae和Vibrio natriegens這兩株弧菌親緣關系相近的物種也都含有 CAI-1 信號分子通路,由此推測這 4 株弧菌的 CqsS 同源蛋白雖然與CqsA 同源蛋白在基因組上位置不相鄰, 但是它們有可能組成一個完整的CAI-1 信號轉導通路。因此, 最終本文推測有35 株弧菌存在CAI-1 群體感應通路(表6)。

續(xù)表

2.2.4 PQS、AI-3、DSF 信號分子群體感應通路

合成酶PqsABCDH 催化鄰氨基苯甲酸生成PQS信號分子, 受體蛋白PqsR 結合PQS 后促進毒力因子等相關基因的表達。以模式菌株Pseudomonas aeruginosa的PqsA、PqsB、PqsC、PqsD 作為查詢序列, 對 46 株已全基因組測序的弧菌進行本地BLASTp 比對分析, 結果發(fā)現(xiàn)僅能找到第一步反應的合成酶 PqsA 的同源蛋白, 缺失其他合成酶PqsBCD 的同源蛋白。此外, 受體蛋白PqsR 屬于LysR 家族調控因子, 該蛋白的特征是含有1 個DNA結合結構域和1 個LysR 底物結合結構域, 在基因組中有非常多的拷貝, 故無法通過序列相似性判斷是否能夠結合PQS 分子。而且, 在PqsA 對應同源蛋白的編碼基因的上、下游也沒有發(fā)現(xiàn)LysR 家族蛋白,與模式菌株中pqsABCDR基因成簇存在的現(xiàn)象不符。基于以上發(fā)現(xiàn), 本文推測這46 株弧菌均沒有PQS 信號分子通路。

AI-3 信號分子的合成酶也是LuxS, 兩套雙組分調控系統(tǒng)QseBC 和QseEF 結合AI-3 后共同調控基因組上致病島相關基因的表達。根據(jù)是否含有合成酶LuxS 以及受體蛋白QseBC、QseEF 對應的同源蛋白, 對46 株弧菌進行分析, 發(fā)現(xiàn)基因組雖然都含有編碼LuxS 合成酶的相關基因, 但是不能同時找到編碼兩套完整的雙組分調控系統(tǒng)的相關基因, 導致信號無法傳遞下去, 因此推測這46 株弧菌均沒有AI-3(Autoinducer-3)信號分子通路。

合成酶RpfF 催化β-hydroxyl-acyl-ACP 生成DSF 信號分子, 隨后DSF 與受體蛋白RpfCG 或RpfR 結合并調控相關基因的表達。根據(jù)是否含有RpfF/RpfCG 或者RpfF/RpfR 相應的同源蛋白, 以及編碼基因在基因組上位置是否相鄰, 對46 株弧菌進行分析。由于RpfF 只含有ECH_1 結構域, 與脂肪酸氧化復合物亞基FabH 的結構域組成相似, 因此只有ECH_1 結構域的蛋白無法區(qū)分是RpfF 還是FabH。此外, 所有基因組都沒有找到受體RpfC 和RpfR 的同源蛋白, 因此推測46 株弧菌均沒有DSF信號分子群體感應通路。

3 總結與討論

弧菌是人和水產養(yǎng)殖中重要的病原菌, 面對愈發(fā)嚴峻的耐藥弧菌問題, 急需尋找其他治療病原菌的方法。近年來, 靶向群體感應通路的抗毒力因子藥物研發(fā)被認為是解決弧菌耐藥問題的一個重要策略。本文的分析結果發(fā)現(xiàn), 弧菌屬細菌普遍存在AI-2 和CAI-1 這兩種信號分子通路, 表明開發(fā)針對弧菌的群體感應淬滅劑應以這兩種信號分子介導的通路作為靶點。

