吉玉玉，曾慶飛，王海瑾，王佳楚函，歐二綾，韋興迪，韋 鑫，龍忠富

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，貴陽(yáng) 550006；2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550006)

中國(guó)是世界上喀斯特地貌分布最廣的國(guó)家之一，大陸上裸露、半裸露及埋于地下的碳酸鹽巖分布面積約占全國(guó)總面積的三分之一，是我國(guó)亟需治理的生態(tài)脆弱區(qū)之一。

貴州省地處中國(guó)西部山區(qū)高原與東部丘陵平原之間的過(guò)渡區(qū)域，屬于典型的喀斯特地貌[3]，是中國(guó)西南地區(qū)喀斯特面積最大、生態(tài)環(huán)境最復(fù)雜的省份[4]。研究表明，加快草地建設(shè)是喀斯特地區(qū)解決生態(tài)退化的有效途徑[1]?？λ固氐貐^(qū)石漠化的本質(zhì)是土壤退化，氮素大量流失，植被恢復(fù)慢。豆科植物作為世界重要的飼草種類(lèi)之一，在改善土壤理化性質(zhì)、提高土壤肥力等方面也占據(jù)重要地位，還可作為先鋒植物為其他植物定居提供必要生長(zhǎng)條件，被廣泛用于生態(tài)恢復(fù)與重建[2]。豆科牧草野生葛藤(Puerarialobota)作為一種優(yōu)良的水土保持植物、飼草植物和藥用植物種質(zhì)資源，在貴州境內(nèi)廣為分布[5]，具有生長(zhǎng)迅速、根深葉茂、固氮增肥、改良土質(zhì)等優(yōu)良特性[6]。

根瘤菌-豆科植物共生固氮系統(tǒng)是生物固氮的主要體系。葛藤以結(jié)瘤數(shù)高、固氮率高、固氮量多[7]等優(yōu)勢(shì)改善石漠化地區(qū)土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力[8]，用于荒山、荒灘改造和石漠化治理[9]，在修復(fù)污染退化土壤和植被生態(tài)的恢復(fù)等方面發(fā)揮巨大的作用[10-11]。目前國(guó)內(nèi)針對(duì)葛藤根瘤菌的研究多集中在其遺傳系統(tǒng)多樣性上，如謝徽[12]探討了四川攀枝花地區(qū)葛藤根瘤菌的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育地位；陳強(qiáng)等[13]證明了23株四川葛藤屬根瘤菌的遺傳特性存在明顯差異；魏世清[14]深入研究了葛藤根瘤菌的耐酸性等。貴州省內(nèi)關(guān)于葛藤主要集中在其作為飼用植物資源方面的研究[15]，而針對(duì)環(huán)境特殊且資源豐富的貴州野生葛藤共生根瘤菌的研究還很缺乏[16]。

本研究利用采自貴州省不同生態(tài)功能區(qū)域的野生葛藤根瘤菌進(jìn)行序列比對(duì)以及區(qū)系分析，并通過(guò)盆栽實(shí)驗(yàn)篩選出結(jié)瘤數(shù)多、固氮力強(qiáng)與促生效果優(yōu)良的根瘤菌株，為貴州喀斯特地區(qū)植被恢復(fù)提供優(yōu)異種質(zhì)資源，為石漠化治理提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)域與材料

1.1.1采集區(qū)域

樣品采集于貴州省16個(gè)縣(市)，遍布5個(gè)不同生態(tài)功能區(qū)[17]，不同生態(tài)區(qū)、采集地點(diǎn)及樣品編號(hào)見(jiàn)表1。共采集到25份野生葛藤根瘤樣品。

表1 樣品編號(hào)及采集地點(diǎn)概況

1.1.2實(shí)驗(yàn)材料

百脈根“歌德”種子購(gòu)于貴州省某園林綠化公司；細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)于北京百泰克生物技術(shù)有限公司；

1.1.3培養(yǎng)基

本試驗(yàn)對(duì)酵母甘露醇瓊脂(YMA)培養(yǎng)基進(jìn)行了改良，改良后的YMA液體培養(yǎng)基為：甘露醇10 g，MgSO40.2 g，K2HPO40.25 g，KH2PO40.25 g，CaSO40.2 g，NaCl 0.1 g，酵母粉1 g，適量蒸餾水混合后，加配制好的Na2MoO4(1%)、MnSO4(1%)、檸檬酸鐵(1%)各1 mL，定容至1 000 mL，pH 7.0～7.2。

分離純化所用固體培養(yǎng)基則是在改良YMA液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入瓊脂粉16～18 g，剛果紅(1%)2.5 mL混勻。

