蘇 夏，張小平，邢志林,陳尚潔，王永瓊，高艷輝,2，趙天濤,2

(1.重慶理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院， 重慶 400054； 2.重慶大學(xué) 環(huán)境與生態(tài)學(xué)院， 重慶 400044)

在“雙碳”背景下，氯代芳烴污染物控制面臨較大壓力，其中氯苯(Chlorobenzene，CB)是化工產(chǎn)品中間體、殺蟲(chóng)劑和有機(jī)溶劑的重要組成成分，是氯代芳香族中應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)品之一，非法排放致使其在環(huán)境中廣泛存在[1-2]。據(jù)估計(jì)，全球每年由廢水排放到環(huán)境中的CB超過(guò)500 000噸，持續(xù)揮發(fā)和沉積循環(huán)使其污染遍布全球，南北兩極積雪中均檢測(cè)出有CB存在[3-4]。CB為一級(jí)致癌物，被《斯德哥爾摩公約》和美國(guó)環(huán)保署列為第7位的優(yōu)先控制污染物，具有高毒性、難降解和易生物蓄積等特性，嚴(yán)重危害生態(tài)環(huán)境和人類健康[5-6]。針對(duì)國(guó)家對(duì)持續(xù)性有機(jī)物處理的高要求[7]，明晰環(huán)境中CB的轉(zhuǎn)化特性，采取有效措施消除污染已成為亟需開(kāi)展的研究。

多年來(lái)，研究者利用多種技術(shù)去除環(huán)境中CB污染，與其他方法相比，微生物處理技術(shù)具有成本低，條件溫和及污染小等優(yōu)勢(shì)，在CB處理中具有重要應(yīng)用潛力。國(guó)內(nèi)外研究者利用多種功能菌株開(kāi)展了CB的降解工作，Oanh等[8]從廢水污泥樣本中分離出一株CB降解菌BacillussubtilisstrainDKT，2 d內(nèi)實(shí)現(xiàn)60 mg/L的CB降解了70%；同時(shí)，Irina等[9]篩選了一株氏乳桿菌PortucalensisstrainF11，相同時(shí)間實(shí)現(xiàn)100 mg/L CB降解率達(dá)85%；此外，Arno Kaschl等[10]從污染含水層中篩選出一株羅爾斯通菌Ralstoniasp，該菌株在21 h對(duì)60 mg/L CB降解率為93.4%。這些研究表明不同類型的菌株活性差異較大，高效氯苯降解菌的分離及應(yīng)用一直是關(guān)注的重點(diǎn)。盡管CB生物降解研究開(kāi)展多年，但絕大多數(shù)科研人員關(guān)注于單一污染條件下的CB轉(zhuǎn)化過(guò)程[11]，然而工業(yè)發(fā)展所導(dǎo)致的環(huán)境污染更具復(fù)雜性，往往存在復(fù)合污染現(xiàn)象。崔健等[12]調(diào)研發(fā)現(xiàn)CB污染水體中還含有TCE、PCE、1,2-DCA等十幾種氯代脂肪烴。在多種因素作用下，有機(jī)物降解過(guò)程復(fù)雜，處理效率及生態(tài)毒性更具復(fù)雜性及不確定性，污染物常規(guī)處理過(guò)程受到極大挑戰(zhàn)，有機(jī)復(fù)合污染生物降解的相互影響逐漸受到關(guān)注。Zhao等[13]研究反-1,2-二氯乙烯(tDCE)[14]、氯乙烯(VC)、1,1-二氯乙烯(1,1-DCE)、TCE、PCE的存在下順-1,2-二氯乙烯(cDCE)的生物降解特性，發(fā)現(xiàn)在無(wú)其他氯乙烯條件下，cDCE的降解速度最快，其他氯代烴可顯著抑制cDCE的降解[15]。還有研究發(fā)現(xiàn)多氯取代烴對(duì)低氯取代烴的還原脫氯有抑制作用，低氯取代烴對(duì)高氯取代烴的還原脫氯抑制作用較弱[16]。瞿福平等[17]對(duì)CB類同系物共存時(shí)CB生物降解性能的影響及作用機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)鄰二氯苯、間二氯苯的存在有利于整個(gè)體系的污染物降解，但CB的耗氧速率降低，對(duì)二氯苯、1,2,4-三氯苯存在會(huì)抑制整個(gè)體系及CB的降解。這些研究充分證明在有CB生物降解過(guò)程中，污染物共存及其影響特性是需要考慮的重要因素。

