黃 力, 楊 靜, 李滑滑, 洪 玲, 沈 娜, 曾奎杰

(湖南省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心；稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室，長沙 410201)

黃曲霉毒素是一類主要由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物， 其中AFB1毒性和危害最大，且熱穩(wěn)定好，268 ℃以上的高溫下才裂解。世界衛(wèi)生組織(WHO)癌癥研究機構(gòu)將黃曲霉毒素確定為1A類致癌物，具有致癌、致畸和引起肝臟損傷的作用[1，2]。糧食和油料作物中黃曲霉毒素的污染問題受到了廣泛關(guān)注，世界各個國家和地區(qū)均對其制定了限量標準[3，4]。因此，對糧食和油料作物中黃曲霉毒素進行準確檢測就顯得十分關(guān)鍵。

高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法適用于實驗室內(nèi)精確定量，但基于黃曲霉毒素樣品基質(zhì)復雜、含量低等問題，常需要進行樣品前處理使其富集純化。目前，免疫親和柱凈化處理其具有基質(zhì)干擾少、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點已得到廣泛的應用[5-8]，并且大部分實驗室對樣品中黃曲霉毒素檢測前處理時常采用手動凈化處理。隨著科技的進步，為了簡化前處理過程，提高檢測的自動化水平和檢測效率，一些學者已研制全自動親和純化儀、免疫磁珠-全自動凈化儀等前處理儀器應用于食品中真菌毒素的檢測[9-11]。針對國內(nèi)外文獻還沒有系統(tǒng)地對比研究這3種前處理方法測定糧油中黃曲霉毒素的凈化效果，本研究通過優(yōu)化色譜條件后，建立柱后光化學衍生-高效液相色譜法，從加標回收率、實樣檢測、檢測時長、操作步驟及凈化效果等多個角度考察了常規(guī)手動親和柱凈化、全自動親和柱凈化及免疫磁珠-全自動凈化3種前處理方法對糧油中黃曲霉毒素B1的殘留凈化效果的影響，以探討這3種前處理方法對糧油中黃曲霉毒素B1檢測的適用性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀，230 Volt, 50 Hz,8 Watt光衍生器，JJHZ-10免疫磁珠-全自動凈化儀，KY-APS-Ⅱ全自動親和純化儀。

黃曲霉毒素標準物質(zhì)(AFB1含量為1.083 μg/mL)、黃曲霉毒素B1免疫親和柱、黃曲霉毒素B1免疫磁珠試劑盒、乙腈、甲醇為色譜純、超純水由明澈-D24uv超純水機制備、稻谷、玉米、花生油質(zhì)控樣品(MRM0011)、氯化鈉為分析純、微纖維濾紙。

1.2 試樣制備及提取

采樣量需大于1 kg，稻谷去除雜質(zhì)，經(jīng)礱谷機去殼制得糙米，粉碎，過篩，使其粒徑小于2 mm孔徑實驗篩，混合均勻后縮分至100 g，儲于樣品瓶中備用。

稱取5 g試樣(精確到0.01 g)，加入1.0 g氯化鈉，于50 mL離心管中，加入25 mL 70%甲醇水溶液提取液，渦旋混勻，置搖床(200～300 r/min)劇烈振蕩20 min，在4 000 r/min離心5 min，取上清液備用。

1.3 常規(guī)手動親和柱凈化

取1.2上清液10 mL，加入20 mL蒸餾水稀釋于50 mL離心管中，渦旋混勻，再用微纖維濾紙過濾，并收集濾液，作為上樣液。

凈化過程：免疫親和柱平衡后，柱上面連接25 mL一次性注射器，準確移取15 mL上樣液，調(diào)節(jié)開關(guān)，使液體以1～2 d/s的速度流出；待液體排干后，用去離子水洗滌2次，每次10 mL ；待液體排干后，上樣1 mL甲醇，流速1 d/s，收集洗脫液，用水稀釋定量至2 mL，最后用0.22 μm微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶，用于液相分析。

1.4 全自動親和柱凈化

取1.2上清液10 mL，加入20 mL蒸餾水稀釋于50 mL離心管中，渦旋混勻，再用微纖維濾紙過濾，并收集濾液作為上樣液。

將親和柱與上樣管按照要求組合后，準確移入上樣液15 mL，啟動全自動親和凈化儀，等程序結(jié)束后，向收集管中加入1.0 mL純水，混合后用0.22 μm微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶用于液相分析。

