基于OPG/RANKL信號軸探討二至丸治療絕經后骨質疏松的作用機制

姜宜妮 梁健 劉江源 伍慶華 閔建新

摘要 目的：探討二至丸治療絕經后骨質疏松模型鼠的作用機制。方法：將108只雌性SD鼠隨機分為假手術（Sham）組、模型（PMOP）組、雌激素治療（E2）組、二至丸低劑量治療（EZW-L）組、二至丸中劑量治療（EZW-M）組、二至丸高劑量治療（EZW-H）組，每組18只。E2組接受E2針劑皮下注射，EZW-L組、EZW-M組、EZW-H組分別予以6 g/kg、9 g/kg、12 g/kg混懸液灌胃，Sham組與PMOP組均予以1 mL生理鹽水灌胃，均干預12周。檢測各組大鼠右側股骨頭骨密度（BMD）、股骨生物力學/病理變化以及骨代謝血清標志物BALP、TRACP-5b、Cath-K、OPG、RANK、RANKL的水平變化。結果：藥物干預12周后，與PMOP組比較，EZW-M組、E2組、EZW-H組的BMD、彈性模量、最大載荷、BV/TV、Tb.Th、Joint、血清骨代謝標志物BALP、TRACP-5b、Cath-K的蛋白表達均顯著增高（均P<0.05），FLAW顯著降低（P<0.05）;HE染色顯示PMOP組骨組織出現明顯病理改變，E2組和EZW-H組疏松病理現象改善明顯。POMP組、EZW-L組、EZW-M組股骨中OPG蛋白含量較Sham組、E2組、EZW-H組明顯下降;RANK、RANKL蛋白含量升高。與PMOP組比較，EZW-M組的OPG/RANKL比值顯著增高（P<0.05），RANK/RANKL比值顯著降低（P<0.05），E2組、EZW-H組的OPG/RANKL比值顯著增高（P<0.01），E2組、EZW-H組的RANK/RANKL比值顯著降低（P<0.01）。結論：二至丸可改善骨質疏松，其作用機制可能是OPG骨保護素重組蛋白/核因子κB受體激活物配體/RANKL信號軸抑制破骨細胞成熟分化實現的。

關鍵詞 骨質疏松;絕經后;二至丸;生物力學;病理改變;機制;骨保護素重組蛋白;核因子κB受體激活物配體

Abstract Objective：To explore the mechanism of Erzhi Pills in the treatment of postmenopausal osteoporosis model rats.Methods：A total of 108 female SD rats were randomly divided into a sham operation（Sham） group，a model（PMOP） group，an estrogen treatment group（E2），an Erzhi Pill low dose treatment group（EZW-L），an Erzhi Pill medium dose treatment group（EZW-M） and an Erzhi Pill high dose treatment group（EZW-H），with 18 rats in each group.Group E2 received subcutaneous injection of E2.Group EZW-L，group EZW-M and group EZW-H were given intragastric administration of 6g/kg，9g/kg and 12 g/kg suspension respectively.group Sham and group PMOP were given intragastric administration of 1ml normal saline for 12 weeks.The bone mineral density（BMD） of right femoral head，biomechanical/pathological changes of femur and the levels of serum markers of bone metabolism，such as BALP，TRACP-5b，Cath-K，OPG，RANK and RANKL，were measured in each group.Results：After 12 weeks of drug intervention，the protein expressions of BMD，elastic modulus，maximum load，BV/TV，Tb.Th，Joint，serum bone metabolic markers BALP，TRACP-5b and BCath-K in EZW-M group，E2 group and EZW-H group were significantly higher than those in EZW-H group（Ps<0.05），and FLAW significantly lower（P<0.05）.HE staining showed that there were obvious pathological changes in bone tissue in PMOP group，and the above-mentioned loose pathological phenomena were significantly improved in E2 group and EZW-H group.The content of OPG protein in femur of POMP group，EZW-L group and EZW-M group was significantly lower than that of Sham group，E2 group and EZW-H group，while the content of RANK and RANKL protein was increased.Comparing with PMOP group，OPG/RANKL ratio in EZW-M group was significantly higher（P<0.05）; RANK/RANKL ratio was significantly lower（P<0.05）; OPG/RANKL ratio in E2 group and EZW-H group was significantly higher（P<0.01）; and RANK/RANKL ratio in E2 group and EZW-H group was significantly lower（P<0.01）.Conclusion：Erzhi Pill can improve osteoporosis，and its mechanism may be related to the inhibition of osteoclast maturation and differentiation by OPG/RANK/RANKL signal axis.

