戴瑞卿 賴(lài)寶春 吳振強(qiáng) 曾天寶 王家瑞

摘要 [目的]分析健康與患根腐病草莓根際土壤、非根際土壤及根內(nèi)古菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性。[方法]運(yùn)用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，分別對(duì)根際土壤、非根際土壤及根內(nèi)古菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，分析健康與患根腐病草莓不同部位古細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性。[結(jié)果]健康組共鑒定出11個(gè)門(mén)、19個(gè)綱、25個(gè)目、29個(gè)科、43個(gè)屬，患根腐病組共鑒定出11個(gè)門(mén)、20個(gè)綱、27個(gè)目、32個(gè)科、47個(gè)屬。門(mén)水平上，所有土壤樣品的優(yōu)勢(shì)古菌門(mén)均為奇古菌門(mén)（Thaumarchaeota）、廣古菌門(mén)（Euryarchaeota）和烏斯古菌門(mén)（Woesearchaeota），所有根內(nèi)樣品優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為奇古菌門(mén)和廣古菌門(mén);患根腐病草莓根際和非根際土壤的奇古菌門(mén)相對(duì)豐度均低于健康草莓，廣古菌門(mén)和烏斯古菌門(mén)相對(duì)豐度均高于健康草莓，患根腐病草莓根內(nèi)樣品的奇古菌門(mén)和廣古菌門(mén)相對(duì)豐度均低于健康草莓。屬水平上，所有土壤樣品的優(yōu)勢(shì)屬均為亞硝化球菌屬（Nitrososphaera）、亞硝化侏儒菌屬（Nitrosopumilus）和Methanomassiliicoccus屬，患根腐病草莓根際土壤亞硝化球菌屬相對(duì)豐度比健康減少9.27百分點(diǎn)，非根際土壤亞硝化球菌屬相對(duì)豐度比健康減少9.87百分點(diǎn);所有根內(nèi)樣品的優(yōu)勢(shì)屬均為亞硝化球菌屬和甲烷孢菌屬（Methanocella），亞硝化球菌屬相對(duì)豐度比健康增加15.13百分點(diǎn)。[結(jié)論]健康與患根腐病草莓根際土壤、非根際土壤及根內(nèi)樣品古菌群落組成差異明顯，說(shuō)明草莓根腐病的發(fā)生與根際土壤、非根際土壤以及根內(nèi)古菌群落結(jié)構(gòu)改變密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞 草莓;根腐病;古菌群落結(jié)構(gòu);多樣性;高通量測(cè)序

中圖分類(lèi)號(hào) S 436.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2022）02-0147-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.02.039

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Archaea Community Diversity in Rhizosphere， Non-rhizosphere and Root Tissue of Healthy and Root Rot Strawberry Plants

DAI Rui-qing， LAI Bao-chun， WU Zhen-qiang et al

（Zhangzhou Institute of Agricultural Sciences of Fujian Province， Zhangzhou， Fujian 363005）

Abstract [Objective]To analyze the archaea community structure and diversity of healthy and root rot strawberry in rhizosphere soil， non-rhizosphere soil and root tissue.[Method]The V3-V4 region of the archaea 16S rRNA gene in rhizosphere soil， non-rhizosphere soil and root tissue was amplified， and the amplified fragments were sequenced by Illumina MiSeq high-throughput sequencing technology. [Result] Healthy and root rot strawberry group samples got 11 phyla， 19 classes， 25 orders， 29 families， 43 genera and 11 phyla， 20 classes， 27 orders， 32 families， 47 genera， respectively.Thaumarchaeota， Euryarchaeota and Woesearchaeota were the dominant phyla in all soil sample，Thaumarchaeota andEuryarchaeota were the dominant phyla in allroot tissue. Compared with healthy strawberry plants， the relative abundance of Thaumarchaeota inrhizosphere and non-rhizosphere soil of root rot strawberry plant was generally lower， Euryarchaeota and Woesearchaeota was generally greater.The relative abundance of Thaumarchaeota and Euryarchaeotain root tissue of root rot strawberry plant was generally lower than healthy plants. The dominant genera in all soil samples were Nitrososphaera，Nitrosopumilus and Methanomassiliicoccus.Nitrososphaera and Methanocella were the dominant genera in all root tissue samples.Compared with healthy strawberry plants， the relative abundance of Nitrososphaera in rhizosphere and non-rhizosphere soil was 9.27 and 9.87 percentage point lower， respectively，which in root tissue was 15.13 percentage point higher.[Conclusion] There were significant differences in archaea community composition of rhizosphere soil， non-rhizosphere soil and root tissue from healthy and rootrot strawberry. Occurrence of strawberry rootrot was closed to thevariation ofarchaea community structure in field soil and root tissue.