1.5 免疫磁珠-全自動凈化

取1.2上清液1.0 mL，加入試劑盒的樣品孔(1孔位)中，將試劑盒放入免疫磁珠-自動凈化儀，啟動儀器，待自檢完成后，通過二維碼掃入凈化程序，運行程序。

程序結(jié)束后，向樣品孔(5孔位)加入0.5 mL純水，混合后用0.22 μm微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶，用于液相分析。

免疫磁珠試劑盒重復處理方法：將首次使用過的免疫磁珠試劑盒樣品孔(5孔位)吹干，準確移取0.5 mL甲醇，重新置于免疫磁珠-自動凈化儀進行使用。

1.6 優(yōu)化后液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse plus C18(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動相：64%水+18%甲醇+18%乙腈；流速：1.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣體積：100 μL；激發(fā)波長：360 nm；發(fā)射波長：440 nm。

1.7 標準溶液配制

取質(zhì)量濃度為1.083 μg/mL 黃曲霉毒素B1標準溶液，加入50%甲醇溶液，將其依次稀釋成質(zhì)量濃度為0.677、1.354、2.708、5.415、10.830、21.660ng/mL的黃曲霉毒素B1標準工作液。

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)化色譜條件

由于黃曲霉毒素在糧油中主要是以AFB1、AFB2、AFG1及AFG24種形式存在，并且黃曲霉毒素AFB1、AFG1在水溶液中易發(fā)生熒光淬滅，在進行高效液相色譜法測定前要衍生化處理。所以本研究采用柱后光化學衍生高效液相色譜法，可使AFB1、AFG1熒光強度大大提高，其方法還具有不需要特殊的化學試劑、衍生過程簡單、操作方便等優(yōu)點。

糧油提取物中化學成分復雜，因此本實驗對色譜柱、流動相配比進行了詳細的考察。本實驗考察了ZORBAX Eclipse plus C18(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)和ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm, 5.0 μm)對目標化合物分離效果的影響。結(jié)果表明，采用ZORBAX Eclipse plus C18和ZORBAX SB-C18[8]均能較好地分離糧油中AFB1、AFB2、AFG1及AFG24種形式的黃曲霉毒素，尤其是ZORBAX Eclipse plus C18能使AFB1目標化合物峰形更加的對稱，且能保證在流動相配比不同情況下，AFB1峰面積都能基本一致(見圖1)。因此本研究選擇ZORBAX Eclipse plus C18(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)分離AFB1。

本實驗考察了不同流動相配比(60%水+20%甲醇+20%乙腈、64%水+18%甲醇+18%乙腈、68%水+16%甲醇+16%乙腈)對目標化合物分離效果的影響(見圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，增加水相配比，可使4種形式的黃曲霉毒素分離的更開，但耗時更長。因此，結(jié)合目標化合物的分離度和保留時間，最終選擇流動相配比64%水+18%甲醇+18%乙腈。

注：a為60%水+20%甲醇+20%乙腈；b為64%水+18%甲醇+18%乙腈；c為68%水+16%甲醇+16%乙腈。圖1 采用不同流動相配比時黃曲霉毒素的色譜圖

2.2 線性關(guān)系、檢出限和定量限

以1.083 μg/mL 黃曲霉毒素B1標準溶液稀釋所得的黃曲霉毒素B1標準工作液( 0.677～21.660 ng/mL)，在確定的色譜條件下進行測定。以峰面積為縱坐標、質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線。實驗結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1含量在0.677～21.660 ng/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程：If=1.757c+0.037，其相關(guān)系數(shù)R2為0.999 97。在空白稻谷樣品中添加目標化合物，以3倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限(LOD)為0.029 μg/kg；以10倍的倍信噪比確定方法的定量限(LOQ)為0.097 μg/kg，完全能滿足糧食中黃曲霉毒素B1的測定需求。

2.3 準確性和重復性

選取不含黃曲霉毒素B1的稻谷樣品進行加標和重復性實驗，樣品中添加了不同質(zhì)量濃度的標準溶液(添加量相當于黃曲霉毒素B1含量5.0、10.0、20.0 μg/kg)后，放置60 min，使待測成分與樣品基體成分相互作用達到平衡，再應用3種前處理方法進行操作，其回收率和相對標準偏差結(jié)果見表1。3個濃度水平加標回收率為82.1%～99.2%，3次重復測定的相對標準偏差為0.2%～8.8%，符合一般痕量分析要求。與其他2種前處理測定結(jié)果相比較，全自動親和柱凈化的回收率偏低，3次重復測定的相對標準偏差偏大。