基于當(dāng)前CB降解功能菌數(shù)量有限且效率低，前期開(kāi)展了功能菌的富集篩選工作，獲得了一株可同化和共代謝降解氯苯的菌株。當(dāng)前關(guān)于復(fù)合污染物問(wèn)題，更多關(guān)注的是同類型污染物間的相互影響，不同類型污染物間的影響研究還是十分有限。環(huán)境污染中，CB與其他氯代烴往往同時(shí)存在，如氯代脂肪烴，作為不同結(jié)構(gòu)的氯代烴，氯代脂肪烴對(duì)CB轉(zhuǎn)化的影響特性如何還未有關(guān)注。基于此，本研究選取典型氯代脂肪烴，利用分離的高效菌株，開(kāi)展復(fù)合污染作用下CB的降解研究。明晰氯代烷烴和氯代烯烴作用下CB的降解特性；考察不同氯代脂肪烴的半數(shù)效應(yīng)濃度；利用經(jīng)典抑制動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，明晰不同氯代脂肪烴的抑制機(jī)理。研究結(jié)果為微生物技術(shù)在環(huán)境氯代有機(jī)物復(fù)合污染治理中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 功能微生物

CB降解菌株分離自某廢棄焦化廠污染土壤，該菌株能以CB為唯一碳源和能源，鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌，命名為SerratiamarcescansTF-1(保藏號(hào)：M2019674，專利號(hào)：ZL201911162719.4)[18]。將純菌TF-1接種到已滅菌的50 mL的LB培養(yǎng)基中富集，作為種子液。

1.2 培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：CaCl2(0.1 g)，MgSO4·7H2O(0.4 g)，NH4Cl(2.02 g)，KH2PO4(3.0 g)，Na2HPO4·12H2O(17.7 g)，NaCl(0.5 g)，蒸餾水1 L，pH值：6.5～7.0。

LB培養(yǎng)基：酵母粉(5.0 g)，蛋白胨(10.0 g)，NaCl(5.0 g)，蒸餾水1 L(培養(yǎng)基所需藥品來(lái)自于成都市科龍化工試劑廠，分析純)。

1.3 氯代脂肪烴對(duì)CB降解的影響實(shí)驗(yàn)

選取復(fù)合污染水體中普遍存在的氯代烴DCM、1,2-DCA、1,1,2-TCA、TCE和PCE為抑制劑開(kāi)展研究，比較氯代脂肪烴中單雙鍵結(jié)構(gòu)及氯原子個(gè)數(shù)對(duì)抑制作用的影響。氯代脂肪烴及CB購(gòu)買自阿法埃莎(天津)化學(xué)有限公司。

在無(wú)菌條件下，將一定量馴化后的TF-1菌懸液以4 000 r/min離心10 min，棄上清液，菌體用磷酸緩沖液洗滌2次。在上述實(shí)驗(yàn)得到的最適溫度、pH值和接種量的基礎(chǔ)上，在含60 mg/L CB的LB選擇性培養(yǎng)基中，分別添加2、4、6和8 mg/L的 DCM、1,2-DCA、1,1,2-TCA、TCE和PCE，分裝于125 mL血清瓶中，在30 ℃、160 r/min的搖床中培養(yǎng)。每間隔24 h，利用紫外分光光度計(jì)，選擇600 nm的波長(zhǎng)，UV-1800比色法測(cè)定不同條件下培養(yǎng)的菌液OD600，利用氣相色譜監(jiān)測(cè)CB濃度，每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)平行組。

1.4 分析檢測(cè)

氯代烴采用氣相色譜檢測(cè)，檢測(cè)條件參見(jiàn)文獻(xiàn)[9]。TF-1濃度采用分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)，數(shù)據(jù)處理及做圖用Excel 2019和origin 2019軟件。

1.5 半有效濃度曲線擬合

使用4參數(shù)邏輯函數(shù)擬合每個(gè)抑制劑的EC50值，它對(duì)應(yīng)于底物/酶結(jié)合的50%的抑制，擬合的方程如下所示：

