申文雪， 吳艷萍， 許英蕾， 王永俠， 劉玉蘭， 張瑞強(qiáng)

(浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物健康互聯(lián)網(wǎng)檢測(cè)技術(shù)浙江省工程實(shí)驗(yàn)室1，杭州 311300) (浙江惠嘉生物科技股份有限公司2，安吉 313300)

抗生素被用作促生長(zhǎng)劑添加到飼料中用以防治肉雞養(yǎng)殖規(guī)模化、高密度等引發(fā)的疾病頻發(fā)[1]。自2020年7月1日起，我國(guó)飼糧中禁止添加除中草藥以外的促生長(zhǎng)類(lèi)藥物作為飼料添加劑[2]，因此，尋找安全有效的抗生素替代品成為家禽業(yè)研究的重要課題之一。

鼠李糖脂是一種由假單胞菌或伯克氏菌類(lèi)等代謝產(chǎn)生的一種含碳水化合物的類(lèi)脂，是一種典型的生物表面活性劑[3]。研究表明，鼠李糖脂安全、無(wú)毒且具有良好的乳化性能和抗菌性能[4]，被廣泛應(yīng)用于石油、環(huán)境、化妝品、食品等領(lǐng)域[5]。研究表明，鼠李糖脂可改善肉雞的生長(zhǎng)性能和腸道絨毛形態(tài)，提高肉雞免疫功能，增加盲腸內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸含量，促進(jìn)腸道內(nèi)有益菌增殖[6]。然而鼠李糖脂作為抗生素替代品是否可以改善肉雞的肌肉品質(zhì)尚不清楚。

因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究鼠李糖脂作為抗生素替代品對(duì)肉雞腿肌肉品質(zhì)、常規(guī)化學(xué)成分、抗氧化能力以及抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響，以為鼠李糖脂在肉雞飼料中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金霉素和鼠李糖脂均由企業(yè)提供。

HunterLab CX0857色差儀，Hanna instruments, Inc. HI99121 pH計(jì)，Hanon-SOX406脂肪測(cè)定儀，華燁HYP-320消化爐，華燁KDN-103A自動(dòng)定氮儀，TM-2010陶瓷纖維馬弗爐，電熱恒溫干燥器，組織勻漿儀，全功能酶標(biāo)儀，Bio-Rad C1000 TouchTM96孔快速PCR儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)采取單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，將1日齡的愛(ài)拔益加(AA)公肉仔雞600只，隨機(jī)分為5組，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15只肉仔雞：空白對(duì)照飼喂基礎(chǔ)飼糧，基礎(chǔ)飼糧參考NRC(1994)營(yíng)養(yǎng)需要配制的配合飼料，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1；正對(duì)照組為抗生素添加組，飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加75 mg/kg金霉素的實(shí)驗(yàn)飼糧，實(shí)驗(yàn)組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中分別添加250、500、1 000 mg/kg鼠李糖脂的實(shí)驗(yàn)飼糧，實(shí)驗(yàn)期為42 d，其中1～21 d為前期，22～42 d為后期。實(shí)驗(yàn)在浙江惠嘉生物科技股份有限公司實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)前對(duì)雞舍進(jìn)行徹底清洗、消毒，實(shí)驗(yàn)采用單層平置式籠養(yǎng)，各籠組別和重復(fù)采用隨機(jī)抽取決定，24 h光照，保溫?zé)艄┡?，全程自由飲水與采食，免疫接種按照正常免疫程序進(jìn)行。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1

1.3 樣品采集

在實(shí)驗(yàn)42 d時(shí)，在5個(gè)組的8個(gè)重復(fù)中分別隨機(jī)抽取一只公雞，共40只，于采樣前空腹12 h，分別稱(chēng)質(zhì)量后，進(jìn)行屠宰采樣，其中左側(cè)腿肌肉稱(chēng)質(zhì)量后用于肉品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定，右側(cè)腿肌采集后進(jìn)行液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱待測(cè)。

1.4 肉雞腿肌質(zhì)量及肌肉品質(zhì)的測(cè)定

按照Bami等[7]的方法，分別測(cè)定腿肌質(zhì)量和肌肉肉色的亮度(L*值)、紅度(a*值)、黃度(b*值)、pH、滴水損失和蒸煮損失測(cè)定。

1.5 肉雞腿肌常規(guī)化學(xué)成分的測(cè)定

腿肌肉中水分、粗蛋白(CP)、粗脂肪(EE)和灰分含量分別參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB 5009.3—2016、GB 5009.4—2016、GB 5009.5—2016、GB 5009.6—2016)進(jìn)行測(cè)定。