Keywords Osteoporosis; Postmenopausal; Erzhi Pill; Biomechanics; Pathological changes; Mechanism; OPG; RANKL

中圖分類號：R289.5;R274.9文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.01.016

絕經后骨質疏松癥（Postmenopausal Osteoporosis，PMOP）是指絕經后女性的卵巢功能衰退、內分泌失調、雌激素水平下降，導致成骨細胞的骨形成低于破骨細胞的骨吸收，造成骨組織微結構破壞，骨小梁排列紊亂，使得骨密度下降、骨脆性增加，易于發(fā)生骨折，嚴重影響中老年女性的生命質量[1]。目前研究認為，骨保護素重組蛋白（Osteoprotegerin，OPG）/核因子κB受體激活物配體（NF-κB Receptor Activator Ligand，RANKL）信號軸是參與調節(jié)骨吸收與骨生成平衡的重要途徑，其在雌激素治療PMOP中起著舉足輕重的作用[2]，然而雌激素的不良反應令人擔憂[3-4]，因此尋找一種安全有效的防治方法迫在眉睫。PMOP屬中醫(yī)學中“骨痿”“骨枯”等的范疇，主要病因病機為腎精虧虛、骨髓生化乏源。補腎陰經典方二至丸（女貞子、墨旱蓮）具有滋腎陰、益精血之效，可抑制骨量減少、改善骨微結構的改變，增強骨強度和生物力學強度[5-6]，不僅能夠預防PMOP的發(fā)生發(fā)展，而且能夠改善PMOP臨床癥狀[7-8]，但機制未明。為此，本研究建立絕經后骨質疏松大鼠模型，觀察二至丸對骨代謝的影響與OPG/RANKL信號軸的相關性，探討二至丸改善絕經后骨質疏松的分子機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用SPF級20周齡SD雌性大鼠，體質量（320±20）g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[許可證號碼：SCXX（滬）2007-0005]提供，動物實驗在江西中醫(yī)藥大學動物實驗中心進行[許可證號為：SYXK（閩）2005-004]。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（25±2）℃，濕度（50±1）%，晝夜12 h/12 h交替。實驗過程中，實驗大鼠可自由進食和飲水。實驗經江西中醫(yī)藥大學動物管理制度和使用委員會批準而進行，并嚴格按照科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》中的動物倫理學標準處理動物。

1.1.2 藥物 二至丸（500粒/瓶，雷允上藥業(yè)有限公司，國藥準字Z32020882）。懸濁液制備：以成人臨床用藥劑量按照人和動物等效劑量換算公式計算動物用藥劑量，用0.9%生理鹽水將二至丸配制成90 mg/mL的混懸液，4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑與儀器 雌二醇（E2）針劑（100 μg/支，武漢峰耀同輝化學制品有限公司，國藥準字Z38922），戊巴比妥鈉（廣州沛瑜生物制品有限公司，批號：2930-2），OPG一抗抗體（貨號：68495S）、RANK一抗抗體（貨號：4816S）、RANKL一抗抗體（貨號：5312SC）、β-actin一抗抗體（貨號：4870t）均購于美國CST公司，BALP ELISA試劑盒（上?？祈樕锕こ逃邢薰?，貨號：KS15752）、TRACP-5b ELISA試劑盒（南京森貝伽生物工程有限公司，貨號：SBJ-R0426）、Cath-KELISA試劑盒（上海江萊生物工程有限公司，貨號：JL11782）;雙能X線BMD儀（奧斯托公司，韓國，型號：EXA-3000），轉膜系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國，型號：1704150），臺式低溫高速離心機（BECKMAN公司，美國，型號：X22），酶標自動分析儀（biotek公司，美國，型號：ELx800），精密電子萬能材料試驗機（大邁儀器有限公司，型號：AG-IS），微計算機斷層掃描設備（Micro-CT，BRUKER microCT公司，美國，型號：SKY SCAN-1172）等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 運用隨機數字表法將108只SD大鼠隨機分為2組：其中，18只假手術組，90只手術組。假手術組不切除卵巢，手術組進行PMOP造模。PMOP模型的制備：手術組大鼠用戊巴比妥鈉（10 g/L）按照3 mg/kg劑量進行腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉后分別從雙側背部切開進入腹腔，依次摘除雙側卵巢，止血縫合切口。75%乙醇消毒切口，注射用慶大霉素液涂擦術口防治感染，連續(xù)3 d。Sham組大鼠不切除卵巢，而是切除附在卵巢旁邊的一塊脂肪，大小與卵巢相仿，余過程同造模組。造模后7 d，再將手術組大鼠應用隨機數字表隨機分為模型（PMOP）組、雌激素治療（E2）組、二至丸低劑量治療（EZW-L）組、二至丸中劑量治療（EZW-M）組、二至丸高劑量治療（EZW-H）組，每組18只。

