牛膝-杜仲藥對對小鼠巨噬細胞RAW264.7的抗炎作用

高明珠 陳春 張巧艷 卞俊 鮑蕾蕾

中圖分類號 R965 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）03-0308-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.03.09

摘 要 目的 研究牛膝-杜仲藥對的抗炎作用。方法 將小鼠巨噬細胞RAW264.7分為空白組、模型組、牛膝組（800 μg/mL）、杜仲組（800 μg/mL）和牛膝-杜仲藥對低、中、高濃度組（400、800、1 600 μg/mL），除空白組和模型組外，其余各組加入相應(yīng)藥物培養(yǎng)6 h后，空白組繼續(xù)加入培養(yǎng)基，模型組加入10 μg/mL 脂多糖（以復制炎癥模型），其余各組加入相應(yīng)藥物和10 μg/mL 脂多糖。檢測各組細胞中炎癥因子[一氧化氮（NO）、白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）]的水平，并采用金氏公式評價牛膝、杜仲的聯(lián)合作用;檢測細胞中誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧合酶2（COX-2）、核因子κB（NF-κB）抑制蛋白α（IκBα）的表達水平和NF-κB p65、IκB激酶（IKK）、p38絲裂原激活的蛋白激酶（p38 MAPK）、胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun N端激酶 （JNK）的磷酸化水平。結(jié)果 與空白組比較，模型組細胞中炎癥因子水平以及iNOS、COX-2蛋白表達水平和NF-κB p65、IKK、p38 MAPK、ERK、JNK蛋白磷酸化水平均顯著升高（P<0.01），IκBα蛋白的表達水平顯著降低（P<0.01）;經(jīng)牛膝-杜仲藥對干預后，細胞中炎癥因子水平以及上述蛋白的表達水平或磷酸化水平大部分顯著逆轉(zhuǎn)（P<0.05或P<0.01），且牛膝-杜仲藥對具有協(xié)同作用。結(jié)論 牛膝-杜仲藥對對RAW264.7細胞具有協(xié)同抗炎作用，其作用機制可能與抑制NF-κB/MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞 牛膝;杜仲;藥對;抗炎;NF-κB/MAPK信號通路

Anti-inflammatory effect of couplet medicinals of Achyranthes bidentata-Eucommia ulmoides on mouse macrophage RAW264.7

GAO Mingzhu1，2，3，CHEN Chun1，2，ZHANG Qiaoyan3，BIAN Jun4，BAO Leilei1，2（1. School of Pharmacy， Jiangxi University of Chinese Medicine， Nanchang 330004， China; 2. Dept. of Pharmacy， the Third Affiliated Hospital of Naval Medical University， Shanghai 200438， China; 3. School of Pharmacy， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 311402， China; 4. Dept. of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Naval Medical University， Shanghai 200438， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To study the anti-inflammatory effect of couplet medicinals of Achyranthes bidentata-Eucommia ulmoides. METHODS Mouse macrophage RAW264.7 were divided into blank group， model group， A. bidentata group （800? ? ? ? ?μg/mL）， E. ulmoides group （800 μg/mL） and low-， medium- and high- concentration groups of couplet medicinals of A. bidentata- E. ulmoides （400， 800， 1 600 μg/mL）. Excep for blank group and model group， the other groups were added with corresponding drugs for 6 hours; then blank group was continued to add into the medium， while model group was added into 10 μg/mL lipopolysaccharide （to induce the inflammatory model）; other groups were added into corresponding drugs and 10 μg/mL lipopolysaccharide. The levels of inflammatory factors [nitric oxide （NO）， interleukin-1β （IL-1β）， IL-6， tumor necrosis factor-α （TNF-α）] were detected， and Jin’s formula was used to evaluate the effects of A. bidentata-E. ulmoides. The expression of inducible nitric oxide synthase （iNOS）， cyclooxygenase-2 （COX-2）， nuclear factor kappa-B （NF-κB） and inhibitor α of NF-κB? ? （IκBα） as well as the phosphorylation of NF-κB p65， IκB kinase （IKK）， p38 mitogen-activated protein kinase （p38 MAPK）， extracellular signal-regulated kinase （ERK）and c-Jun N-terminal kinase （JNK） were determined. RESULTS Compared with blank group， the level of inflammatory factors， protein expression of iNOS and COX-2 as well as the phosphorylation of NF-κB p65， IKK， p38 MAPK， ERK and JNK were increased significantly （P<0.01）， while the protein expression of IκBα was decreased significantly （P<0.01）. After intervention of couplet medicinals of A. bidentata-E. ulmoides， the level of inflammatory factors， the expression or phosphorylation of above proteins were reversed significantly （P<0.05 or P<0.01）， and couplet medicinals of A. bidentata-E. ulmoides had a synergistic effect. CONCLUSIONS The couplet medicinals of A. bidentata-E. ulmoides have synergistic anti-inflammatory effect on RAW264.7 cells. Its mechanism may be related to the inhibition of NF-κB/MAPK signaling pathway related protein expression.