1.6 肉雞腿肌抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

取0.17～0.20 g腿肌于2 mL勻漿管中，加入適量的勻漿珠和9倍體積預(yù)冷的生理鹽水，使用勻漿儀進(jìn)行勻漿，隨后4 000 r/min、4 ℃、離心10 min，取上清液分裝于離心管中用于抗氧化指標(biāo)的測(cè)定，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別測(cè)定上清液中總蛋白(TP)含量、丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活力、過(guò)氧化氫酶(CAT)活力和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)活力。

1.7 肉雞腿肌抗氧化基因mRNA的表達(dá)量

目的基因引物序列見(jiàn)表2。根據(jù)Xu等[8]描述的方法對(duì)核因子E2相關(guān)因子2(NF-E2-Related Factor 2，Nrf2)、血紅素加氧酶-1(Heme Oxygenase-1，HO-1)、Keap1、SOD1、SOD2、CAT、GPx和β-actin相關(guān)抗氧化基因進(jìn)行熒光定量PCR測(cè)定。

表2 目的基因引物序列

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2019軟件進(jìn)行初步整理，用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因子方差(one-way ANOVA)分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，并采用Duncan氏多重比較檢驗(yàn)，P<0.05為顯著性水平，0.05≤P<0.10為趨勢(shì)性水平。結(jié)果采用平均值和總標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中添加鼠李糖脂對(duì)肉雞腿肌質(zhì)量和肌肉品質(zhì)的影響

由表3可知，與空白對(duì)照組相比，飼糧添加250、500、1 000 mg/kg鼠李糖脂和抗生素均提高了肉雞的腿肌重，增加了肉雞腿肌24 h的pH，降低了肉雞腿肌24、48 h的滴水損失和蒸煮損失(P<0.05)。飼糧添加500、1 000 mg/kg鼠李糖脂和抗生素提高了肉雞腿肌45 min的pH(P<0.05)。此外，飼糧添加250、500、1 000 mg/kg鼠李糖脂降低了肉雞腿肌24 h的亮度值(P<0.05)。

表3 鼠李糖脂對(duì)肉雞腿肌質(zhì)量和肌肉品質(zhì)的影響

2.2 飼料中添加鼠李糖脂對(duì)肉雞腿肌常規(guī)化學(xué)成分的影響

據(jù)表4可知，飼料中添加500、1 000 mg/kg的鼠李糖脂組肉雞腿肌粗脂肪含量高于空白對(duì)照組(P<0.05)，腿肌水分、有機(jī)物、粗蛋白、灰分等含量在鼠李糖脂組、空白對(duì)照組和抗生素組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表4 鼠李糖脂對(duì)肉雞腿肌的常規(guī)化學(xué)成分含量的影響

2.3 飼料中添加鼠李糖脂對(duì)肉雞腿肌抗氧化性能的影響

據(jù)表5可知，飼糧添加250、500、1 000 mg/kg鼠李糖脂組和抗生素組的肉雞腿肌MDA含量顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，GPx活性顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，添加500、1 000 mg/kg的鼠李糖脂組肉雞腿肌T-SOD活性顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)；抗生素組和鼠李糖脂組間肉雞腿肌的T-AOC、T-SOD、GPx、CTA和MDA水平均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表5 鼠李糖脂對(duì)肉雞腿肌抗氧化能力的影響

2.4 飼料中添加鼠李糖脂對(duì)肉雞腿肌抗氧化基因表達(dá)量的影響

由表6可知，與空白對(duì)照組相比，飼糧添加250、500、1 000 mg/kg鼠李糖脂組和抗生素組肉雞腿肌SOD1和GPx基因表達(dá)量顯著提高(P<0.05)；鼠李糖脂添加量為500、1 000 mg/kg時(shí)，肉雞腿肌Nrf2和HO-1基因表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；飼糧鼠李糖脂添加量1 000 mg/kg時(shí)，肉雞腿肌SOD2基因表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；鼠李糖脂組與抗生素組間Nrf2、Keap1、HO-1、SOD1、SOD2、CAT和GPx等基因表達(dá)水平均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表6 鼠李糖脂對(duì)肉雞腿肌抗氧化基因的影響