(1)

式中：A為與無(wú)限濃度相對(duì)應(yīng)的B/B0(%)的最小值；D為對(duì)應(yīng)于零濃度的B/B0(%)的最大值；logC為以中值抑制濃度(EC50)的自然對(duì)數(shù)表示的S型曲線的拐點(diǎn)；B為該點(diǎn)的希爾斜率C；X是抑制劑的濃度。

(2)

式中：A為吸光度；A0為被分析物零劑量時(shí)的吸光度；AXS為被分析物過(guò)量時(shí)的吸光度。

1.6 動(dòng)力學(xué)擬合

TF-1對(duì)CB的降解符合Michaelis-Menten方程：

(3)

式中：rs為CB降解速率，mol/(gcell·h)；rmax為CB最高降解速率，mol/(gcell·h)；CS為CB濃度，mol/L；Km為米氏常數(shù)mol/L。

當(dāng)有抑制劑存在時(shí)，抑制劑的酶抑制分為以下幾種情況：

1) 競(jìng)爭(zhēng)性抑制模型：微生物反應(yīng)過(guò)程中抑制劑I在酶活性位點(diǎn)結(jié)合，阻礙酶與生長(zhǎng)底物結(jié)合，致使酶促反應(yīng)活性下降，特點(diǎn)為抑制劑對(duì)最大消耗速率無(wú)影響。該抑制方程如下：

(4)

式中：rSI為競(jìng)爭(zhēng)性抑制的底物消耗速率，mol/(gcell·h)；KmI為競(jìng)爭(zhēng)抑制時(shí)米氏常數(shù)，mol/L；KI表示競(jìng)爭(zhēng)性抑制時(shí)的解離常數(shù)，mol/L；CI為抑制劑的濃度，mol/L。

2) 非競(jìng)爭(zhēng)性模型：生化反應(yīng)過(guò)程中抑制劑與酶分子在非活性位點(diǎn)結(jié)合，該過(guò)程阻礙底物與酶結(jié)合，特點(diǎn)為方程中米氏常數(shù)不變，非競(jìng)爭(zhēng)性抑制方程如下：

(5)

式中：rI,max為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的底物最大消耗速率。

3) 反競(jìng)爭(zhēng)性模型：生化反應(yīng)過(guò)程中抑制劑不能直接與酶相結(jié)合，只能與酶和底物組成的復(fù)合物相結(jié)合，生成三元復(fù)合物，進(jìn)而抑制底物催化。反競(jìng)爭(zhēng)性抑制方程為：

(6)

以上公式推導(dǎo)參考文獻(xiàn)[19]。

2 結(jié)果與討論

2.1 氯代烷烴存在下CB的降解特性

在溫度為30 ℃、CB濃度為100 mg/L的培養(yǎng)基中，研究典型氯代烷烴DCM、1,2-DCA、1,1,2-TCA為抑制劑時(shí)，TF-1對(duì)CB的降解特性，培養(yǎng)7 d后的CB濃度變化如圖1所示。當(dāng)DCM濃度為2 mg/L時(shí)，CB的降解率能夠達(dá)到61.08%；濃度分別為4、6、8 mg/L時(shí)，CB的降解率達(dá)到37.84%、34.87%、42.07%，隨著DCM濃度的升高，抑制效果也在逐漸增強(qiáng)。當(dāng)1,2-DCA為抑制劑時(shí)，在4個(gè)不同濃度梯度下，降解率均在35%左右，對(duì)TF-1有較強(qiáng)的抑制作用；當(dāng)1,1,2-TCA為抑制劑時(shí)，濃度分別為2、4、6、8 mg/L時(shí)，降解率均在30%左右，對(duì)CB的降解效果最差，說(shuō)明對(duì)TF-1的抑制效果最強(qiáng)。由此表明，有氯代烷烴存在條件下對(duì)TF-1降解CB有較強(qiáng)的抑制作用，并且1,1,2-TCA抑制效果最強(qiáng)。由此推斷，當(dāng)氯代烷烴的結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，抑制效果越明顯。