KEYWORDS? ?Achyranthes bidentata; Eucommia ulmoides; couplet medicinals; anti-inflammation; NF-κB/MAPK signaling pathway

牛膝為莧科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根，具有補肝腎、強筋骨、祛瘀通絡(luò)和引血下行的作用，主要含有多糖、多肽、三萜皂苷類、酮甾類、甾醇類、生物堿類等化學成分，具有抑制神經(jīng)細胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫相關(guān)細胞因子等作用[1]。杜仲是杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliver.的樹皮，在我國有兩千多年的用藥歷史，《神農(nóng)本草經(jīng)》中將其列為上品，主要用于治療肝腎不足、腰膝酸痛、筋骨無力、頭暈目眩等疾病，是中醫(yī)骨傷科治療骨關(guān)節(jié)炎的常見藥物，被廣泛應(yīng)用于中藥方劑或中成藥配伍中[2]。

藥對又稱為對藥、對子，由臨床上相對固定的2味藥材配伍而成，具有中藥配伍的基本特點。《中藥藥對大全》中將牛膝、杜仲列為藥對，使兩者補肝腎、強筋骨之力倍增[3]。壯筋養(yǎng)血湯、補腎養(yǎng)血化瘀湯、補益干漆丸、杜仲丸和獨活寄生湯均為我國治療骨關(guān)節(jié)炎的傳統(tǒng)方劑，這些方劑中均含有牛膝、杜仲2味藥材[4-5]。骨關(guān)節(jié)炎是一種以炎癥和軟骨退化為特征的關(guān)節(jié)疾病[6]?；诖耍狙芯恳孕∈缶奘杉毎鸕AW264.7為研究對象，以脂多糖誘導建立細胞炎癥模型[7]，從體外層面考察牛膝-杜仲藥對的協(xié)同抗炎作用，為闡明該藥對治療骨關(guān)節(jié)炎的機制提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有SW-CJ-2FD型雙人單面超凈臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、MCO-15AC型CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）、DMI3000型倒置相差顯微鏡（美國Leica公司）、Synergy LX型連續(xù)波長酶標儀（美國Bio-Tek公司 ）、LDZX-30KB型高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、LP502型電子天平（常熟市衡器廠）、WD- 9413B型凝膠成像系統(tǒng)（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 主要藥品和試劑