Key words Strawberry;Root rot;Archaea community;Diversity;High-throughput sequencing

基金項(xiàng)目 福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2019N0201）。

作者簡(jiǎn)介 戴瑞卿（1990—），女，福建漳浦人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，從事植物病害綜合防控研究。*通信作者，副研究員，碩士，從事植物病害綜合防控研究。

收稿日期 2021-05-19

草莓具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，素有“水果皇后”之稱(chēng)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1994—2016年，我國(guó)草莓種植面積和產(chǎn)量逐年增加，規(guī)模逐漸擴(kuò)大，產(chǎn)量穩(wěn)居世界首位[2]。隨著產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，草莓根部病害逐年加重，由土傳病原真菌引起的根腐病是最重要的草莓根部病害之一[3]。根腐病類(lèi)型多樣、病原菌復(fù)雜，目前報(bào)道的草莓根腐病病原物已有20多種，如絲核菌屬（Rhizoctonia）、鐮刀菌屬（Fusarium）、擬盤(pán)多毛孢屬（Pestalotiopsis）、疫霉屬（Phytophthora）等，是一種較難防治的土傳病害，嚴(yán)重制約草莓產(chǎn)業(yè)的正常發(fā)展[4-7]。

土壤作為微生物群落的“種子庫(kù)”，是植物內(nèi)生菌的最初來(lái)源;土壤微生物作為生命元素循環(huán)的驅(qū)動(dòng)者，主導(dǎo)和參與地下生態(tài)系統(tǒng)中一系列重要生態(tài)過(guò)程，對(duì)土壤能否正常有序地執(zhí)行各項(xiàng)生態(tài)功能至關(guān)重要;根際作為植物-土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)交換的一個(gè)界面，是根系-土壤-微生物三者緊密結(jié)合并相互交流的場(chǎng)所;植物組織作為特化性更強(qiáng)的環(huán)境，與其共存的微生物群落、植物生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)[8-10]。土壤和植物內(nèi)生微生物的多樣性能夠影響植物病害的發(fā)生，微生物既可以通過(guò)養(yǎng)分競(jìng)爭(zhēng)和拮抗作用等抑制病原菌的繁殖，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，也可以通過(guò)病原菌的積累導(dǎo)致植株死亡[5]。因此，分析健康與患根腐病草莓根際土壤、非根際土壤及根內(nèi)組織古菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化，對(duì)了解草莓根腐病發(fā)生的原因及提供相應(yīng)的防治措施具有重要意義。高通量測(cè)序技術(shù)可以準(zhǔn)確、全面地反映樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)，該項(xiàng)技術(shù)已被廣泛運(yùn)用于土壤和植物內(nèi)生微生物的研究[10]。筆者通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析健康與患根腐病草莓根際土壤、非根際土壤及根內(nèi)組織古菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，了解草莓根腐病發(fā)生與古菌群落結(jié)構(gòu)改變的關(guān)系，為探究草莓根腐病的發(fā)生機(jī)制、有效防控草莓根腐病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年3月，于福建省漳州市顏厝鎮(zhèn)草莓種植基地（116°41′03″E，39°91′01″N），選取草莓根腐病暴發(fā)嚴(yán)重的草莓種植地進(jìn)行樣品采集。樣品采集方法參照向立剛等[11]進(jìn)行，患根腐病草莓植株根際土壤組樣品編號(hào)為DJTa、DJTb、DJTc，患根腐病草莓植株非根際土壤組樣品編號(hào)為DQTa、DQTb、DQTc，患根腐病草莓根內(nèi)組樣品編號(hào)為DGa、DGb、DGc;健康草莓根際土壤組樣品編號(hào)為HJTa、HJTb、HJTc;健康草莓非根際土壤組樣品編號(hào)為HQTa、HQTb、HQTc;健康草莓根內(nèi)組樣品編號(hào)為HGa、HGb、HGc。所有樣品置入低溫保藏箱，并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃冰箱保存、備用。