研究表明[20]，氯代有機(jī)溶劑的毒性與其辛醇水分配系數(shù)(logPo/w)密切相關(guān)，DCM、1,2-DCA和1,1,2-TCA的logPo/w值分別為1.25，1.48和2.17，logPo/w值越高，溶劑的脂溶性越強(qiáng)，高脂溶性對(duì)細(xì)胞膜的破壞性更強(qiáng)，可能是1,1,2-TCA毒性強(qiáng)的主要原因。

圖1 氯代烷烴存在下TF-1對(duì)CB降解曲線

2.2 氯代烯烴存在下CB的降解特性

同樣在溫度為30 ℃、含有100 mg/L CB的培養(yǎng)基中添加氯代烯烴，研究TCE、PCE為抑制劑時(shí)對(duì)TF-1降解CB的影響。培養(yǎng)7 d后CB的濃度變化如圖2所示，當(dāng)以TCE為抑制劑時(shí)，濃度分別為2、4、6、8 mg/L時(shí)，所對(duì)應(yīng)的CB降解率分別為61.08%、37.84%、34.88%、42.07%，平均降解率分別為1.37、0.841、0.751、0.935 mg/(L·d)，隨著濃度逐漸增大，TCE對(duì)TF-1降解CB的抑制效果在不斷增強(qiáng)。當(dāng)PCE為抑制劑時(shí)，濃度分別為2、4 mg/L時(shí)，對(duì)CB的降解率能夠達(dá)到50%左右，濃度分別為6、8mg/L時(shí)，對(duì)CB的降解率能夠達(dá)到35%左右，抑制情況與TCE相似。

TCE和PCE的logPo/w值分別2.4和2.88，相較于氯代烷烴，氯代烯烴對(duì)TF-1降解CB的抑制作用相對(duì)較弱，表明雙鍵作用可減小有機(jī)溶劑毒性。在結(jié)構(gòu)方面，氯代有機(jī)溶劑往往通過(guò)破壞細(xì)胞膜影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和完整性，明晰溶劑作用下細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化也是下一步研究的重點(diǎn)。

圖2 TF-1在氯代烯烴存在下CB的降解特性

2.3 半數(shù)抑制效應(yīng)濃度分析(EC50)

氯代脂肪烴為抑制劑時(shí)對(duì)TF-1的半數(shù)抑制效應(yīng)濃度如圖3所示，通過(guò)EC50我們可以了解到當(dāng)TF-1受到50%抑制時(shí)及一半失活時(shí)，氯代脂肪烴所需濃度。氯代烷烴DCM、1,2-DCA、1,1,2-TCA的EC50值分別為3.42、3.16、3.12 mg/L，當(dāng)DCM濃度達(dá)到3.42 mg/L時(shí)，才能抑制TF-1一半失活，而1,1,2-TCA濃度為3.12 mg/L時(shí)就能夠抑制TF-1一半失活，發(fā)現(xiàn)隨著氯代烷烴的結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度越大，半數(shù)抑制濃度在逐漸減小，說(shuō)明氯代烷烴結(jié)構(gòu)的復(fù)雜化可增強(qiáng)對(duì)TF-1的抑制。

氯代烯烴TCE和PCE的EC50分別為6.57和3.16 mg/L，半數(shù)效應(yīng)抑制濃度相較于氯代烷烴有所增大，說(shuō)明氯代烯烴對(duì)TF-1的生長(zhǎng)抑制有所減弱，但是隨著氯原子數(shù)目的增多，氯代烯烴的抑制作用顯著增強(qiáng)。Joanna等[20]發(fā)現(xiàn)不同菌株對(duì)氯代烴的EC50差異很大，相同條件下不同菌株對(duì)相同氯代烴的EC50可相差幾十倍；實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)厭氧菌的PCE和1,2-DCA的EC50值分別為149.2 mg/L和1217.2 mg/L，表明厭氧菌株對(duì)氯代烴的耐受能力更強(qiáng)。

圖3 DCM、DCA、TCA、TCE、PCE為抑制劑時(shí)對(duì)TF-1的EC50濃度曲線

2.4 多種抑制模型擬合

圖4 3種抑制形式的線性擬合(A：競(jìng)爭(zhēng)性抑制；B：非競(jìng)爭(zhēng)性抑制；C：反競(jìng)爭(zhēng)性抑制)