1.2 樣品處理及分離純化

樣品處理：沖洗葛藤根瘤樣品后無(wú)菌水浸泡過(guò)夜。挑選20～25顆單個(gè)根瘤依次用95%酒精、0.1% HgCl2浸泡5 min。

菌株分離：超凈工作臺(tái)內(nèi)取無(wú)菌水沖洗過(guò)的單個(gè)根瘤，于1 mL無(wú)菌水的研缽中研磨成懸濁液，涂布于YMA平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d，待出菌后每天觀察。

菌株純化：挑取單個(gè)菌落接種于新平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)直至形成單菌落，重復(fù)2～3次，染色鏡檢(革蘭氏染色試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司)，獲得純化菌株。

菌株保存：純化菌株接種至YMA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min 培養(yǎng)5～7 d后，30%甘油保種，-80 ℃凍存。

1.3 種類(lèi)鑒定及區(qū)系分析

1.3.1形態(tài)學(xué)鑒定

鏡檢為紅色的革蘭氏陰性(G-)菌株，參照《微生物分類(lèi)學(xué)》中鑒定方法[18]，觀察菌體形態(tài)特征。

1.3.2菌株16 S rRNA基因序列分析

細(xì)菌基因組試劑盒提取菌株總DNA，各菌株16 S rDNA采用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)變性、變性、退火、延伸的條件分別為：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s；54 ℃、1 min，72 ℃、2 min，35個(gè)循環(huán)；PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后純化回收后送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序完成后，利用NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)、BLAST同源性比對(duì)，DNAMAN分析軟件多重比對(duì)，最終結(jié)合菌體形態(tài)鑒定結(jié)果，確定各菌株的種屬分類(lèi)地位。

1.3.3區(qū)系分析

根據(jù)種類(lèi)鑒定結(jié)果，系統(tǒng)分析調(diào)查區(qū)域內(nèi)葛藤根瘤菌的種類(lèi)及分布情況。分布頻率采用相對(duì)頻率和發(fā)生頻率分別計(jì)算，計(jì)算公式：

相對(duì)頻率(%)=(有某菌種發(fā)生的樣品數(shù)/有菌種發(fā)生的總樣品數(shù))×100%；

發(fā)生頻率(%)=(有某菌種發(fā)生的菌株數(shù)/鑒定出的菌株總數(shù))×100%。

1.4 根瘤菌株的盆栽回接篩選

1.4.1供試菌株

根瘤菌株的代謝功能特性因地理環(huán)境與種類(lèi)不同而有所差異[19]，又因回接篩選實(shí)驗(yàn)工作量較大，故供試菌株選擇了不同地域、不同種類(lèi)的具代表性的葛藤根瘤菌。

1.4.2盆栽回接方法

種子消毒：百脈根種子依次用酒精(75%)、次氯酸鈉(3%)浸泡2 min、10 min。

菌液培養(yǎng)：供試菌株活化培養(yǎng)后，接種于YMA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min，培養(yǎng)5～7 d。

盆栽播種：在盛有滅菌珍珠石的花缽內(nèi)播下種子，室溫25 ℃、光照16 h/d培養(yǎng)。種子發(fā)芽長(zhǎng)出幼苗后澆入Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液(上海國(guó)藥)，3周后每盆保留10株幼苗用于菌液回接處理。

回接處理：以只澆灌無(wú)菌YMA液體培養(yǎng)基的花盆為空白對(duì)照(ck)，每3盆菌液回接(50 mL/盆)的花盆為1個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。每隔1 d向花缽基質(zhì)中澆灌少量的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，僅保持基質(zhì)濕潤(rùn)即可。菌液回接70 d、盆栽生長(zhǎng)100 d后取出盆內(nèi)植株，用于回接效果測(cè)定。

1.4.3測(cè)定植株結(jié)瘤數(shù)及地上、地下生物量

隨機(jī)選取每一處理、每一重復(fù)中的3個(gè)百脈根植株，空白對(duì)照選取1株，共計(jì)10株。

統(tǒng)計(jì)并計(jì)算總瘤數(shù)及單株瘤數(shù)的平均值；分離地上部分和地下根系，于烘箱中105 ℃殺青30 min，降至65 ℃烘干至恒重，計(jì)算單株的地上和地下生物量的平均值。

1.4.4數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件整理數(shù)據(jù)，LSD法進(jìn)行多重比較，SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征

經(jīng)分離純化和革蘭氏染色鑒定，25份根瘤樣品共獲得53個(gè)(G-)純化菌株。參照《微生物分類(lèi)學(xué)》[18]，通過(guò)對(duì)菌體形態(tài)進(jìn)行顯微觀察，發(fā)現(xiàn)符合根瘤菌的基本形態(tài)特征。