1.2 樣品DNA提取、PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序

稱(chēng)取500 mg充分混勻的土壤樣品，采用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit（OMEGA）提取土壤樣品DNA。采用DNeasy Plant miniKit（Qiagen）提取根內(nèi)樣品DNA。利用Qubit 3.0熒光定量?jī)x對(duì)DNA濃度精確定量。以樣品DNA為模板，進(jìn)行3輪PCR擴(kuò)增，第一輪PCR引物為GU1ST-340F（5′-CCCTAYGGGGYGCASCAG-3′）和GU1ST-1000R（5′-GGCCATGCACYWCYTCTC-3′），PCR擴(kuò)增體系為30 μL（15 μL 2×Hieff Robust PCR Master Mix，10 μmol/L的Primer F和Primer R各1 μL，10～20 ng DNA）;第二輪PCR引物為V3～V4區(qū)通用引物349F（5′-GYGCASCAGKCGMGAAW-3′）和806R（5′-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3′），PCR擴(kuò)增體系為30 μL（15 μL 2×Hieff Robust PCR Master Mix，10 μmol/L的Bar-PCR Primer 341F和Primer R各1 μL，10～20 ng DNA）;第三輪PCR擴(kuò)增引入Illumina橋式PCR兼容引物，PCR擴(kuò)增體系為30 μL（15 μL 2×Hieff Robust PCR Master Mix，10 μmol/L的Primer F和Index-PCR Primer R各1 μL，10～20 ng DNA）。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min;5個(gè)循環(huán)（94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s），20個(gè)循環(huán)（94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸5 min，10 ℃保存。PCR 產(chǎn)物采用瓊脂糖試劑盒回收，用Qubit 3.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的DNA精確定量，按1∶1 等量混合后，采用Illumina公司的Hiseq 2500 平臺(tái)測(cè)序進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)處理與分析

利用Cutadapt、PEAR（version 0.9.8）、PRINSEQ（version 0.20.4）等軟件對(duì)Illumina Miseq測(cè)序獲得的序列進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，得到各樣本的高質(zhì)量序列。利用Usearch軟件（version 11.0.667），按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行OTU聚類(lèi)。采用RDP classifier貝葉斯算法（version 2.12）對(duì)97%相似度水平的OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣品的菌落組成，繪制不同分類(lèi)水平上古菌類(lèi)群的相對(duì)豐度圖。利用Mothur（version 1.43.0）軟件計(jì)算各樣本的Chao、Ace、Shannon、Simpson、Shannoneven 指數(shù)，分析樣本古菌的Alpha 多樣性。利用R軟件繪制不同分類(lèi)的相對(duì)豐度熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)和OTU聚類(lèi)分析

患根腐病組草莓不同部位的9個(gè)樣品共獲得627 774條高質(zhì)量序列片段，健康草莓組不同部位的9個(gè)樣品共獲得609 133條高質(zhì)量序列片段。在97%相似度水平對(duì)樣品序列進(jìn)行OTU聚類(lèi)，健康草莓組3個(gè)不同部位樣品共鑒定出古菌11個(gè)門(mén)、19個(gè)綱、25個(gè)目、29個(gè)科、43個(gè)屬、251個(gè)OTU;患根腐病草莓組3個(gè)不同部位樣品共鑒定出古菌11個(gè)門(mén)、20個(gè)綱、27個(gè)目、32個(gè)科、47個(gè)屬、231個(gè)OTU（表1）。Venn圖分析結(jié)果表明（圖1），OTU水平上，健康組與患根腐病組草莓根際土壤、非根際土壤、根內(nèi)樣品之間的古菌種類(lèi)都較為接近，其共有的OTU種類(lèi)均遠(yuǎn)高于2組樣品獨(dú)有的種類(lèi)。