表1 稻谷中黃曲霉毒素B1的加標回收率及相對標準偏差(n=3)

2.4 實際樣品分析

選取1份花生油質(zhì)控樣品(MRM0011)、1份陽性稻谷樣品和1份陽性玉米樣品分別利用已建立光化學衍生-高效液相色譜分析方法對其所含黃曲霉毒素B1進行測定(見表2)。其中陽性稻谷樣品中黃曲霉毒素B1的色譜圖見圖2(常規(guī)手動親和柱凈化和全自動親和柱凈化最終稀釋倍數(shù)為2；免疫磁珠-全自動凈化最終稀釋倍數(shù)為5)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種前處理方法對糧油中黃曲霉毒素B1的測定均能達到較好的效果，常規(guī)手動親和柱凈化和免疫磁珠-全自動凈化的效果更加的明顯，其中免疫磁珠-全自動凈化可實現(xiàn)重復利用，且結(jié)果影響較小。

表2 3種前處理方法測得實際樣品中黃曲霉毒素B1的含量(n=3)

圖2 3種前處理方法對陽性稻谷樣品中黃曲霉毒素B1的色譜圖

2.5 3種前處理操作過程比較

本實驗從檢測時長、操作步驟及凈化效果考察了常規(guī)手動親和柱凈化、全自動親和柱凈化及免疫磁珠-全自動凈化3種前處理凈化方法。從檢測時長來看，因常規(guī)手動親和柱凈化需要單個手動操作，每一個樣品凈化時長約30 min；全自動親和柱凈化采用全自動親和純化儀，引入自動進樣器，可實現(xiàn)30 min內(nèi)凈化約15個樣品；免疫磁珠-全自動凈化采用免疫磁珠試劑盒，同時處理10個樣品能在30 min內(nèi)凈化完成。從操作步驟來看，常規(guī)手動親和柱凈化和全自動親和柱凈化兩者的操作步驟依次都是經(jīng)過樣品提取、稀釋、上樣、洗滌和洗脫，免疫磁珠-全自動凈化是將樣品中真菌毒素提取后，直接準確加入提取的上清液，二維碼掃描導入或調(diào)用程序，一鍵式操作。常規(guī)手動親和柱凈化和全自動親和柱凈化兩種前處理方法為了防止堵塞親和柱，都需對提取的樣液進行稀釋、微纖維濾紙預過濾處理，從而使其操作步驟繁瑣。從凈化效果來看，常規(guī)手動親和柱凈化在空白稻谷基質(zhì)條件下加標3梯度回收率范圍在95.4%～99.2%，全自動親和柱凈化為82.1%～89.9%，免疫磁珠-全自動凈化首次使用為92.6%～96.5%，免疫磁珠-全自動凈化重復使用為90.8%～93.3%，這與實際樣品分析結(jié)果一致?？梢?，全自動親和柱凈化效果低于另外2種前處理方法，其原因可能是與全自動親和純化儀在上樣流速、氣推次數(shù)等因素設(shè)定不當影響到凈化效果[9]。但總的來說，3種前處理方法對糧油中黃曲霉毒素B1的測定均能達到較好的效果，常規(guī)手動親和柱凈化和免疫磁珠-全自動凈化的效果更加的明顯，其中免疫磁珠-全自動凈化還實現(xiàn)了重復利用，且耗時最短。

3 結(jié)論

本研究建立了以甲醇+水(70∶30)為提取液，以常規(guī)手動親和柱凈化、全自動親和柱凈化及免疫磁珠-全自動凈化3種前處理凈化手段，光化學衍生-高效液相色譜為檢測儀器的黃曲霉毒素B1的檢測方法。從實驗結(jié)果來看，3種前處理凈化手段均適合糧油中黃曲霉毒素B1的樣品前處理，但免疫磁珠-全自動凈化更能突顯其優(yōu)勢，該方法快速簡便、定量準確、可實現(xiàn)重復利用，可以廣泛用于糧油中黃曲霉毒素B1的檢測。