付笑笑 褚楚 黑國真 魏然 朱肖肖 張振 趙霖 郭強 許珂 李霞

（山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，濟南 250355）

自然流產(chǎn)連續(xù)發(fā)生2次或2次以上稱為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA），發(fā)病率約為育齡婦女的3%~5%，約占妊娠婦女的10%~15%，且隨著流產(chǎn)次數(shù)增多，患者再次流產(chǎn)的風(fēng)險顯著增加［1-2］。隨著我國三胎生育政策全面放開，RSA發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重危害婦女生殖健康，其防治是臨床亟需解決的難題。RSA病因復(fù)雜，除染色體、內(nèi)分泌、解剖、感染等因素外，仍有50%患者病因不明，稱為原因不明復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）［3］。因此，研究URSA的發(fā)病機制，探索其治療方法是目前國內(nèi)生殖領(lǐng)域研究的熱點與難點。URSA西醫(yī)治療主要采用妊娠激素補充、免疫治療等方法，但存在長期肌內(nèi)注射疼痛、易并發(fā)感染、免疫細胞轉(zhuǎn)輸功能不穩(wěn)定、過敏、致畸等副作用。中醫(yī)藥保胎歷史悠久，壽胎丸是補腎固沖安胎經(jīng)典方劑，臨床反復(fù)驗證了其有效性與安全性，但其干預(yù)靶點與作用機制尚未闡明［4］。

自噬是維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性的重要保護機制，自噬異常參與慢性阻塞性肺疾病、肺動脈高壓以及動脈粥樣硬化等多種疾病發(fā)生與發(fā)展［5-6］。隨著生殖醫(yī)學(xué)研究深入，發(fā)現(xiàn)細胞自噬與妊娠密切相關(guān)，正常妊娠早期存在滋養(yǎng)細胞自噬，適度自噬在促進胎盤發(fā)育、維持妊娠中發(fā)揮重要作用，而自噬過度或不足將破壞滋養(yǎng)細胞功能、打破母胎免疫耐受等導(dǎo)致流產(chǎn)，但其具體調(diào)控機制尚不明確［7-8］。本研究探討非編碼miRNA調(diào)控滋養(yǎng)細胞自噬在URSA中的作用及壽胎丸干預(yù)機制，以期進一步闡釋URSA發(fā)病機制，為臨床治療提供新的靶點與思路。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象選取2019年9月至2020年8月山東省婦幼保健院婦產(chǎn)科病房及門診就診的URSA患者和正常早孕婦女各30例作為研究對象，分為URSA組及正常早孕婦女組（NP），納入標準參照本課題組前期報道［4］。URSA組孕（7.60±1.75）周、平均年齡（27.03±3.03）歲，NP組孕（7.50±1.24）周、平均年齡（27.43±1.17）歲。各組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準，研究對象知情同意。

1.1.2 實驗動物8周齡雌性CBA/J小鼠、雄性DBA/2小鼠購自北京華阜康生物科技有限公司，體質(zhì)量18~20 g。動物實驗按照《實驗動物護理和使用指南》（山東第一醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）進行，并經(jīng)動物護理和使用委員會批準。

1.1.3 細胞和藥物人腎上皮細胞系293T細胞和人滋養(yǎng)細胞系HTR-8/SVneo均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；壽胎丸由菟絲子、桑寄生、阿膠、續(xù)斷按2∶1∶1∶1比例組成，購自山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。

1.1.4 主要試劑miR-374c-5p mimics及相應(yīng)對照NC、miR-374c-5p inhibitor及相應(yīng)對照INC由上海吉瑪公司合成；Lipofectamine2000購于美國Invitrogen公司；miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit購于南京諾唯贊生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（mRNA）購自上海東洋紡生物科技有限公司；GAPDH、ATG12、P62和LC3抗體購自美國CST公司；ATG12 3'UTR載體由美國Promega公司設(shè)計合成。

1.1.5 主 要 儀 器qRT-PCR儀（型 號：7500，Applied Biosystems）；垂直電泳儀（型號：165-8001，美國Bio-Rad）；全自動凝膠成像儀（型號：GloMax20/20，德國Royal）；快速半干轉(zhuǎn)膜儀（型號：FTB1，廣州道一）。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集采用人工流產(chǎn)負壓吸引收集兩組絨毛膜組織，立即置于預(yù)冷的1×PBS中研磨制備單細胞懸液用于Western blot及qRT-PCR檢測。