本研究所用主要藥品有牛膝、生杜仲（上海虹橋中藥飲片公司，批號分別為210326、191231），經(jīng)海軍軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院藥劑科鮑蕾蕾副主任藥師鑒定為真品。主要試劑有DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司，批號分別為p002548、10099）;CCK-8試劑盒、Western及IP細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號分別為C0038、P0013、P0012、S0021M）;ECL化學發(fā)光劑（北京Biosharp公司，批號BL520B）;小鼠白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、小鼠IL-1β ELISA試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號分別為MM-0163M2、MM-0040M1、MM-0040M1）;兔源誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）多克隆抗體、兔源環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）多克隆抗體、兔源核因子κB p65（nuclear factor kappa-B p65，NF-κB p65）多克隆抗體、兔源磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）多克隆抗體、兔源NF-κB抑制蛋白α（inhibitor α of NF-κB，? ?IκBα）多克隆抗體、兔源IκB激酶（IκB kinase，IKK）多克隆抗體、兔源磷酸化IKK （p-IKK）多克隆抗體、兔源p38絲裂原激活的蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）多克隆抗體、兔源磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）多克隆抗體、兔源胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）多克隆抗體、兔源磷酸化ERK（p-ERK）多克隆抗體、兔源c-Jun N端激酶 （c-Jun N-terminal kinase，JNK）多克隆抗體、兔源磷酸化JNK（p-JNK）多克隆抗體、兔源GAPDH多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（美國Cell Signing Technology公司，批號分別為#13120S、#3033、#12282、#11930、#4814、#8242、#2697、#4511、#8690、#4370、#4695、#4668、#9252、#13120S、#7074S）;其余試劑為實驗室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 細胞

本研究所用小鼠巨噬細胞RAW264.7受贈于浙江中醫(yī)藥大學張巧艷教授課題組。

2 方法

2.1 單一藥材水提液和牛膝-杜仲藥對水提液的制備

取牛膝10 g、杜仲10 g 分別加10倍量水（mL/g，下同）浸泡過夜，煎煮至沸騰后保持微沸15 min，過濾;再加等量水重復煎煮，提取2次，過濾;合并3次濾液并濃縮成浸膏。另外，取牛膝10 g、杜仲10 g混合，加入10倍量水浸泡過夜，再同上述方法煎煮、過濾，濃縮成浸膏。再將單味藥以及藥對的浸膏加水溶解，均制成生藥量為10 mg/mL的藥液。

2.2 細胞培養(yǎng)

將RAW264.7細胞復蘇，以含5%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡稱“培養(yǎng)基”）置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，待細胞融合度達70%～80%時進行傳代，然后進行后續(xù)實驗。

2.3 牛膝-杜仲藥對的細胞毒性考察

將細胞以1×105 mL-1接種于96孔板中，每孔0.2 mL，然后分為空白組、牛膝不同濃度組（50、100、200、400、800 μg/mL，以生藥質(zhì)量濃度計，下同）、杜仲不同濃度組（50、100、200、400、800 μg/mL）、牛膝-杜仲藥對不同濃度組（100、200、400、800、1 600 μg/mL），上述各給藥濃度根據(jù)本課題組前期預實驗結(jié)果設(shè)置。各組細胞培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)基，空白組加入培養(yǎng)基100 μL，其余各組加入含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基100 μL;培養(yǎng)24 h后，按CCK-8試劑盒說明書方法操作，然后采用酶標儀于450 nm波長下檢測各孔的吸光度，吸光度越大表明細胞存活數(shù)量越多、藥物毒性越低。

2.4 分組、造模與給藥

將細胞以1×105 mL-1接種于96孔板中或以8×105 mL-1接種于6孔板，然后分為空白組、模型組、牛膝組（800 μg/mL）、杜仲組（800 μg/mL）和牛膝-杜仲藥對低、中、高濃度組（400、800、1 600 μg/mL），上述各給藥濃度根據(jù)本課題組前期預實驗結(jié)果設(shè)置?？瞻捉M和模型組加入培養(yǎng)基，其余各組加入含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)6 h;棄去培養(yǎng)基，空白組加入培養(yǎng)基，模型組加入含10? ?μg/mL 脂多糖的培養(yǎng)基（以復制炎癥模型），其余各組加入含相應(yīng)藥物和10 μg/mL脂多糖的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)18 h，再進行后續(xù)實驗。