稀釋曲線（rarefaction curve）分析（圖2）表明，健康與患根腐病草莓根際土壤、非根際土壤及根內(nèi)樣品的稀釋曲線隨著測(cè)序量的增大，物種數(shù)量趨于平緩，達(dá)到飽和，且2組草莓各部位樣品覆蓋率指數(shù)（coverage index）均在0.990 0以上，說(shuō)明該次測(cè)序結(jié)果能夠代表樣本的真實(shí)情況，測(cè)序結(jié)果合理。對(duì)健康與患根腐病草莓根際土壤、非根際土壤和根內(nèi)樣品ɑ多樣性分析（表2），結(jié)果表明，患根腐病草莓根際土壤古菌群落豐富度、多樣性和均勻度均低于健康草莓;患根腐病草莓非根際土壤古菌群落豐富度和多樣性低于健康草莓，均勻度高于健康草莓;患根腐病草莓根內(nèi)樣品古菌群落豐富度、多樣性和均勻度均高于健康草莓。

2.2 古菌群落組成分析

門(mén)水平上，健康與患根腐病草莓根際和非根際土壤的優(yōu)勢(shì)門(mén)均為奇古菌門(mén)（Thaumarchaeota）、廣古菌門(mén)（Euryarchaeota）和烏斯古菌門(mén)（Woesearchaeota），健康與患根腐病草莓根內(nèi)樣品的優(yōu)勢(shì)門(mén)均為奇古菌門(mén)和廣古菌門(mén)?；几〔葺H土壤奇古菌門(mén)相對(duì)豐度69.25%，較健康草莓減少11.44百分點(diǎn)，廣古菌門(mén)相對(duì)豐度3.44%，較健康草莓增加0.14百分點(diǎn)，烏斯古菌門(mén)相對(duì)豐度2.89%，較健康草莓增加0.39百分點(diǎn);患根腐病草莓非根際土壤奇古菌門(mén)相對(duì)豐度73.31%，較健康草莓減少6.88百分點(diǎn)，廣古菌門(mén)相對(duì)豐度4.49%，較健康草莓增加1.09百分點(diǎn)，烏斯古菌門(mén)相對(duì)豐度4.03%，較健康草莓增加2.79百分點(diǎn);患根腐病草莓根內(nèi)樣品奇古菌門(mén)相對(duì)豐度93.32%，較健康草莓減少2.36百分點(diǎn)，廣古菌門(mén)相對(duì)豐度2.49%，較健康草莓減少0.76百分點(diǎn)（圖3）。

屬水平上，健康與患根腐病草莓根際土壤的優(yōu)勢(shì)屬均為亞硝化球菌屬（Nitrososphaera）（74.86%、65.59%）、亞硝化侏儒菌屬（Nitrosopumilus）（1.26%、2.54%）和Methanomassiliicoccus屬（1.35%、1.52%）;健康與患根腐病草莓非根際土壤的優(yōu)勢(shì)屬均為亞硝化球菌屬（69.06%、59.19%）、亞硝化侏儒菌屬（1.58%、7.24%）、Methanomassiliicoccus屬（1.39%、1.36%）和甲烷孢菌屬（Methanocella）（1.02%、0.74%）;健康與患根腐病草莓根內(nèi)樣品的優(yōu)勢(shì)屬均為亞硝化球菌屬（78.19%、93.32%）和甲烷孢菌屬（1.54%、2.37%）（圖4）。

2.3 群落聚類(lèi)分析

通過(guò)聚類(lèi)，可以將高豐度和低豐度的分類(lèi)單元區(qū)分，并以顏色梯度反映樣品之間的群落組成相似度。繪制各樣品前10個(gè)屬的相對(duì)豐度熱圖（圖5）。土壤和根內(nèi)樣品的古菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，根據(jù)進(jìn)化關(guān)系聚類(lèi)為四大支，其中健康與患根腐病草莓根際和非根際土壤HJTc、HQTc、DJTa、DJTb、DQTa、DQTc聚為一支，而HJTb、HQTa、HQTb、DJTc、DQTb聚為一大支;根內(nèi)樣品DGa、DGb、DGc和HGa聚為一支，健康根內(nèi)樣品HGb和HGc聚為一支。土壤和根內(nèi)樣品分別被聚為兩大支，說(shuō)明根際和非根際土壤與根內(nèi)古菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。

3 結(jié)論與討論

該研究采用Illumina Hiseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)健康與患根腐病草莓根際土壤、非根際土壤及根內(nèi)樣品古菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果健康組和患根腐病組分別獲得609 133、627 774條高質(zhì)量序列。該研究用于后續(xù)分析的有效序列眾多，稀釋曲線隨著測(cè)序量的增大，物種數(shù)量趨于平緩，達(dá)到飽和，說(shuō)明使用該方法分析健康與患根腐病草莓土壤及根內(nèi)樣品古菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性具有可行性。