3 討論

3.1 飼料中添加鼠李糖脂對(duì)肉雞腿肌重和肌肉品質(zhì)的影響

本實(shí)驗(yàn)顯示，飼料中添加250、500、1 000 mg/kg鼠李糖脂和抗生素均提高了肉雞腿肌質(zhì)量。這可能是由于鼠李糖脂具有良好的抗菌性能，添加于飼料中能夠改善肉雞腸道發(fā)育，提高肉雞免疫能力，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和利用有關(guān)[6]。肌肉pH不僅是肌肉酸度的直接表現(xiàn)，更是反映肌肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[7]。肉品質(zhì)的pH值下降程度取決于屠宰時(shí)肌肉所含的糖原數(shù)量和所受到的應(yīng)激程度[8]。剛屠宰的肉雞pH應(yīng)為6.0～7.0，約1 h后達(dá)到最低為5.4～5.6[9]。肌肉的肉色包括亮度(L*值)、紅度(a*值)和黃度(b*值)，亮度主要是受肌肉表面滲出水分的影響，水分滲出導(dǎo)致光反射增強(qiáng)，從而使亮度值升高[10]；蒸煮損失和滴水損失是指肌肉組織保持水分的能力，反映了肌肉蛋白質(zhì)凝膠的結(jié)構(gòu)和所帶凈電荷的變化情況[11]。與空白對(duì)照組相比，日糧中添加250、500、1 000 mg/kg鼠李糖脂和抗生素均增加了肉雞腿肌肉24 h的pH，降低了肉雞腿肌肉24、48 h的滴水損失和蒸煮損失；添加500、1 000 mg/kg的鼠李糖脂降低了肉雞腿肌肉24 h的L*值，屠宰45 min后肉雞腿肌肉的pH顯著升高，提示鼠李糖脂可能通過(guò)減少肌肉中乳酸的生成，從而提高肉雞腿肌的pH。鼠李糖脂添加組肉雞腿肌24、48 h的滴水損失和蒸煮損失的降低和24 h的L*值的升高，提示鼠李糖脂能夠提高肉雞腿肌的保水性能。本實(shí)驗(yàn)中鼠李糖脂組的效果與抗生素組的效果一致，鼠李糖脂可以作為潛在抗生素替代品，提高肉雞腿肌重和改善肌肉品質(zhì)。

3.2 飼料中添加鼠李糖脂對(duì)肉雞常規(guī)化學(xué)成分的影響

肉雞腿肌中的水分、有機(jī)物、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分等常規(guī)化學(xué)成分是評(píng)價(jià)肌肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)[12]。肌肉的紅度(a*值)主要取決于肌紅蛋白含量，其肌肉紅度值與粗蛋白的含量呈正相關(guān)關(guān)系，紅度值愈高，則粗蛋白含量愈高[13]。與空白對(duì)照組相比，添加500、1 000 mg/kg的鼠李糖脂組肉雞腿肌粗脂肪含量顯著升高，而腿肌粗蛋白含量無(wú)顯著性差異，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與肉品質(zhì)亮度值研究結(jié)果一致。腿肌肉中的水分、有機(jī)物、粗蛋白、粗脂肪和灰分的含量在鼠李糖脂組和抗生素組間無(wú)顯著性差異，說(shuō)明鼠李糖脂可作為抗生素替代品，改善腿肌常規(guī)化學(xué)成分。

3.3 飼料中添加鼠李糖脂對(duì)肉雞腿肌抗氧化性能的影響

肌肉良好的抗氧化性能是維持肌肉品質(zhì)的重要保障，肌間脂肪和蛋白質(zhì)的氧化會(huì)造成肉品質(zhì)下降[14]。MDA是主要的脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物，其含量通?？煞磻?yīng)機(jī)體的氧化程度，間接的反應(yīng)細(xì)胞受損傷[15]；GPx和T-SOD是機(jī)體主要的抗氧化酶，能清除機(jī)體內(nèi)超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷[16]。本實(shí)驗(yàn)顯示，與空白對(duì)照組相比，日糧中添加250、500、1 000 mg/kg鼠李糖脂和抗生素顯著提高了腿肌GPx活性，減少了肉雞腿肌MDA含量，當(dāng)添加500、1 000 mg/kg鼠李糖脂時(shí)，增加了腿肌T-SOD活性。

3.4 飼料中添加鼠李糖脂對(duì)肉雞抗氧化基因表達(dá)量的影響

Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[17]，可調(diào)控機(jī)體內(nèi)SOD、CAT、GPx和HO-1等的抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，日糧中添加250、500、1 000 mg/kg鼠李糖脂和抗生素顯著上調(diào)了腿肌GPx和SOD1基因的表達(dá)水平。當(dāng)添加量為500、1 000 mg/kg的鼠李糖脂時(shí)，上調(diào)了腿肌Nrf2和HO-1基因的表達(dá)水平。當(dāng)添加1 000 mg/kg的鼠李糖脂和抗生素時(shí)顯著上調(diào)了腿肌SOD2基因的表達(dá)水平。結(jié)果提示鼠李糖脂可能通過(guò)激活肉雞腿肌Nrf2信號(hào)，提高下游GPx和SOD基因的表達(dá)，改善抗氧化能力，這與本實(shí)驗(yàn)中抗氧化酶活結(jié)果一致。鼠李糖脂組與抗生素組肉雞腿肌抗氧化基因的表達(dá)量無(wú)顯著性差異，提示鼠李糖脂可以作為抗生素替代品，改善肉雞抗氧化功能。

4 結(jié)論

鼠李糖脂可作為抗生素替代品添加于肉雞飼料中，提高肉雞腿肌質(zhì)量和腿肌粗脂肪含量，改善肉雞腿肌肉品質(zhì)和抗氧化能力，提高腿肌Nrf2信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)。