呂 雪，李雪薇，楊 婷，鄭錦秀，祝子鶴，楊 濤,3*，徐 鈞

(山西醫(yī)科大學(xué) 1.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；2.藥理學(xué)教研室；3.細(xì)胞生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原030001；4.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 肝膽胰外科，山西 太原030001)

食管胃結(jié)合部腺癌(adenocarcinoma of the esophagogastric junction，AEG)是發(fā)生于食管-胃交界處的腺癌，表現(xiàn)出與食管癌、胃癌既相關(guān)又獨(dú)特的臨床病理特征，山西、河北和河南三省交界處是AEG發(fā)病率和病死率最高的地區(qū)[3]。

食管黏膜上皮基底層的角質(zhì)細(xì)胞通過形成包膜作為防御屏障的基礎(chǔ)， IVL是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的包膜前體蛋白[4]，在TGase1的作用下與其他包膜前體蛋白發(fā)生交聯(lián)[5]。在食管腺癌和巴雷特食管的生物信息分析中，IVL是顯著改變的差異表達(dá)基因[6-7]，但目前尚未見IVL異常表達(dá)對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能影響的研究，IVL突變在AEG中的研究也未見報(bào)道。

本文以山西地區(qū)AEG患者為研究對象，通過全外顯子組測序、TCGA數(shù)據(jù)分析IVL的突變情況，并進(jìn)一步探討IVL異常表達(dá)和突變對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系及組織標(biāo)本：食管癌細(xì)胞系KYSE150、KYSE30、TE9 購自ATCC(american type culture collection)，由本實(shí)驗(yàn)室自存。

醫(yī)院普通外科切除的22例SiewertⅡ型AEG患者的腫瘤組織及癌旁組織，委托上海華大基因公司運(yùn)用高通量測序(high-throughput sequencing)技術(shù)進(jìn)行測序，測序深度為200×。

食管癌的基因表達(dá)數(shù)據(jù)來自TCGA數(shù)據(jù)庫(https://tcga.xenahubs.net/download/TCGA.ESCA. sampleMap/HiSeq_exon.gz)，包含185例腫瘤樣本和11例正常對照樣本，并經(jīng)Log2標(biāo)準(zhǔn)化(由于目前并無AEG的TCGA表達(dá)譜數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞系，TCGA數(shù)據(jù)庫中AEG患者的IVL突變率為1%，Siewert Ⅱ 型AEG的生物學(xué)特性與食管癌更為相近，且IVL在SNU-1、AGS、GES等胃癌細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，所以本文采用的TCGA數(shù)據(jù)和細(xì)胞系皆為食管癌)。

經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)監(jiān)督下實(shí)施，患者標(biāo)本采集及檢測全部經(jīng)知情同意后實(shí)施，批準(zhǔn)文號(hào)：[2020]倫審字(K036)號(hào)。

1.1.2 主要試劑：RPMI1640培養(yǎng)基(含0.4 mmoL/L的Ca2+， Hyclone公司)；胎牛血清(FBS)(Moregate Biotech公司)；NeofectTMDNA transfection reagent(Neofecth公司)；Ultrapure RNA Kit、HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix(Cwbiotech公司)；IVL寡肽(中國常州康龍生物科技有限公司合成)；3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)、G-418(Solarbio公司)；Involucrin抗體(Abcam公司)；Transglutaminase1抗體(Novus公司)；Streptavidin-HRP抗體(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 差異表達(dá)基因的篩選：由于目前并無AEG的TCGA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，且TCGA中AEG數(shù)據(jù)的IVL突變率為1%，所以本文采用的TCGA數(shù)據(jù)為食管癌數(shù)據(jù)。將TCGA數(shù)據(jù)庫中的196例食管癌樣本分為兩組，一組為15例IVL突變腫瘤樣本和170例非IVL突變腫瘤樣本(T&T組)，一組為15例IVL突變腫瘤樣本和11例正常對照樣本(T&N組)，以Log2FC>1或Log2FC<-1，P<0.05為條件對兩組進(jìn)行篩選，篩選得到的差異基因輸入Venny網(wǎng)站(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)中,用韋恩法取交集得到共同差異表達(dá)基因。