1.2.2 給藥方法 Sham組：造模術后7 d，使用0.9%生理鹽水灌胃（1 mL/100 g），1次/d，連續(xù)12周，同時進行正常的飲食以及活動，不做治療處理。PMOP組：造模術后7 d，使用生理鹽水灌胃（1 mL/100 g），1次/d，連續(xù)12周，同時進行正常的飲食以及活動，不做治療處理。E2組：造模術后7 d，用E2針劑皮下注射（200 μg/kg），2次/周，治療12周，同時進行正常的飲食以及活動。EZW-L組：造模術后7 d，二至丸混懸液（6 g/1 kg）灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃12周，同時進行正常的飲食以及活動。EZW-M組：造模術后7 d，二至丸混懸液（9 g/1 kg）灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃12周，同時進行正常的飲食以及活動。EZW-H組：造模術后7 d，二至丸混懸液（12 g/1 kg）灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃12周，同時進行正常的飲食以及活動。

1.2.3 檢測指標與方法 1）骨密度檢測：分別取6組大鼠右側股骨，應用DiscoveryWi雙能X線骨密度儀檢測右側股骨頭骨密度（Bone Mineral Density，BMD）。2）生物力學檢測：應用三點彎曲試驗檢測股骨生物力學情況。采用AGS-J系列精密電子萬能材料試驗機檢測最大載荷和彈性模量。具體方法：將檢測完BMD的股骨頭凹面朝下，股骨頭端朝前的位置放置于跨距為17 mm的2個支撐點上，壓頭大概在股骨長度中間位置的正上方給標本施加向下10 mm/min的載荷，直至股骨斷裂，股骨斷裂前所能承受的最大力為最大載荷，股骨斷裂時所承受的力為斷裂載荷。3）組織學檢測：取6組大鼠右側股骨頭進行常規(guī)固定、脫水、包埋、切片后，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察骨組織形態(tài)結構的變化。4）骨小梁檢測：采用micro CT對各組大鼠右側股骨進行骨組織形態(tài)掃描，由股骨近心端骨骺線消失處開始掃描，直至股骨遠心端，掃描厚度10 μm，共掃描70層。應用全自動圖像數字化分析儀對所得圖片分析處理，記錄骨小梁骨體積分數（Bone Volume/Tissue Volume，BV/TV）、骨小梁表面密積度（Trabecular Thickness，Tb.Th）、骨小梁平均間距（Trabecular Separation）、骨小梁數、成骨細胞指數（Osteoblast Index，OBI，個/mm）、礦化沉積率（MAR）、礦化延遲時間（MLT）、骨形成率（BFR）。5）骨代謝標志物血清含量檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）法檢測血清中BALP、TRACP-5b、Cath-K含量，具體檢測方法按照ELISA試劑盒說明書進行。6）OPG/RANK/RANKL信號軸檢測：采用蛋白質免疫印跡法（Western Blotting）檢測骨組織中OPG、RANK、RANKL的蛋白含量。將各組大鼠充分麻醉后處死，于冰上快速取出右側股骨。200 mg大鼠股骨組織加入l mL PMSF，勻漿30 min，將樣本置于4 ℃，5 000 r/min，離心半徑10 cm條件下離心20 min，取上清液（總蛋白溶液）。檢測蛋白濃度（DAB方法），蛋白變性。以50 μg蛋白量為上樣標準計算上樣量。電泳（12%分離膠，5%濃縮膠，60 V，40 mA，2.0 h），轉膜（120 V，250 mA，30～60 min），封閉（5%脫脂奶粉）2 h，分別加入OPG、RANK、RANKL和β-actin一抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，加入堿性磷酸酶標記山羊抗兔IgG（1∶2 000）室溫孵育2 h。上述每一過程均用TBS洗3次，5 min/次。加入顯色液15～30 min，計算機掃描圖像，采用Model Gel Doc 2000型生物圖像分析系統(tǒng)處理所得數據信息。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對結果進行數據分析。所有結果均選擇3個或3個以上數據，以均數±標準差（±s）表示，數據符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析。數據不符合正態(tài)分布，采用非參數檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 6組大鼠骨密度比較 藥物干預12周后，與Sham組比較，PMOP組、EZW-L組、EZW-M組、EZW-H組股骨BMD極顯著降低（均P<0.01）;與Sham組比較，E2組股骨BMD顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，EZW-M組BMD增高（P<0.05），E2組、EZW-H組的BMD極顯著增高（P<0.01）。見表1。