2.5 牛膝-杜仲藥對對細胞中炎癥因子表達的影響及聯(lián)合作用評價

采用Griess法和ELISA法進行檢測。將細胞以1×105 mL-1接種于96孔板中，每孔0.2 mL，按“2.4”項下方法分組、造模與給藥，每組設(shè)置6個復孔。細胞培養(yǎng)結(jié)束后，取上清液，按照NO含量測定試劑盒和相應(yīng)ELISA說明書相關(guān)方法操作，檢測細胞中NO、IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，并計算各炎癥因子抑制率[抑制率=（模型組炎癥因子水平-給藥組炎癥因子水平）/模型組炎癥因子水平×100%]。另外，采用金氏公式（Q=[EA+BEA+EB-EA×EB] ）評價牛膝-杜仲藥對的聯(lián)合作用，其中EA、EB分別表示牛膝、杜仲單獨作用時的炎癥因子抑制率，EA+B表示牛膝、杜仲聯(lián)合作用后的炎癥因子抑制率（此處以牛膝-杜仲藥對高濃度組所得抑制率結(jié)果進行計算）;當Q值大于1.15時表示兩者具有協(xié)同作用，當Q值小于0.85時表示兩者具有拮抗作用[8]。

2.6 牛膝-杜仲藥對對細胞中炎癥相關(guān)蛋白表達的影響

采用Western blot法進行檢測。將細胞以8×105 mL-1接種于6孔板中，按“2.4”項下方法分組、造模與給藥，每組設(shè)3個復孔。細胞培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，以PBS洗滌2～3次，加入適量RIPA裂解液提取總蛋白，并置于冰上充分裂解30 min后，于4 ℃條件下以12 000? ? ? r/min離心15 min;取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)煮沸變性后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳;轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉封閉2 h;加入iNOS、COX-2、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IKK、IKK、? IκBα、p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、GAPDH一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;以TBST洗膜10 min×3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 3 000），室溫孵育2 h;以TBST洗膜10 min×3次，加入ECL化學發(fā)光試劑，采用凝膠成像系統(tǒng)成像。采用Image J 6.0軟件進行分析，以iNOS、COX-2、IκBα與內(nèi)參GAPDH的蛋白條帶灰度值比值表示這3種蛋白的表達水平，以p-NF-κB p65與NF-κB p65、p-IKK與IKK、p-p38 MAPK與p38 MAPK、p-ERK與ERK、p-JNK與JNK的蛋白條帶灰度值比值表示這5種蛋白的磷酸化水平。

2.7 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism、SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示;多組間比較采用單因素方差分析;組間兩兩比較時，若方差齊則采用最小顯著性差異法（LSD），若方差不齊則采用Dunnett’s T3多重比較。檢驗水準α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 牛膝-杜仲藥對的細胞毒性考察結(jié)果

與空白組比較，單一藥材不同濃度組和牛膝-杜仲藥對不同濃度組細胞吸光度差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），表明牛膝、杜仲的單一藥材或兩者組成藥對后均對RAW264.7細胞的生長無毒性作用，結(jié)果見表1、表2、表3。

3.2 牛膝-杜仲藥對對細胞中炎癥因子表達的影響及聯(lián)合作用評價結(jié)果

與空白組比較，模型組細胞中NO、IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，杜仲組細胞中NO水平顯著降低（P<0.01），牛膝-杜仲藥對各濃度組細胞中上述指標水平大部分顯著降低（P<0.05或P<0.01），結(jié)果見表4。另外，牛膝、杜仲聯(lián)合作用后，對NO、IL-1β、IL-6和TNF-α抑制率的Q值分別為3.43、1.29、1.37、1.97，均大于1.15，表明兩者具有協(xié)同抗炎作用。

3.3 牛膝-杜仲藥對對細胞中炎癥相關(guān)蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組細胞中iNOS、COX-2蛋白的表達水平和NF-κB p65、IKK、p38 MAPK、ERK、JNK蛋白的磷酸化水平均顯著升高（P<0.01），IκBα蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，牛膝組、杜仲組以及牛膝-杜仲藥對各濃度組細胞中上述蛋白的表達水平或磷酸化水平大部分顯著逆轉(zhuǎn)（P<0.05或P<0.01）。結(jié)果見圖1、表5。