2.2 根瘤菌株的種類(lèi)鑒定

按照1.3.2的方法，53個(gè)G-菌株的總DNA均形成23 kb左右的條帶以及擴(kuò)增約1.5 kb的序列片段。如表2所示，通過(guò)菌體形態(tài)特征以及16 S rDNA序列比對(duì)，共鑒定出共生根瘤菌39株，根瘤內(nèi)生細(xì)菌14株。

表2 葛藤根瘤菌株種類(lèi)鑒定結(jié)果

2.3 區(qū)系分析結(jié)果

如表3所示，53株野生葛藤根瘤菌分屬于7個(gè)屬17個(gè)種。7個(gè)屬分別為：根瘤菌屬(Rhizobium)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、草螺菌屬(Herbaspirillum)和假單胞菌屬(pseudomonas)。其中慢生根瘤菌屬和假單胞菌屬的分布頻率最高，同時(shí)達(dá)24.39%，為優(yōu)勢(shì)屬；在17個(gè)種中，根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)兩個(gè)種的發(fā)生頻率相對(duì)較高，分別達(dá)14.63%和12.20%，為優(yōu)勢(shì)種。

表3 葛藤根瘤菌株區(qū)系分析結(jié)果

表4展示了5個(gè)生態(tài)功能區(qū)葛藤根瘤菌的分類(lèi)及種屬分布結(jié)果。結(jié)果表明，南部干熱河谷南亞熱帶季雨林生態(tài)區(qū)中鑒定出Rhizobium、Bradyrhizobium、Burkholderia、Sinorhizobium、Agrobacterium和Pseudomonas6屬中的11個(gè)種，種類(lèi)最多；其次是鑒定出Rhizobium、Bradyrhizobium、Agrobacterium和Pseudomonas4屬中10個(gè)種的東部濕潤(rùn)亞熱帶常綠闊葉林生態(tài)區(qū)；而中部濕潤(rùn)亞熱帶喀斯特脆弱生態(tài)區(qū)和北部濕潤(rùn)亞熱帶常綠闊葉林生態(tài)區(qū)都只鑒定出Rhizobium和Herbaspirillum2個(gè)屬中的2個(gè)種；西部半濕潤(rùn)亞熱帶針闊混交林、草山喀斯特脆弱環(huán)境生態(tài)區(qū)僅鑒定出Pseudomonas中的1個(gè)種。

表4 研究區(qū)野生葛藤根瘤菌種屬分布特征

2.4 共生結(jié)瘤固氮高效根瘤菌株的篩選

2.4.1供試菌株

選用22株來(lái)自不同地域和不同種類(lèi)葛藤根瘤菌用于百脈根幼苗的盆栽回接篩選實(shí)驗(yàn)。分別為：CZPR 19-1、CDPR 21-2、WMPR 27-2、LDPR 38-1、PKPR 45-1、LJPR 58-1、LXPR 59-2、SZPR 64-2、SZPR 66-1、SZPR 66-2、ZFPR 85-1、CLPR 294-1、CLPR 294-2、ZPPR 297-2、ZPPR 297-5、LGPR 299-2、LDPR 303-2、LGPR 306-2、TQPR 308-2、LLPR 327-1、DXPR 447-4、DMPR 453-1。

2.4.2葛藤根瘤菌株對(duì)百脈根共生結(jié)瘤及促生效果的影響

菌液回接70 d后，百脈根植株的相關(guān)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明，與ck相比，22個(gè)菌株回接后對(duì)幼苗共生結(jié)瘤和生長(zhǎng)均有不同程度的促進(jìn)作用。單株平均根瘤數(shù)在11～56個(gè)之間。結(jié)果顯示，14個(gè)菌株(CZPR 19-1；CDPR 21-2；WMPR 27-2；LDPR 38-1；PKPR 45-1；LXPR 59-2；SZPR 64-2；SZPR 66-1；ZFPR 85-1；CLPR 294-2；ZPPR 297-5；LGPR 299-2；LDPR 303-2；DXPR 447-4)的結(jié)瘤促生效果較好，與其余菌株差異顯著，為優(yōu)良固氮菌株。其中分離自荔波縣駕歐鄉(xiāng)的LJPR 58-1的結(jié)瘤數(shù)和促生效應(yīng)與其余13個(gè)優(yōu)良菌株差異顯著，與另外8個(gè)供試菌株的差異達(dá)極顯著水平，為最優(yōu)固氮根瘤菌株。

