封露露，賈立云，弓苗，馬翠霞，封紀(jì)珍

高脯氨酸血癥（hyperprolinemia）是一種先天性氨基酸代謝障礙性疾病，遺傳方式為常染色體隱性遺傳，脯氨酸脫氫酶（proline dehydrogenase，PRODH）與ALDH4A1基因變異均可導(dǎo)致脯氨酸無(wú)法轉(zhuǎn)化為谷氨酸，進(jìn)而參與氧化代謝，導(dǎo)致脯氨酸在血液中蓄積，此病在氨基酸代謝病中較為罕見(jiàn)，患病率尚不明確[1]。根據(jù)代謝途徑中不同酶的功能缺陷，可將高脯氨酸血癥分為Ⅰ型與Ⅱ型[2]。目前國(guó)外普遍采用串聯(lián)質(zhì)譜法及分子技術(shù)對(duì)其進(jìn)行篩查和診斷，發(fā)現(xiàn)PRODH基因的變異可以導(dǎo)致脯氨酸水平異常[3-4]。石家莊市新生兒疾病篩查診治中心從2014年開(kāi)始對(duì)包括脯氨酸在內(nèi)的多種氨基酸代謝病進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜篩查，對(duì)于篩查陽(yáng)性患兒通過(guò)基因測(cè)序技術(shù)分析相關(guān)基因突變情況，并結(jié)合臨床表現(xiàn)對(duì)基因突變的致病性進(jìn)行研究。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象2014年1月—2020年12月在石家莊市縣區(qū)所轄的38個(gè)助產(chǎn)機(jī)構(gòu)分娩的172 895例活產(chǎn)新生兒篩查并確診了5例高脯氨酸血癥患兒，篩查需在知情同意下進(jìn)行，本研究經(jīng)石家莊市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并實(shí)施。

1.2 串聯(lián)質(zhì)譜篩查及基因測(cè)序技術(shù)

1.2.1 儀器與試劑Waters TQD液相串聯(lián)質(zhì)譜儀、Waters 2777C自動(dòng)進(jìn)樣器和Waters 1525高效液相色譜儀泵；超聲波清洗儀購(gòu)自中國(guó)康士潔公司。恒溫震蕩儀購(gòu)自杭州奧盛儀器公司。通風(fēng)廚購(gòu)自中國(guó)杰瑞電氣有限公司。氨基酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自山東英盛有限公司。

1.2.2 標(biāo)本采集新生兒在出生72 h后，充分哺乳8次以上，采集足跟末梢血滴于903號(hào)濾紙片上，形成至少3個(gè)直徑＞8 mm圓形均勻的血斑，懸空使血液自然滲透至濾紙背面，避免重復(fù)滴血，自然晾干后置于密封袋，遞送至新生兒疾病篩查中心實(shí)驗(yàn)室，置于冰箱冷藏，保存待檢。

1.2.3 串聯(lián)質(zhì)譜-非衍生法打孔器打入直徑3 mm的高、低質(zhì)控樣本和待檢樣本血斑于96孔萃取板，加入90 μL工作液，700 r/min，30℃，恒溫震蕩孵育45 min；將萃取液轉(zhuǎn)移75 μL至上機(jī)板。將上機(jī)板置于Waters 2777C自動(dòng)進(jìn)樣器中，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下進(jìn)行檢測(cè)；用MassLynxV4.1計(jì)算待檢物濃度。山東英盛有限公司提供的質(zhì)控品與待檢樣品同時(shí)測(cè)定，質(zhì)控的處理方法與樣本一致，采用多批實(shí)驗(yàn)、最小20次質(zhì)控值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和均值，制作質(zhì)控圖。此外，每年參加國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)并合格。

1.2.4 篩查可疑陽(yáng)性判定及基因測(cè)序技術(shù)初篩脯氨酸濃度＞330 μmol/L即召回，召回復(fù)查脯氨酸濃度仍＞330 μmol/L者為篩查可疑陽(yáng)性患兒，需在患者家屬知情同意下采用基因測(cè)序技術(shù)進(jìn)行PRODH基因檢測(cè)，以明確病因。知情同意下抽取篩查可疑陽(yáng)性患兒靜脈血（2%乙二胺四乙酸鈉抗凝），提取DNA，進(jìn)行基因突變分析。檢測(cè)到的變異采用Sanger直接測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證，避免假陽(yáng)性。