4 討論

藥對是以中醫(yī)藥基本理論為原則，選擇性地將2味中藥進行配對的組合藥，以達到促進某一功效的目的，從而有利于提高臨床療效。牛膝、杜仲是補肝腎、強筋骨的常用藥對，杜仲主下部氣分，長于補益腎氣;牛膝主下部血分，偏于益血通脈;兩者配伍可兼顧氣血，使補肝腎、強筋骨之力倍增[9]。Jian等[10]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法和分子對接法鑒定出牛膝-杜仲藥對治療骨關(guān)節(jié)炎的活性成分包括槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素等。這提示，牛膝-杜仲藥對在治療骨關(guān)節(jié)炎方面具有一定潛力。

骨關(guān)節(jié)炎是一種退行性關(guān)節(jié)疾病，但目前其具體發(fā)病機制尚不明確，推測其可能與炎癥因子、基質(zhì)金屬蛋白酶有關(guān)[11-12]。在炎癥反應(yīng)中，炎癥因子NO、IL-1β、IL-6和TNF-α均具有重要作用：低濃度的NO可促進炎癥、誘導血管擴張，高濃度的NO可調(diào)節(jié)黏附因子、誘導炎癥細胞凋亡[13];IL-1β可促進炎癥，對宿主感染和損傷的防御反應(yīng)至關(guān)重要[11];IL-6由單核巨噬細胞產(chǎn)生，在機體的抗感染免疫反應(yīng)中具有重要作用[14];TNF-α在細胞炎癥、增殖、分化和凋亡中具有重要作用[15]。這些炎癥因子可誘導基質(zhì)金屬蛋白酶和前列腺素的產(chǎn)生，抑制蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成，從而促進骨關(guān)節(jié)炎的病情發(fā)展[16]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)牛膝-杜仲藥對干預后，RAW264.7細胞中NO、IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著降低，這表明牛膝-杜仲藥對對細胞具有抗炎作用，且兩者具有協(xié)同作用。

NO是一種自由基，主要由一氧化氮合成酶家族催化合成，其中包括內(nèi)皮細胞一氧化氮合酶、iNOS以及神經(jīng)元性一氧化氮合酶;當炎癥因子刺激巨噬細胞或軟骨細胞時，iNOS的表達水平增加，進而導致NO大量產(chǎn)生[17]。NF-κB 是經(jīng)典的炎癥信號通路，當發(fā)生炎癥反應(yīng)時，該通路被激活，IκBα與NF-κB p65發(fā)生解離，IκBα的表達減少，NF-κB p65進入細胞核內(nèi)，進一步促進炎癥因子如NO、IL-1β、IL-6和TNF-α等的轉(zhuǎn)錄[18]。MAPK （其亞單位包括p38 MAPK、ERK、JNK等）是NF-κB的上游調(diào)控因子，可加速炎癥反應(yīng)，激活iNOS、COX-2，進一步催化前列腺素E2的生成，從而誘導IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌[18]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)牛膝-杜仲藥對干預后，細胞中iNOS、COX-2蛋白表達水平和NF-κB p65、IKK、p38 MAPK、ERK、JNK蛋白的磷酸化水平等指標大部分顯著降低（P<0.05或P<0.01）。這表明牛膝-杜仲藥對對RAW264.7細胞的抗炎作用可能與NF-κB/MAPK信號通路有關(guān)。

綜上所述，牛膝-杜仲藥對對RAW264.7細胞具有協(xié)同抗炎作用，其作用機制可能與抑制NF-κB/MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達有關(guān)。

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（收稿日期：2021-07-19 修回日期：2021-11-14）

（編輯：唐曉蓮）

基金項目：上海市科研計劃項目（No.19ZR1456500）

碩士研究生。研究方向：中藥藥理學。E-mail：576436541@qq.com

通信作者：副主任藥師，碩士生導師。研究方向：中藥藥理學。 E-mail：annabao212@126.com