1.2.2 GO分析和KEGG富集分析：將上述基因的ID統(tǒng)一為Entrez Gene ID輸入到DAVID在線工具(https: //david.ncifcrf.gov/home.jsp)中，選擇Functional Annotation Too作為分析工具進(jìn)行 GO 分析和 KEGG 信號(hào)通路分析，篩選條件為P<0.05。

1.2.3 細(xì)胞分組及處理：KYSE150、KYSE30和TE9細(xì)胞[8-9]用含10% FBS和1%青-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，在 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，鑒于后期實(shí)驗(yàn)中需要檢測TGase1催化IVL交聯(lián)的活性，而TGase1是Ca2+依賴性蛋白，故選用含有0.4 mmoL/L Ca2+的RPMI 1640培養(yǎng)基。

選取對數(shù)增殖期的KYSE150、KYSE30、TE9細(xì)胞接種于6孔板中，KYSE150分為GV362-NC組和GV362-IVL組；KYSE30和TE9分為shCtrl組、shIVL-1318組、shIVL-1593組、shIVL-1640組、shIVL-2930組。

1.2.4 質(zhì)粒的構(gòu)建：IVL過表達(dá)質(zhì)粒GV362-IVL由上海GeneChem公司構(gòu)建，上游引物為：5′-TACCG GACTCAGATCTCGAGCGCCACCATGTCCCAGCAAC ACACACTGCCAG-3′，下游引物為：5′-TCCTTGTAG TCCATGGATCCTTTATGTTTGGGTGGCCACTGCAC-3′。IVL敲減質(zhì)粒由上海GenePharma公司構(gòu)建，靶向IVL的shRNA序列見表1。

表1 靶向IVL的shRNA序列Table 1 shRNA sequence targeting IVL

1.2.5 IVL過表達(dá)和IVL敲減質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及G418的篩選：待細(xì)胞匯合至80%～90%時(shí)，用NeofectTMDNA transfection reagent分別轉(zhuǎn)染IVL過表達(dá)或敲減質(zhì)粒，48 h后用G-418(600 μg/mL)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

1.2.6 RT-qPCR檢測IVLmRNA：使用Ultrapure RNA Kit從細(xì)胞中提取總RNA，按照HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用QuantiNova SYBR Green PCR Kit進(jìn)行qPCR，以GAPDH為內(nèi)參。引物序列見表2。

表2 qPCR引物序列Table 2 qPCR primer sequences

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡檢測IVL和TGase1蛋白：使用RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法對蛋白進(jìn)行定量分析。通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜(PVDF)上，室溫下用5%的脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗4 ℃過夜孵育，次日加入二抗室溫孵育1 h，加入ECL發(fā)光液曝光顯影。

1.2.8 MTT法檢測細(xì)胞增殖：取對數(shù)增殖期的KYSE150細(xì)胞，按1×103個(gè)/孔接種至96孔板中，實(shí)驗(yàn)分為NC組和IVL過表達(dá)組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)0、1、2、3、4和5 d后，每孔加入20 μL(5 g/L)的MTT，4 h后終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，檢測490 nm處的吸光度值(A)。

1.2.9 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)：取對數(shù)增殖期的細(xì)胞接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞完全匯合后用200 μL的槍頭在孔板內(nèi)行“井”字劃痕，保證每孔劃痕寬度一致。用PBS清洗脫落的細(xì)胞后，加入無血清培養(yǎng)基，分別于0 h和12 h時(shí)在相同位置拍照觀察劃痕愈合情況。

1.2.10 寡肽合成及體外寡肽與TGase1結(jié)合能力分析：為了檢測IVL突變對TGase1催化活性的影響，根據(jù)測序結(jié)果和TCGA數(shù)據(jù)庫中IVL的突變情況，合成13種N端標(biāo)記生物素的IVL寡肽片段(表3)。以pepK5[10]和Net1、Net2(http://genomics.dote.hu/wiki)作為陽性對照，其余10個(gè)寡肽為野生型和突變型IVL寡肽分別作為對照組和實(shí)驗(yàn)組。

