胡蘿卜DcPS基因的克隆、進化及根發(fā)育中表達分析

趙 倩，王 堃，羅 慶，王天文，孟平紅，譚國飛*

(1.貴州大學 生命科學學院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護與保護種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室，山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所，貴州 貴陽 550006)

0 引言

胡蘿卜(DaucuscarotaL.)為傘形科作物，根是胡蘿卜的主要食用部位，中國的胡蘿卜種植面積和產(chǎn)量均為世界第一[1]。胡蘿卜肉質(zhì)根中，富含胡蘿卜素、維生素、糖及礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)物質(zhì)，已被深入和廣泛的研究。其他物質(zhì)研究研究較少，如補骨素。

補骨素(Psoralen)屬呋喃香豆素中重要的藥物成分之一，具有鎮(zhèn)定、止血等功能，在軟骨再生、強效補骨、強健骨質(zhì)、潤滑關節(jié)、必得軟骨、對抗磨損等方面也具有重要功能，還是治療白癜風、斑禿、牛皮癬和瘤樣等皮膚病的特效藥[2-4]。胡蘿卜作為重要的營養(yǎng)蔬菜，除作為蔬菜食用外，已被增加到嬰幼兒和老人奶粉中，且補充骨質(zhì)成分成為奶粉重要指標之一[5]。因此，研究胡蘿卜補骨素代謝機理和提高胡蘿卜中補骨素的含量，具有積極意義。

補骨素合成開始于苯丙氨酸代謝(形成肉桂酸)，經(jīng)過羧化酶、連接酶、內(nèi)酯化催化形成的傘花內(nèi)脂，進一步由印度枸橘素合成酶催化形成異化前胡素內(nèi)脂，最后由補骨素合成酶催化形成補骨素[2,6-7]。其中，補骨素合成酶(Psoalen synthase,PS)作為補骨素合成中關鍵酶，其基因功能最先是在傘形科阿米芹中被確認[2]，其后在傘形科植物的歐防風[8]、珊瑚菜[9]中被成功克隆，而在胡蘿卜中未見研究報道。本研究對胡蘿卜DcPS基因進行了克隆、序列結(jié)構、進化及在肉質(zhì)根膨大過程中的表達分析，對研究胡蘿卜中補骨素物質(zhì)的合成提供指導。

1 材料與方法

1.1 植物材料及栽培條件

‘黑田五寸’(Kuroda)是貴州省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所傘形科蔬菜課題組多年提純的材料， 2018年8月播種于貴州省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所蔬菜試驗地中。試驗地在耕地時每畝施用2 000 kg的雞糞外，在胡蘿卜生長過程中未使用肥料。分別于胡蘿卜發(fā)芽(約10 d)后10 d、20 d、40 d、60 d、80 d和100 d時，選取植株根部用ddH2O洗凈后，迅速用錫箔紙包好并快速置于液氮中速凍，并保存于-80 ℃超低溫冰箱中，用于提取胡蘿卜總RNA。

1.2 胡蘿卜RNA的提取、鑒定及cDNA的合成

取保存于-80 ℃冰箱中不同發(fā)育時間段的胡蘿卜根，放置于冷卻的研缽(研缽預先用180 ℃烘箱滅菌2～3 h )中，加入液氮進行充分研磨。采用RNA Simple Total RNA Kit(Tiangen，北京)RNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書進行胡蘿卜總RNA的提取，其完整性和濃度，分別使用膠濃度為1.2%瓊脂糖凝膠和微量分光光度計Nanodrop ND-100(Nanodrop Technologies Inc.，DE，USA)進行檢測。胡蘿卜總RNA利用含有去除基因組DNA的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Reagent Kit with a DNA Eraser Kit(Perfect Real-Time)，TaKaRa，大連)將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用滅菌的ddH2O稀釋15倍，保存于-20 ℃冰箱，用于胡蘿卜DcPS基因的克隆及熒光定量PCR分析。

1.3 胡蘿卜DcPS基因的克隆與鑒定

以公布的阿米芹AmPS基因序列(GenBank: AY532370.2)比對南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院熊愛生課題組建立的胡蘿卜數(shù)據(jù)庫(http://apiaceae.njau.edu.cn/)和NCBI胡蘿卜基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=txid79200[Organism:noexp])，發(fā)現(xiàn)2個數(shù)據(jù)庫中對應的DcPS基因存在差異。其中，南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院胡蘿卜數(shù)據(jù)庫中該基因(基因編號：Dck09486.1)開放閱讀框長度(ORF)1 518 bp，而NCBI中該基因(GenBank: XM_017393936.1)ORF長度為1 545 bp，但2個數(shù)據(jù)庫5′一致，3′存在差異。為此，以NCBI公布的DcPS基因設計5′正向引物，以經(jīng)過克隆和驗證的阿米芹AmPS基因序列設計3′反向引物，其正向為：5′-ATGGCAATGAAAATGGTGGAGCAA-3′；反向為：5′-TCAAACATGTGGTCTGGCAACCACC-3′ 。