此外, 本文研究結果表明僅有部分弧菌含有AHL 信號通路, 而全部弧菌都沒有PQS、AI-3 以及DSF 信號通路。對含有的3 種信號通路進行比較, 發(fā)現(xiàn)AHL、CAI-1 兩種信號分子的前體SAM 以及AI-2信號分子的前體SRH 均為細胞甲基化循環(huán)通路中重要的中間體。由于甲基化循環(huán)途徑在細胞中普遍存在,因此這些信號分子的前體能夠持續(xù)生成, 而且跟細胞的基礎代謝水平相關?；【鷮贈]有的DSF 信號分子的前體來源于脂肪酸合成途徑的中間體。根據(jù)表3顯示, 信號分子的受體蛋白有的是雙組分調控系統(tǒng)的組成部分, 有的含有GGDEF 和EAL 結構域, 參與調控細胞內c-di-GMP 水平。因此, 推測AHL、AI-2、CAI-1 和DSF 這4 種信號分子最初可能僅是細胞代謝的中間產物, 后來進化出專門的受體蛋白識別該類分子, 進而演化為一種信號, 引發(fā)下游的細胞反應,并調控相關基因的表達(Winzer et al, 2002a, b; Taga et al, 2003; Ng et al, 2009; Mitra et al, 2016)。

結合系統(tǒng)進化樹, 本文發(fā)現(xiàn)弧菌群體感應通路的分布與物種進化有關, 含有同種信號分子通路的弧菌間親緣關系相近。比如Vibrio fluvialis和Vibriofurnissii同時含有AHL、AI-2 和CAI-1 這3 種信號分子通路, 在進化樹中兩株弧菌間的進化距離也相近。根據(jù)對弧菌中找到的3 種群體感應通路的進一步分析, 推測 AHL 信號分子通路可能來源于Aliivibrio屬, 它通過水平基因轉移進入部分弧菌基因組中; 而AI-2 和CAI-1 兩種信號分子通路可能進化自弧菌的祖先細胞, 通過垂直傳遞, 大部分弧菌都保留了該通路。

本文在分析過程中主要遇到以下兩個難點: 其一, 對于CAI-1 和DSF 兩種信號分子通路, 由于其合成酶CqsA 和RpfF 分別為氨基轉移酶和?；铣擅? 這兩種酶在細菌細胞中普遍存在多拷貝, 因此分析過程中無法確定那些受體的編碼基因不在基因相鄰位置的弧菌是否存在上述兩種信號分子通路。本研究已整理出這些弧菌信息, 為下一步的實驗驗證提供潛在的靶蛋白。比如, 在模式菌株Vibrio choleraN16961 中存在 3 個大小相近且只含有Aminotran_1_2 結構域的氨基轉移酶, Miller 等人(2002)通過Tn 轉座子文庫篩選確定了模式菌株中的合成酶CqsA; 在模式菌株Xanthomonas campestris中存在5 個大小相似且只含有ECH_1 結構域的?；铣擅? 通過敲除、回補實驗證實rpfF基因是DSF信號分子合成所必需的, 從而確定了模式菌株中的合成酶RpfF(Tang et al, 1991; Barber et al, 1997); 至于其他同源蛋白是否能合成新的信號分子則仍有待實驗驗證。其二, 對于AI-3 信號分子通路, 受體蛋白QseBC 和QseEF 是雙組分調控系統(tǒng), 目前關于受體蛋白與信號分子結合的結構域以及具體的結合位點的研究較少, 且細菌細胞中普遍存在很多拷貝的雙組分調控系統(tǒng)(Groisman, 2016; Rajeev et al, 2020),因此無法確定本地BLASTp 比對分析發(fā)現(xiàn)的雙組分系統(tǒng)是否真實參與細菌細胞群體感應調控過程。針對這些問題, 需要有更多實驗證據(jù)支持, 最終獲得準確的關于弧菌群體感應通路分布情況的統(tǒng)計結果,為后續(xù)針對弧菌而開發(fā)群體感應淬滅劑以及藥物靶點的選擇提供信息。