1.3 治療及隨訪①限制食物中脯氨酸的攝入進(jìn)行飲食治療，降低血脯氨酸濃度。②口服抗氧化劑（維生素C、維生素E、谷胱甘肽）和維生素B6進(jìn)行藥物治療，可改善癲癇癥狀，用藥情況需結(jié)合臨床。③每半年對(duì)患兒脯氨酸濃度、治療情況及生長(zhǎng)發(fā)育情況進(jìn)行電話隨訪，截止至6歲。

2 結(jié)果

2.1 串聯(lián)質(zhì)譜篩查結(jié)果172 895例活產(chǎn)新生兒中篩查可疑陽(yáng)性患兒10例，基因測(cè)序后確診5例，患病率為1/34 579。例1召回復(fù)查的同時(shí)對(duì)其長(zhǎng)兄進(jìn)行采血，其長(zhǎng)兄的脯氨酸濃度為578.83 μmol/L；例2初篩時(shí)除脯氨酸濃度升高，還合并苯丙氨酸升高（165.45 μmol/L），召回時(shí)直接進(jìn)行基因測(cè)序；例3初篩時(shí)脯氨酸濃度（91.19 μmol/L）不高，因肉堿濃度低召回，復(fù)查時(shí)脯氨酸濃度為349.72 μmol/L；例4和例5初篩、復(fù)查脯氨酸濃度均＞400 μmol/L，見(jiàn)表1。

表1 10例篩查可疑陽(yáng)性患兒血脯氨酸濃度的串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果 （μmol/L）

2.2 基因測(cè)序結(jié)果10例篩查可疑陽(yáng)性患兒中基因確診5例，基因檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。例1為PRODH基因復(fù)合雜合突變，基因型為c.1322T＞C和c.273+1G＞C，其中c.273+1G＞C為未報(bào)道基因突變。例2為PRODH基因復(fù)合雜合突變，基因型為c.334delA和c.1322T＞C，其中c.334delA為未報(bào)道基因突變。例3檢測(cè)到PRODH基因整體雜合缺失，見(jiàn)圖1。

圖1 例3 PRODH基因整體雜合缺失

表2 5例高脯氨酸血癥患兒基因檢測(cè)結(jié)果

2.3 5例患兒隨訪結(jié)果對(duì)5例患兒進(jìn)行電話隨訪，因臨床表現(xiàn)不明顯，未給予藥物治療，部分患兒僅限制食物中脯氨酸攝入。隨訪截止時(shí)年齡為1歲5個(gè)月～5歲7個(gè)月，例5因隨訪截止時(shí)年齡較小，為1歲5個(gè)月，語(yǔ)言發(fā)育稍落后，需繼續(xù)觀察。其他患兒未出現(xiàn)特征性臨床表現(xiàn)，體格及智力發(fā)育正常。例1和例4進(jìn)行了短期飲食治療，其余患兒均未進(jìn)行治療，見(jiàn)表3。

表3 5例患兒治療隨訪情況

3 討論

脯氨酸屬人體非必需氨基酸，參與多種生物過(guò)程，如蛋白質(zhì)折疊、生物大分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及氧化還原信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]。機(jī)體可外源性攝入脯氨酸，也可內(nèi)源性通過(guò)谷氨酸或鳥(niǎo)氨酸途徑合成。機(jī)體通過(guò)自身調(diào)節(jié)機(jī)制，控制著脯氨酸的來(lái)源和去路，使脯氨酸維持較低濃度?；蜃儺惪梢鸶彼岽x通路中的酶功能異常，導(dǎo)致先天性代謝紊亂，引起脯氨酸濃度變化，脯氨酸異常升高稱(chēng)為高脯氨酸血癥。