表1 不同抑制形式的可決系數(shù)

2.5 抑制機(jī)理分析

本研究中，CAHs對(duì)TF-1降解表現(xiàn)為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，抑制機(jī)理如圖5所示。無(wú)抑制劑存在時(shí)，底物可與酶活性位點(diǎn)順利結(jié)合，當(dāng)抑制劑與酶非活性位點(diǎn)結(jié)合后，活性位點(diǎn)受到阻礙作用，無(wú)法進(jìn)一步與底物結(jié)合，這導(dǎo)致底物催化反應(yīng)速率迅速降低[23]。解離常數(shù)是衡量抑制劑抑制酶活的重要參數(shù)，由表2可以看出TCA的解離常數(shù)KI為7.54 mg/L，rI,max的變化范圍分為9.99～16.12，明顯大于無(wú)氯代脂肪烴的KI，說(shuō)明該氯代烷烴在濃度為2～8 mg/L的范圍內(nèi)就會(huì)明顯抑制TF-1降解菌的活性。DCM非競(jìng)爭(zhēng)性抑制時(shí)的rI,max變化范圍為3.87～6.84，解離常數(shù)KI為19.2 mg/L，隨著CAHs濃度的不斷增大，rI,max在逐漸減小，抑制效應(yīng)增大。將TCA的rI,max變化范圍9.99～16.12 mg/L和DCM的rI,max變化范圍3.87～6.84 mg/L進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)TCA的抑制效果明顯強(qiáng)于DCM，且三氯乙烷在較低的濃度時(shí)(2～8 mg/L)對(duì)TF-1就有很強(qiáng)的抑制效應(yīng)，而TCE、PCE(2.23～4.71 mg/L、2.23～6.92 mg/L)只有微弱的影響。隨著氯原子數(shù)增多，解離系數(shù)KI變小，說(shuō)明CAHs飽和程度影響抑制情況。因此，在CB與氯代脂肪烴混合污染中，增大底物濃度無(wú)法消除氯代脂肪烴的抑制，需首先去除污染中的氯代脂肪烴。

圖5 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制機(jī)理

表2 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制擬合結(jié)果

續(xù)表(表2)

3 結(jié)論

1) 在氯代脂肪烴對(duì)CB降解的影響及抑制動(dòng)力學(xué)的研究中，不同氯代脂肪烴為抑制劑時(shí)，對(duì)TF-1降解CB的抑制效果各有不同。當(dāng)氯代烷烴為抑制劑時(shí)，對(duì)TF-1降解CB有較強(qiáng)的抑制作用，其中1,1,2-TCA抑制能力最強(qiáng)；氯代烷烴的EC50值為3.12～3.42 mg/L，其中DCM的半數(shù)抑制效應(yīng)濃度最大，其值為3.42 mg/L；其次是1,2-DCA及TCA，EC50值分別為3.16和3.12 mg/L，氯代烷烴結(jié)構(gòu)復(fù)雜毒性越強(qiáng)。

2) 氯代烯烴的半數(shù)效應(yīng)抑制濃度相較于氯代烷烴有所增大，TCE和PCE的EC50分別為6.57和3.16 mg/L，說(shuō)明氯代烯烴對(duì)TF-1的生長(zhǎng)抑制有所減弱，但是隨著氯原子數(shù)目的增多，氯代烯烴的抑制作用顯著增強(qiáng)；并且當(dāng)PCE為抑制劑時(shí)，對(duì)TF-1的生長(zhǎng)抑制效果與1,1,2-TCA相當(dāng)。

3) 動(dòng)力學(xué)擬合結(jié)果表明：CAHs對(duì)TF-1均表現(xiàn)為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。抑制劑與酶非活性位點(diǎn)結(jié)合，而后阻礙底物與活性位點(diǎn)結(jié)合，污染處理中需首先考慮去除抑制劑。在DCM，1,2-DCA，1,1,2-TCA，TCE和PCE抑制作用下，解離系數(shù)KI分別為19.2，9.96，7.45，13.05和10.58 mg/L，說(shuō)明氯代烷烴結(jié)構(gòu)復(fù)雜毒性越強(qiáng)；隨著氯原子數(shù)目的增多，抑制作用顯著增強(qiáng)。