2.2 6組大鼠彈性模量、最大載荷比較 藥物干預12周后，與Sham組比較，PMOP組、EZW-L組、EZW-M組、EZW-H組彈性模量、最大載荷顯著降低（均P<0.01）;與Sham組比較，E2組股骨彈性模量、最大載荷降低（均P<0.05）;與PMOP組比較，EZW-M組的彈性模量、最大載荷增高（均P<0.05），E2組、EZW-H組的彈性模量、最大載荷極顯著增高（均P<0.01）。見表2。

2.3 6組大鼠骨組織病理學比較 在進行藥物干預12周后，股骨頭HE染色在Sham組呈現的是股骨頭致密且厚的周圍骨皮質，大小適中的骨髓腔，大小、粗細正常的骨皮質小梁，且排列規(guī)律，位于骨陷窩內的骨細胞大小正常，骨細胞與骨陷窩壁緊密鑲貼。PMOP組可見股骨頭變薄的周圍骨皮質，萎縮變小的骨細胞，骨細胞與骨陷窩壁間隙明顯增大，并可見變小變短的骨皮質小梁，骨小梁之間間隙明顯比Sham組增大，呈明顯骨質疏松病理表現。與PMOP組比較，E2組和EZW-H組觀察到股骨頭周邊骨皮質較厚，骨小梁排列密度較均勻，骨小梁之間間隙亦變小，大小正常的骨細胞，骨細胞與骨陷窩之間未見明顯腔隙，疏松病理現象被明顯改善。E2組和EZW-H組鏡下骨組織切片形態(tài)結構相近。見圖1。

2.4 6組大鼠骨組織形態(tài)計量學比較 藥物干預12周后，與Sham組比較，PMOP組、EZW-L組、EZW-M組、EZW-H組的骨小梁骨體積分數、骨小梁平均寬度、骨小梁數均極顯著減少（均P<0.01），骨小梁平均間距則極明顯增加（P<0.01）;與Sham組比較，E2組的骨小梁骨體積分數、骨小梁平均寬度、骨小梁數顯著減少（均P<0.05），骨小梁平均間距顯著增加（P<0.05）;與PMOP組比較，EZW-M組的骨小梁骨體積分數、骨小梁平均寬度、骨小梁數顯著增高（均P<0.05），骨小梁平均間距顯著降低（P<0.05），E2組、EZW-H組的骨小梁骨體積分數、骨小梁平均寬度、骨小梁數極顯著增高（均P<0.01），骨小梁平均間距極顯著降低（P<0.01）。見表3。

2.5 6組大鼠血清骨代謝標志物BALP、TRACP-5b、Cath-K比較 藥物干預12周后，與Sham組比較，PMOP組、EZW-L組、EZW-M組的血清骨代謝標志物BALP、TRACP-5b、Cath-K的蛋白表達均顯著下降（均P<0.01），E2組、EZW-H組的BALP、TRACP-5b、Cath-K蛋白表達顯著下降（均P<0.05）;與PMOP組比較，EZW-M組的血清骨代謝標志物BALP、TRACP-5b、Cath-K的蛋白表達顯著增高（均P<0.05），E2組、EZW-H組的BALP、TRACP-5b、Cath-K蛋白表達極顯著增高（均P<0.01）。見表4。

2.6 6組大鼠骨組織OPG/RANK/RANKL信號軸蛋白表達情況及比較 藥物干預12周后，POMP組、EZW-L組、EZW-M組股骨中OPG蛋白含量較Sham組、E2組、EZW-H組明顯下降;而POMP組、EZW-L組、EZW-M組、EZW-H組股骨中RANK、RANKL蛋白含量較Sham組、E2組明顯增高。與Sham組比較，PMOP組、EZW-L組、EZW-M組的OPG/RANKL比值顯著下降（均P<0.01），E2組、EZW-H組的OPG/RANKL比值顯著下降（均P<0.05）;與PMOP組比較，EZW-M組的OPG/RANKL比值顯著增高（P<0.05），E2組、EZW-H組的OPG/RANKL比值顯著增高（均P<0.01）。與Sham組比較，PMOP組、EZW-L組、EZW-M組的RANK/RANKL比值顯著增高（均P<0.01），E2組、EZW-H組的RANK/RANKL比值顯著增高（均P<0.05）;與PMOP組比較，EZW-M組的RANK/RANKL比值顯著降低（P<0.05），E2組、EZW-H組的RANK/RANKL比值顯著降低（均P<0.01）。見圖2，表5。