隨著串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的推廣應(yīng)用，各地區(qū)相繼開(kāi)展新生兒氨基酸代謝病篩查工作，使越來(lái)越多的高脯氨酸血癥患兒在新生兒早期得以檢出[6-9]。目前國(guó)外利用串聯(lián)質(zhì)譜法及分子技術(shù)進(jìn)行篩查及診斷，發(fā)現(xiàn)PRODH基因突變與脯氨酸水平異常密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)單獨(dú)報(bào)道高脯氨酸血癥的文獻(xiàn)較少，大部分報(bào)道為遺傳性代謝病篩查的總體情況，其中山東濰坊地區(qū)2013—2016年77 974例新生兒中高脯氨酸血癥患病率為1/25 991[10]；浙江省2009—2016年1 861 262例新生兒中高脯氨酸血癥患病率為1/310 000[11]；福建泉州地區(qū)2014—2018年364 545例新生兒中高脯氨酸血癥患病率為1/364 545[12]；河南省2013—2019年850 486例新生兒中高脯氨酸血癥的患病率為1/850 486[13]。本研究石家莊市172 895例新生兒中基因確診5例，患病率為1/34 579，與山東濰坊地區(qū)患病率較接近，遠(yuǎn)高于其他地區(qū)，表明高脯氨酸血癥患病率有地域性差異。

脯氨酸代謝主要與P5C還原酶、脯氨酸氧化酶（proline oxidase，POX）、P5C脫氫酶、P5C合成酶、鳥(niǎo)氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和脯氨酸肽酶相關(guān)，與6種疾病相關(guān)：高脯氨酸血癥Ⅰ型、高脯氨酸血癥Ⅱ型、鳥(niǎo)氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、5C還原酶缺乏癥、P5C合成酶缺乏癥和脯氨酸肽酶缺乏癥。本研究檢出的患兒均為高脯氨酸血癥Ⅰ型。高脯氨酸血癥Ⅰ型是由POX缺陷引起，POX為線粒體內(nèi)膜酶，是脯氨酸生成谷氨酸的第一個(gè)關(guān)鍵酶[14]，POX的編碼基因是PRODH，定位于22q11.21，共含15個(gè)外顯子[15]。目前已報(bào)道的PRODH基因突變有c.1279G＞A（p.V427M）、c.1357C＞T（p.R453C）、c.1414G＞A（p.A472T）、c.1562A＞G（p.Q521R）[16-18]等。本研究確診的5例高脯氨酸血癥患兒共發(fā)現(xiàn)4種突變，其中文獻(xiàn)已報(bào)道2種，為c.1322T＞C和c.1363G＞T；文獻(xiàn)尚未報(bào)道2種，分別為c.273+1G＞C和c.334delA；其中c.1322T＞C為熱點(diǎn)突變。

高脯氨酸血癥臨床表現(xiàn)不一，大部分表現(xiàn)為良性病程，部分患者有不同程度的精神障礙及生長(zhǎng)發(fā)育障礙，精神癥狀與高脯氨酸血癥的相關(guān)性為研究熱點(diǎn)[16,19-22]。因此，對(duì)于無(wú)癥狀的患兒需根據(jù)頭顱磁共振成像、腦電圖和血脯氨酸濃度等隨訪生長(zhǎng)發(fā)育情況[2]。本研究5例患兒隨訪發(fā)現(xiàn)，除例5存在語(yǔ)言發(fā)育稍落后外，其他患兒各項(xiàng)指標(biāo)發(fā)育均正常；最長(zhǎng)的隨訪至5歲7個(gè)月，也未出現(xiàn)臨床表現(xiàn)。因此，雖然5例患兒均檢測(cè)到基因突變，然而其致病性尚不明確，需結(jié)合長(zhǎng)期隨訪情況進(jìn)一步研究。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)氨基酸代謝性疾病的早期診斷具有重要價(jià)值，應(yīng)用于新生兒疾病篩查可及早檢出代謝異?；純?，聯(lián)合基因測(cè)序技術(shù)，可進(jìn)一步診斷并明確病因，為后期臨床咨詢及治療提供依據(jù)。