表5 百脈根盆栽回接篩選試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

3 討 論

當(dāng)前，葛藤在中國(guó)有17個(gè)種和2個(gè)變種，亦有部分研究學(xué)者認(rèn)為在國(guó)內(nèi)有18個(gè)種[20]，除新疆、西藏外，廣泛分布于全國(guó)各省區(qū)[21]。貴州葛藤資源(1991—1995年)調(diào)查結(jié)果表明貴州省內(nèi)存在10個(gè)種。作為全國(guó)葛藤資源集中分布的主要地區(qū)之一[22]，貴州省內(nèi)關(guān)于野生葛藤共生根瘤菌的研究較少。

貴州境內(nèi)葛藤根瘤菌區(qū)系分析發(fā)現(xiàn)，5個(gè)不同生態(tài)區(qū)的根瘤菌屬、種數(shù)量各異，但每一個(gè)功能區(qū)中都存在根瘤菌屬或假單胞菌屬。已有的研究報(bào)道表明，與葛藤識(shí)別共生的根瘤菌存在著一定的優(yōu)勢(shì)種類(lèi)，發(fā)現(xiàn)較多的是慢生根瘤菌屬，同時(shí)也有根瘤菌屬的報(bào)道[23-24]；在不同地區(qū)調(diào)查，葛藤根瘤菌均存在遺傳多樣性，在地理分布上，也均具有明顯的生物學(xué)分布格局[25-27]。

本研究結(jié)果與已報(bào)道的研究結(jié)論有相似之處，慢生根瘤菌屬是能與葛藤識(shí)別并共生的優(yōu)勢(shì)種類(lèi)，但本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬中的部分種類(lèi)也是與葛藤共生的優(yōu)勢(shì)種類(lèi)，體現(xiàn)了貴州喀斯特地區(qū)的葛藤屬根瘤菌資源存在著區(qū)域性的豐富性與特異性。進(jìn)一步說(shuō)明，與同一種豆科植物共生的根瘤菌資源，在不同的地區(qū)、不同的環(huán)境下均存在不同的優(yōu)勢(shì)種類(lèi)，而根瘤菌在特定的生態(tài)地理環(huán)境下針對(duì)生物學(xué)地理分布、共生匹配效率與遺傳多樣性又會(huì)有顯著的差異。因此，生態(tài)地理環(huán)境對(duì)共生根瘤菌資源的多樣性具有重要的影響[28]。豐富多樣的生態(tài)環(huán)境、不同的地理生態(tài)條件均會(huì)致使不同種類(lèi)的根瘤菌與葛屬植物共生結(jié)瘤，貴州作為喀斯特地區(qū)面積最大、生態(tài)環(huán)境最復(fù)雜的省份，從而導(dǎo)致了貴州喀斯特地區(qū)葛藤根瘤菌區(qū)域性的多樣性，為貴州喀斯特地區(qū)石漠化治理提供葛藤這一豆科植物的優(yōu)異種質(zhì)資源，應(yīng)用于生態(tài)恢復(fù)。

4 結(jié) 論

貴州巖溶山區(qū)廣為分布的野生葛藤，作為一種既有飼用價(jià)值又有生態(tài)環(huán)境修復(fù)潛力的多年生豆科藤本植物，具有豐富的共生根瘤菌資源。貴州葛藤根瘤菌主要包括根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬、伯克氏菌屬、中華根瘤菌屬、土壤桿菌屬、草螺菌屬和假單胞菌屬7個(gè)屬的17個(gè)種，其中優(yōu)勢(shì)屬為慢生根瘤菌屬和假單胞菌屬，優(yōu)勢(shì)種為豆根瘤菌和根癌土壤桿菌。在采樣涉及的5個(gè)不同生態(tài)功能區(qū)域中，每一區(qū)域除了都包含有慢生根瘤菌屬或者假單胞菌屬的根瘤菌以外，種屬數(shù)量和區(qū)系分布特征另外還存在著明顯的差異性，證明生態(tài)地理環(huán)境對(duì)葛藤根瘤菌的種類(lèi)分布和多樣性有著直接的影響。

本研究根據(jù)共生結(jié)瘤數(shù)、宿主植物地上部干重和地下部干重的影響效應(yīng)三項(xiàng)指標(biāo)，篩選獲得了14株共生結(jié)瘤促生效果良好的根瘤菌，其中菌株LJPR 58-1被鑒定為優(yōu)良菌株中的最優(yōu)固氮根瘤菌，具有開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力。篩選結(jié)果說(shuō)明，共生結(jié)瘤率極強(qiáng)的貴州野生葛藤蘊(yùn)藏著豐富的優(yōu)良抗逆根瘤菌資源，篩選出的優(yōu)良菌株與葛藤和百脈根形成的優(yōu)勢(shì)固氮共生體系能有效應(yīng)用于貴州巖溶山區(qū)草地生態(tài)畜牧和喀斯特環(huán)境修復(fù)的生產(chǎn)實(shí)際。