土壤微生物區(qū)系與植物根系的生長(zhǎng)和代謝密切相關(guān)，對(duì)植物營(yíng)養(yǎng)元素的供給和植物健康的維持發(fā)揮著重要作用[5，12]。該研究對(duì)健康與患根腐病草莓根際土壤、非根際土壤和根內(nèi)樣品古菌多樣性分析表明，患根腐病草莓根際和非根際土壤古菌群落豐富度、多樣性均低于健康草莓，患根腐病草莓根內(nèi)樣品古菌群落豐富度和多樣性高于健康草莓，與楊俊譽(yù)等[2]對(duì)草莓白粉病的研究結(jié)果一致，表明草莓根腐病的發(fā)生與根際土壤、非根際土壤及根內(nèi)古菌群落結(jié)構(gòu)組成的變化密切相關(guān)。

奇古菌門(mén)、廣古菌門(mén)和烏斯古菌門(mén)為健康與患根腐病草莓根際和非根際土壤的優(yōu)勢(shì)門(mén)，而健康與患根腐病草莓根內(nèi)樣品的優(yōu)勢(shì)門(mén)為奇古菌門(mén)和廣古菌門(mén)，其中奇古菌門(mén)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，不同組別的相對(duì)豐度在69.25%～95.68%，與前人研究結(jié)果一致[2，13]。該研究中健康與患根腐病草莓根際和非根際土壤的優(yōu)勢(shì)屬為亞硝化球菌屬、亞硝化侏儒菌屬和Methanomassiliicoccus屬，健康與患根腐病草莓根內(nèi)樣品的優(yōu)勢(shì)屬為亞硝化球菌屬和甲烷孢菌屬，其中亞硝化球菌屬在所有樣品中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，不同組別的相對(duì)豐度在59.19%～93.32%?；几〔葺H土壤亞硝化球菌屬相對(duì)豐度比健康減少9.27百分點(diǎn)，亞硝化侏儒菌屬相對(duì)豐度比健康增加1.28百分點(diǎn);非根際土壤亞硝化球菌屬相對(duì)豐度比健康減少9.87百分點(diǎn)，亞硝化侏儒菌屬相對(duì)豐度比健康增加5.66百分點(diǎn);根內(nèi)樣品亞硝化球菌屬相對(duì)豐度比健康增加15.13百分點(diǎn)。研究表明，亞硝化球菌屬與酸性土壤的氨氧化作用密切相關(guān)，是酸性土壤硝化作用的重要驅(qū)動(dòng)者，主要通過(guò)增加個(gè)別微生物物種的豐度調(diào)控土壤酸化程度[14-16]?；几〔葺H和非根際土壤亞硝化球菌屬相對(duì)豐度明顯減少，可能是草莓發(fā)生根腐病的原因，而患根腐病草莓根內(nèi)樣品亞硝化球菌屬相對(duì)豐度明顯增加，可能是因?yàn)楦【那秩酒茐牟葺到M織，降低草莓自身防御能力，導(dǎo)致根際和非根際土壤中的亞硝化球菌屬向地表的根內(nèi)遷移[17]。亞硝化侏儒菌屬可以將氨氧化成亞硝酸鹽，通過(guò)氨氧化、亞硝酸鹽氧化和反硝化作用，完成氮的循環(huán)，在全球氮循環(huán)中具有重要作用[18-19]。亞硝化球菌屬和亞硝化侏儒菌屬均為氨氧化古菌[20]，患根腐病草莓根際和非根際土壤中的亞硝化球菌屬相對(duì)增加，而亞硝化侏儒菌屬相對(duì)豐度減少，說(shuō)明亞硝化球菌屬和亞硝化侏儒菌屬可能存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，但相關(guān)理論還需進(jìn)一步研究。

該研究結(jié)果表明，草莓根腐病的發(fā)生與根際土壤、非根際土壤和根內(nèi)古菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的改變密切相關(guān)，尤其是亞硝化球菌屬和亞硝化侏儒菌屬相對(duì)豐度的改變對(duì)草莓根腐病的發(fā)生有重要的影響，為探究草莓根腐病的發(fā)生機(jī)制、有效防控草莓根腐病提供科學(xué)的指導(dǎo)作用。

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