3 討論

生理情況下，正常的骨代謝周期是骨吸收與骨形成的動態(tài)平衡。若某種原因導致正常的骨代謝動態(tài)平衡被打破，則出現骨形成小于骨吸收的病理狀態(tài)，造成骨量的丟失[9-10]。女性絕經后常發(fā)生骨質疏松，是由于絕經后女性卵巢功能衰退，減少了雌激素的分泌，骨代謝周期失衡，破骨細胞活性相對增強，加快了骨小梁吸收，陷窩加深，且骨形成率下降，造成骨丟失是不可逆的，引起骨小梁變薄、間隙增寬、連接破壞、骨體積減小等病理特征，導致骨脆性增加，易發(fā)生骨折[1]。

近年來國內外研究表明，OPG/RANKL信號軸是女性絕經后骨質疏松癥的發(fā)生、發(fā)展的重要路徑之一。OPG是抑制骨吸收、增加皮質骨和松質骨密度、面積和骨強度的關鍵細胞因子，其主要功能是競爭性地與RANKL結合，阻斷RANK與RANKL結合，從而抑制骨吸收，維持骨代謝平衡[11]，因此OPG/RANKL比值可作為衡量骨量及骨健康的重要指標[12]。RANK是誘導破骨細胞成熟的關鍵細胞因子，其主要功能是在破骨細胞及其前體細胞表面與RANKL結合，促進破骨細胞的成熟、分化，且減慢破骨細胞凋亡[13]。RANKL是調控骨吸收的關鍵細胞因子。Weitzmann[14]研究認為，RANKL是骨吸收和細胞因子對于破骨細胞的分化成熟的最后下游效應。

在絕經后雌激素缺乏首先是對成骨細胞的直接作用減弱，成骨細胞表達OPG能力減弱，OPG/RANKL比值降低，破骨細胞分化成熟力及活性增強。成骨細胞與破骨細胞均存在雌激素受體，而雌激素可直接作用于成骨細胞的雌激素受體α，上調OPGmRNA及蛋白的表達，增加OPG/RANKL比值[15-16]。體外實驗表明[17]，人破骨細胞中OPG mRNA的表達對17β-雌二醇呈劑量及時間依賴性，上調OPG能降低RANKL與RANK相互作用，減少骨吸收。給切除卵巢的小鼠注射OPG能預防骨流失。17β-雌二醇通過抑制RANK旁通路（JNK）活性來調節(jié)OPG/RANKL信號軸，從而減弱RANK受體應答力，降低RANK的生物活性[18]。

絕經后骨質疏松歸屬于中醫(yī)“骨痿”“骨痹”“骨枯”等疾病的范疇?！夺t(yī)精經義》曰：“腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨，故骨者，腎之合也，髓者，精之所生也，精足則髓足，髓在骨內，髓足則骨強?！敝嗅t(yī)認為腎為機體的先天之根本，功能主骨生髓，骨髓生化之源依賴于腎中精氣的充盛，腎精的盛衰決定著骨質的強健與衰弱，腎精充盛則骨得所養(yǎng)，腎氣充足則推動并調節(jié)和控制著機體骨的生長發(fā)育。《黃帝內經》亦云“年四十而陰氣自半”。女性至更年期，腎氣漸衰，精虧血少，則腎陰更顯不足，再加之肝火、心火之暗耗，故圍絕經期婦女以腎陰虛居多，因此補益肝腎是治療絕經后骨質疏松的關鍵。二至丸由女貞子、墨旱蓮2味藥組成，以《醫(yī)方集解》記載者為常用方，有益肝腎、補陰血、壯筋骨的功效。

本研究建立PMOP大鼠模型，以不同劑量的二至丸為干預方式，E2治療為金標準對照，PMOP組大鼠骨切片HE染色可見骨細胞萎縮變小、骨細胞與骨陷窩壁間隙明顯增大，是骨質疏松的典型表現，說明本研究模型制備是成功的。通過E2干預后，大鼠股骨骨質疏松情況、骨微結構、骨生物力學、血清骨代謝標志物等改變得到明顯好轉，骨組織中OPG明顯提高，而RANKL和RANK明顯降低，OPG/RANKL比值增高，RANK/RANKL比值下降，認為雌激素有通過促進OPG分泌，競爭性地與RANKL結合，抑制RANK與其結合，從而抑制破骨細胞的成熟分化。EZW-M組及EZW-H組也有E2組相似作用，說明其具有雌激素樣作用，也能改善骨微結構、骨生物力學，改善骨質疏松，可用于PMOP治療;其作用機制可能是通過OPG/RANK/RANKL信號軸促進成骨細胞形成，抑制破骨細胞活性。