PCR采用南京諾唯贊生物科技有限公司生產(chǎn)的高保真PCR聚合酶Taq Plus Master Mix Ⅱ，對DcPS基因進行克隆?？寺〕绦驗椋?4 ℃預變性5 min；然后按照94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，32個循環(huán)后，于72 ℃延伸10 min；最后12 ℃保存。克隆產(chǎn)物經(jīng)過1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后，在紫外燈下用干凈的手術刀快速切下目的條帶，使用Axygen膠回收試劑盒(愛思進生物技術(杭州)有限公司)并按照說明書，回收基因目的片段。將目的片段連接到pMD19-T(TaKaRa，大連)載體上。連接好的載體利用42 ℃熱激的方法，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，涂布于含有濃度100 mg·L-1的氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基中，黑暗條件下37 ℃倒置培養(yǎng)12～14 h。挑取單菌落在含有濃度100 mg·L-1的氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，于搖床180 rpm下培養(yǎng)6 h后，采用PCR方法對菌液進行檢測，對檢測正確的菌液，送到南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.4 胡蘿卜DcPS進化分析

將克隆得到的胡蘿卜DcPS基因，查找可翻譯的閱讀框，并推導成對應的氨基酸序列。獲得的胡蘿卜DcPS氨基酸序列與其它傘形科植物構建進化樹，其中歐芹、水芹、旱芹和鴨兒芹分別從課題組建立的傘形科蔬菜數(shù)據(jù)庫中搜索獲得。使用MEGA5軟件的最大似然(Minimum likelihood，ML)法構建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap檢驗值設為1 000[10]。

表1 各傘形科物種SP 蛋白信息Tab.1 The information of SP proteins from different apiaceae species

1.5 序列分析

采用DNAMAN軟件對獲得的DcPS基因及其蛋白序列進行多重比對，利用該軟件進行氨基酸酸堿統(tǒng)計和疏水/親水性鑒定。利用SMART在線網(wǎng)站(http://smart.embl.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)進行氨基酸序列結(jié)構域分析[11]。

1.6 熒光定量PCR分析

根據(jù)胡蘿卜DcPS基因克隆測序結(jié)果，結(jié)合胡蘿卜基因組(GenBank: LNRQ00000000.1)和其對應的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設計一對長度為179 bp特異的熒光定量引物(正向：5′- GTGTTCTTAGAGATCATCCAAGTAC-3′，反向：5′- GGTTGAAGATGTTGTATCAGTTCC -3′)。采用南京諾唯贊生物科技有限公司生產(chǎn)的AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒，按照說明書進行熒光定量PCR分析。體系為20 μL，其中熒光酶：10 μL，正向/反向引物：各0.4 μL，模板：2 μL，滅菌的ddH2O：7.2 μL。以胡蘿卜ACTIN為內(nèi)參基因[12]，正向為：5′- CGGTATTGTGTTGGACTCTGGTGAT-3′；反向為：5′-CAGCAAGGTCAAGACGGAGTATGG-3′，與目的基因一起擴增。熒光定量PCR程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，65 ℃延伸10 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。相對定量，使用參照基因ΔCT法[13]，表達差異等于2-ΔCT，ΔCT= CT目標基因-CT actin。相對定量是基于處理和對照之間，目標基因?qū)⒖蓟虻谋磉_量的比較。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2007進行定量數(shù)據(jù)和物質(zhì)含量顯著性分析，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡蘿卜DcPS基因的克隆

克隆測序結(jié)果表明胡蘿卜DcPS基因長度為1 518 bp，能夠編碼505 個氨基酸，屬于細胞色素P450超級家族。其序列與胡蘿卜基因組公布的序列(GenBank:XM_017393936.1)5′基本一致，但3′多27 bp(圖1)，而與熊愛生教授課題組公布長度一致。其原因可能二者屬于不同胡蘿卜類型所致，其中基因組測序的胡蘿卜為南特類型胡蘿卜，而本研究所用的材料‘黑田五寸’為黑田類型胡蘿卜。另外，從克隆得到的DcPS基因(GenBank: AY532370.2)與阿米芹PS基因基本一致(見圖1)，兩者序列一致性達80.4%。

2.2 胡蘿卜DcPS基因編碼的氨基酸序列分析

分析表明克隆得到的胡蘿卜DcPS基因編碼的氨基酸，其蛋白分子質(zhì)量為57.10 kDa，等電點9.51，其親水性強于疏水性，應屬于親水性蛋白(圖2)。利用SMART在線網(wǎng)站對獲得的胡蘿卜DcPS氨基酸與經(jīng)過驗證的阿米芹PS氨基酸序列(GenBank:Q6QNI4.1)進行結(jié)構域預測，結(jié)構表明均含有1個跨膜區(qū)，所在的位置分別為：9～31和12～29。另外胡蘿卜DcPS氨基酸序列還存在9個明顯的結(jié)構特征(表2)。