表3 IVL寡肽片段序列Table 3 IVL oligopeptide fragments sequence

為減少內(nèi)源性IVL與TGase1結(jié)合對實(shí)驗(yàn)的影響，利用shRNA敲減細(xì)胞內(nèi)源IVL；向培養(yǎng)基中另外添加0.3、0.6、0.9 mmoL/L的Ca2+(即終濃度為0.6、1、1.3 mmoL/L)，分別培養(yǎng)2，4，6 d后，提取的裂解液中加入pepK5(終濃度為300 mmoL/L)，37 ℃孵育30 min，進(jìn)行Western blot分析驗(yàn)證內(nèi)源性TGase1的活性；激活細(xì)胞中的TGase1后，收集細(xì)胞沉淀，提取細(xì)胞總蛋白，分成13組，向每組中加入不同的寡肽，終濃度為300 mmoL/L，37 ℃孵育30 min，進(jìn)行Western blot分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 AEG全外顯子組測序和IVL突變的生物信息學(xué)分析

對22例山西AEG患者的癌和癌旁組織進(jìn)行全外顯子組測序，發(fā)現(xiàn)突變率位于前5位的基因分別是Tp53、Ttn、Muc16、Nalcn和IVL。IVL的突變率為18%，在4例腫瘤樣本中發(fā)生了5處突變(圖1A)，皆為錯(cuò)義突變。將TCGA數(shù)據(jù)庫中的196例食管癌樣本分為T&T組和T&N組進(jìn)行差異基因表達(dá)分析(圖1B)。 T&T組篩選出1 707個(gè)差異基因，T&N組篩選出4 221個(gè)差異基因，使用Venny網(wǎng)站工具取交集，得到777個(gè)共同差異表達(dá)基因(圖1C)。GO功能分析顯示IVL突變與上皮細(xì)胞分化、細(xì)胞分化的調(diào)控、中性粒細(xì)胞趨化和腫瘤壞死因子激活受體的活性等生物學(xué)過程有關(guān)(圖1D)。KEGG分析表明差異基因富集到細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、cAMP、TNF等信號(hào)通路中(圖1E)。

A.gene mutation analysis of the whole genome sequencing results of cancer tissues and adjacent tissues of 22 AEG patients in Shanxi Province；B.data analysis process of 196 cases of esophageal cancer in TCGA database； C.venn diagram method analysis of the common differentially expressed genes of the T&T group and the T&N group；D,E.GO and KEGG analysis of 777 differential genes圖1 AEG全外顯子組測序及196例食管癌生物信息學(xué)分析Fig 1 AEG Whole Exome Sequencing and bioinformatics analysis of 196 cases of esophageal cancer

2.2 過表達(dá)IVL抑制食管癌細(xì)胞的增殖和遷移

在KYSE150、KYSE30和TE9三種細(xì)胞中，KYSE30細(xì)胞IVL表達(dá)最高，KYSE150的IVL表達(dá)最低(圖2A)。將過表達(dá)質(zhì)粒GV362-IVL轉(zhuǎn)染KYSE150，經(jīng)過G418篩選得到穩(wěn)定過表達(dá)IVL細(xì)胞株，與NC組相比，IVL過表達(dá)組在mRNA和蛋白水平明顯上調(diào)(圖2B,C)。IVL過表達(dá)可抑制食管癌細(xì)胞的增殖，上調(diào)IVL可抑制劃痕的愈合速度(圖2D,E)。

A.IVL protein expression levels of KYSE150, KYSE30, and TE9 cell lines；B.RNA level of KYSE150； C.protein level of KYSE150 over-expression efficiency; D.MTT test of KYSE150 with IVL over-expression；E.effect of over-expressed IVL on cell migration was verified by scratch healing experiment；*P<0.05，**P<0.01 compared with control group圖2 過表達(dá)IVL對食管癌細(xì)胞增殖和遷移的影響Fig 2 Effect of over-expression of IVL on the proliferation and migration of esophageal cancer

2.3 IVL重復(fù)基序第7位氨基酸的突變可能是其蛋白質(zhì)功能影響的關(guān)鍵因素

3種食管癌細(xì)胞中，TE9的TGase1表達(dá)水平最高(圖3A)，shIVL-1318可降低TE9細(xì)胞內(nèi)IVL的 mRNA和蛋白水平(圖3B～E)。終濃度1mmoL/L的Ca2+處理TE9細(xì)胞4 d后，TGase1活性較好(圖3F)。Q439H突變寡肽與TGase1結(jié)合能力明顯比野生型寡肽弱(圖3G)。