參考文獻

[1]智信，陳曉，蘇佳燦.絕經后骨質疏松癥發(fā)病機制研究進展[J].中國骨質疏松雜志，2018，11（24）：1510-1534.

[2]李小娜.OPG/RANK/RANKL信號通路研究進展[J].河南醫(yī)學研究，2018，27（10）：1802-1804.

[3]吳隆琦.雌激素替代治療絕經后骨質疏松癥引發(fā)的爭議[J].中國臨床康復，2003，7（3）：452.

[4]黃凌曦.激素替代治療與乳腺癌發(fā)病風險的關系[J].中華乳腺病雜志（連續(xù)型電子期刊），2011，5（1）：78-81.

[5]梁文娜，李西海，李冠慧，等.二至丸抑制去勢大鼠骨量減少的實驗研究[J].世界中西醫(yī)結合雜志，2017，12（4）：492-495.

[6]梁文娜，李西海，胡柳，等.二至丸抑制絕經后骨質疏松大鼠骨代謝紊亂的作用機制研究[J].中醫(yī)正骨，2017，29（11）：1-7，14.

[7]林雄浩，吳錦忠.中藥復方二至丸的化學成分及抗骨質疏松研究進展[J].解放軍藥學學報，2009，25（5）：421-424.

[8]劉振濤，張怡元，林煜，等.二至丸促進圍絕經期婦女成骨細胞增殖的分子機制[J].中國骨質疏松雜志，2017，4（23）：524-529.

[9]Tan EM，Li L，Indran IR，et al.TRAF6 Mediates Suppression of Osteoclastogenesis and Prevention of Ovariectomy-Induced Bone Loss by a Novel Prenylflavonoid[J].J Bone Miner Res，2017，32（4）：846-860.

[10]Zhou L，Song J，Yang S，et al.Bone mass loss is associated with systolic blood pressure in postmenopausal women with type 2 diabetes in Tibet：a retrospective cross-sectional study[J].Osteoporos Int，2017，28（5）：1693-1698.

[11]黃榮蘭，胡文彬，詹慶昊.中醫(yī)藥通過調控骨代謝相關信號通路治療股骨頭壞死的研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2021，27（8）：241-250.

[12]甘國興，李勁平，劉毓，等.壯骨止痛方調節(jié)OPG/RANKL平衡抗絕經后骨質疏松作用[J].中國現代應用藥學，2017，34（7）：938-942.

[13]Wang C，Xiao F，Qu X，et al.Sitagliptin，An Anti-diabetic Drug，Suppresses Estrogen Deficiency-Induced OsteoporosisIn Vivo and Inhibits RANKL-Induced Osteoclast Formation and Bone Resorption In Vitro[J].Front Pharmacol，2017，8：407.

[14]Weitzmann MN.The Role of Inflammatory Cytokines，the RANKL/OPG Axis，and the Immunoskeletal Interface in Physiological Bone Turnover and Osteoporosis[J].Scientifica（Cairo），2013，2013：125705.

[15]Frenkel B，Hong A，Baniwal SK，et al.Regulation of adult bone turnover by sex steroids[J].J Cell Physiol，2010，224（2）：305-310.

[16]Galea GL，Meakin LB，Sugiyama T，et al.Estrogen receptor α mediates proliferation of osteoblastic cells stimulated by estrogen and mechanical strain，but their acute down-regulation of the Wnt antagonist Sost is mediated by estrogen receptor β[J].J Biol Chem，2013，288（13）：9035-9048.

[17]Hofbauer LC，Khosla S，Dunstan CR，et al.Estrogen stimulates gene expression and protein production of osteoprotegerin in human osteoblastic cells[J].Endocrinology，1999，140（9）：4367-4370.

[18]Marini H，Minutoli L，Polito F，et al.OPG and sRANKL serum concentrations in osteopenic，postmenopausal women after 2-year genistein administration[J].J Bone Miner Res，2008，23（5）：715-720.

（2020-11-11收稿 本文編輯：楊覺雄）