圖2 胡蘿卜DcPS氨基酸序列親水、疏水性預測Fig.2 Predicted hydrophilic and hydrophobic properties of carrot DcPS protein

2.3 胡蘿卜DcPS進化分析

采用最大似然(Minimum likelihood，ML)方法構建胡蘿卜DcPS進化樹。結(jié)果表明胡蘿卜與毒胡蘿卜最接近，處在一個分枝上，阿米芹和珊瑚菜的2個PS均各處于各自分枝上。另外，中國起源的物種鴨兒芹和水芹，處在同一分枝中，而與非中國起源中心的物種，如歐防風、歐芹和旱芹等進化上具有一定的距離(圖3)。暗示著可能起源同一中心的物種PS蛋白進化上較接近。

注：—：表示從各轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中找到，但未在NCBI 上公布。圖3 不同傘形科物種PS氨基酸的進化分析(Bootstrap：1000)Fig.3 The evolution analysis of PS amino acid sequences among different apiaceae species (Bootstrap：1000)

2.4 胡蘿卜DcPS基因在肉質(zhì)根發(fā)育過程中表達

分別取胡蘿卜根膨大過程中的10 d、20 d、40 d、60 d、80 d和100 d樣，利用熒光定量PCR檢查其表達量。結(jié)果表明，胡蘿卜補骨素合成酶基因DcPS，主要是在胡蘿卜根膨大過程60 d及其以后，其中80 d達到最高，其后降低。60～80 d 是胡蘿卜快速膨大時期，暗示著胡蘿卜補骨素合成主要階段與胡蘿卜生長膨大階段相關。另外，‘黑田五寸’胡蘿卜商品期是在播種后90～110 d，即本研究的發(fā)芽后80～100 d，暗示著該階段食用可能有更多的補骨素物質(zhì)積累(圖4)。

注：圖中不同小寫字母表示在芹菜發(fā)育過程無顯著性(P<0.05)。圖4 不同生長階段胡蘿卜根DcPS基因表達Fig.4 Expression levels of DcPS gene in carrot roots during different growth stages

3 討論

胡蘿卜按照來源，目前主要有以下幾種類型：阿姆斯特丹(Amsterdam forein)、博力克姆類型(Berlicum)、南特類型(Nantes)、皇帝類型(Imperator)、黑田類型(Kuroda)、丹佛斯類型(Danvers)、弗拉克類型(Flakkee)、尚特奈類型(Changtenay)和牛心類型(Oxheart)[14]。其中黑田和南特類型為栽培面積最大的胡蘿卜類型，而NCBI基因組數(shù)據(jù)庫中測序的胡蘿卜類型屬于南特類型[15]，南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院熊愛生教授選用的胡蘿卜測序材料屬于黑田類型[16]，可能2種類型胡蘿卜在基因數(shù)據(jù)中存在一些差異，如本研究中的DcPS基因。其余類型的胡蘿卜，目前還未有或者未公布基因組數(shù)據(jù)，導致在分析胡蘿卜分子進化時存在一定的不足。如本研究的胡蘿卜DcPS基因來源以‘黑田五寸’cDNA為模板，克隆得到的序列長度與熊愛生教授公布的基因組一致。

近年來，補骨素物質(zhì)成為老人強效補骨、強健骨質(zhì)等增加骨質(zhì)的保健藥品之一，也是嬰幼兒補骨藥物之一。通過食用蔬菜獲得更多的補骨素成分，減少對保健藥品的食用，是目前開發(fā)蔬菜糧食作物的目標之一。若在胡蘿卜肉質(zhì)根中合成大量補骨素成分，必然能夠增加老人和嬰幼兒對骨質(zhì)的要求。補骨素合成酶作為補骨素合成關鍵酶，在傘形科植物中該基因克隆長度在1 500 bp左右。該酶在珊瑚菜中分析表明了含有1個跨膜區(qū)[9]，且為親水性蛋白，與對胡蘿卜DcPS研究結(jié)果一致，表明該酶能夠催化補骨素物質(zhì)的生成。

利用現(xiàn)代分子生物信息能夠初步了解胡蘿卜體內(nèi)是否能夠合成具體的物質(zhì)，即初步了解該物種是否含有物質(zhì)合成的代謝途徑。本研究初步對胡蘿卜補骨素合成酶基因進行了克隆，其與同屬于傘形科的藥用植物阿米芹物種的該基因，具有很高的相似性，暗示著胡蘿卜可能具有合成補骨素物質(zhì)能力。下一步需利用生物數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，將胡蘿卜體內(nèi)合成補骨素物質(zhì)的完整代謝途徑基因進行分析和驗證，并利用高效液相色譜和核磁共振等設備驗證胡蘿卜中是否含有補骨素成分，為培育具有保健價值的胡蘿卜新材料、新品種服務。