A.TGase1 levels in KYSE150, KYSE30 and TE9 cells；B,C.verification of IVL knockdown in KYSE30 cells, RNA level(B), protein level(C)；D,E.effect of SHIVL-1318 plasmid knockdown on TE9 cells was detected, mRNA level(D), protein level(E)；F.detection of TGase1 activity at different Ca2+ concentration treatment for different time；G.detectoin of oligopeptides binding with TGase1；*P<0.05，**P<0.01 compared with control group圖3 野生型IVL寡肽和突變型IVL寡肽與TGase1結(jié)合活性的比較Fig 3 Comparison of binding activity of wild-type IVL oligopeptide and mutant IVL oligopeptide with TGase1

3 討論

研究表明AEG在國內(nèi)外發(fā)病率逐年升高[11]，且多數(shù)AEG患者發(fā)現(xiàn)晚，病死率高[12]。因此，早期診斷對于提高AEG患者預(yù)后顯得尤為重要。目前中國AEG的診斷治療方法以采用內(nèi)鏡活檢和手術(shù)為主，除靶向治療及免疫治療相關(guān)指標(biāo)外，仍無一種分子指標(biāo)或綜合指標(biāo)可以替代傳統(tǒng)的病理診斷地位[13]。本研究通過對22例山西省AEG患者癌和癌旁組織進(jìn)行全外顯子組測序并聯(lián)合分析TCGA數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)山西人群中IVL基因突變率高達(dá)18%，而TCGA數(shù)據(jù)庫中排名前10位的突變基因并無IVL基因突變，這種明顯的差異預(yù)示IVL突變有可能是山西AEG特有的發(fā)病原因。

IVL作為早期分化標(biāo)志蛋白，在上皮細(xì)胞中的表達(dá)增多會(huì)促進(jìn)分化、抑制增殖[14]，這與本文上調(diào)IVL后抑制增殖和遷移的結(jié)果一致。IVL的蛋白結(jié)構(gòu)中有39個(gè)重復(fù)序列，重復(fù)基序?yàn)閇LP]-[EKG]-[LHVYQEK]-[PLSQE]-[EQDV]-[QHEKRGA]-Q-[EMVQLP]-[GKLE]-[QHVNLD]。22例食管胃結(jié)合部腺癌患者的測序結(jié)果和TCGA數(shù)據(jù)庫食管癌中有24處IVL突變，有23處突變(除了Q72H)分布在重復(fù)序列中，Q突變占62.5%，重復(fù)序列中第7位氨基酸Q最為保守，且TGase1與IVL結(jié)合位點(diǎn)也是Q，綜上推測重復(fù)基序第七位Q的突變可能會(huì)影響IVL功能。因此，針對23處突變中有5個(gè)發(fā)生在重復(fù)基序第7位氨基酸的突變設(shè)計(jì)了10個(gè)野生寡肽和突變寡肽去驗(yàn)證這種突變是否會(huì)影響與TGase1的結(jié)合能力。結(jié)果表明突變的Q439H寡肽與TGase1結(jié)合能力減弱，證實(shí)該突變可能無法通過TGase1參與角質(zhì)包膜的形成；Q239P寡肽雖然與TGase1結(jié)合能力幾乎不變， 但是和其他包膜前體蛋白結(jié)合能力減弱(IVL還與FLG、LOR、RPPL、SPRR1A等包膜前體蛋白結(jié)合[10, 15])。由于這些寡肽并無蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，具有完整結(jié)構(gòu)的突變IVL是否與突變的寡肽一樣，通過減弱與TGase1或其他包膜前體蛋白結(jié)合從而導(dǎo)致角質(zhì)包膜形成障礙，還需要進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn),山西地區(qū)食管胃結(jié)合部腺癌患者IVL突變率高達(dá)18%，過表達(dá)IVL可抑制食管癌細(xì)胞中的增殖和遷移，IVL Q439H突變可能影響其與TGase1結(jié)合，以上結(jié)果為探索山西地區(qū)食管胃結(jié)合部腺癌的發(fā)病機(jī)制提供了一種新的參考。