1.2.2 壽胎丸灌胃溶液制備菟絲子、桑寄生、續(xù)斷、阿膠按2∶1∶1∶1比例水煎濃縮至含生藥0.8 g/ml。

1.2.3 含藥血清制備CBA/J雌鼠隨機分為壽胎丸、對照組，每組8只。按照人與小鼠體表面積換算公式，壽胎丸組小鼠灌胃給予壽胎丸溶液，0.5 ml/（只·d），連續(xù)11 d；對照組灌胃給予等量蒸餾水。末次灌胃后1 h眼球取血，分離血清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 小鼠模型建立CBA/J雌鼠與DBA/2雄鼠交配建立URSA模型，每日清晨觀察小鼠陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓日為妊娠第0.5天［1］。URSA小鼠隨機分為壽胎丸組、對照組、壽胎丸+miR-374c-5p inhibitor組及壽胎丸+INC組，每組5只。壽胎丸組灌胃給予壽胎丸水溶液，0.5 ml/（只·d），對照組灌胃給予等量蒸餾水，壽胎丸+miR-374c-5p inhibitor組及壽胎丸+INC組在灌胃給予壽胎丸水溶液基礎(chǔ)上于妊娠第0.5天開始每隔3 d尾靜脈分別注射miR-374c-5p inhibitor及INC各10 nmol。各組小鼠均連續(xù)灌胃11 d，于妊娠第11.5天處死小鼠，觀察小鼠胚胎吸收率，收集胎盤組織用于Western blot及qRT-PCR檢測。

1.2.5 細胞分組和處理HTR-8/SVneo細胞分為miR-374c-5p mimics組、inhibitor組及相應(yīng)對照組，利用Lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)染miR-374c-5p mimics、inhibitor及相應(yīng)對照，24 h后收集各組細胞，檢測各組ATG12表達及自噬情況。采用無血清培養(yǎng)基饑餓誘導(dǎo)HTR-8/SVneo細胞6 h建立自噬模型［9］，隨機分為壽胎丸組及對照組。壽胎丸組細胞采用含20%壽胎丸藥物血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，對照組細胞采用含20%空白血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)［10］。24 h后收集各組細胞，檢測壽胎丸體外調(diào)控miR-374c-5p/ATG12信號軸的作用及對自噬的影響。

1.2.6 Western blot檢測LC3、P62及ATG12蛋白水平提取人絨毛組織、小鼠胎盤組織及HTR-8/SVneo細胞總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，分別加入ATG12、LC3、P62一抗4℃孵育過夜，1×PBST洗膜，加入二抗室溫搖床孵育1 h，1×PBST洗膜，化學(xué)發(fā)光法檢測LC3、P62及ATG12蛋白表達。

1.2.7 qRT-PCR檢測ATG12 mRNA及miR-374c-5p表達TRIzol法提取人絨毛、小鼠胎盤組織及HTR-8/SVneo細胞總RNA，紫外分光光度儀測定RNA濃度與純度。分別按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（mRNA）以及miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書合成cDNA，選用UltraSYBR Mixture PCR反應(yīng)體系進行PCR擴增，2-ΔΔCt法 計 算ATG12 mRNA及miR-374c-5p相 對 表達。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物來源及序列Tab.1 qRT-PCR primer source and sequences

1.2.8 與ATG12結(jié)合的差異miRNA篩選采用生物信息學(xué)軟件（Target Scan 7.2、DIANA、miRDB）結(jié)合課題組前期芯片檢測結(jié)果（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE178619）篩選可能與ATG12結(jié)合的差異miRNA。

1.2.9 雙熒光素酶報告基因驗證miR-374c-5p與ATG12互補結(jié)合以pmirGLO為載體構(gòu)建包含結(jié)合位點的野生型及突變型ATG12 mRNA 3'UTR質(zhì)粒，采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染至293T細胞，同時分別轉(zhuǎn)染NC及miR-374c-5p mimics，24 h后收集細胞并檢測相對熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用GraphPad Prism Version 7.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)和圖片處理，結(jié)果以±s表示；配對t檢驗比較兩組間差異；單因素方差分析（One-Way ANOVA）比較多組間差異；Pearson相關(guān)分析分析樣本相關(guān)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人絨毛組織ATG12及LC3、P62表達與NP組相比，URSA患者絨毛組織中ATG12 mRNA及蛋白表達均顯著上升（P<0.000 1），自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ比值顯著升高，P62表達顯著降低（P<0.01，圖1），提示ATG12介導(dǎo)滋養(yǎng)細胞自噬參與URSA發(fā)生過程。

圖1 URSA患者絨毛組織中ATG12及自噬相關(guān)蛋白表達Fig.1 Expressions of ATG12 and autophagy-related proteins in villous tissues of patients with URSA

2.2 人絨毛組織中miR-374c-5p表達為闡釋自噬關(guān)鍵分子ATG12上游調(diào)控機制，結(jié)合生物信息學(xué)軟件及課題組前期芯片檢測數(shù)據(jù)篩選發(fā)現(xiàn)，miR-374c-5p、miR-23a-5p與ATG12 mRNA 3′UTR具有潛在結(jié)合位點（圖2A）。進一步擴大臨床樣本表達驗證顯示，與NP組相比，URSA組miR-374c-5p表達顯著降低（P<0.000 1），而miR-23a-5p表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖2B、C）。Pearson相關(guān)性分析顯示，ATG12 mRNA與miR-374c-5p表達呈顯著負相關(guān)（r=-0.603 1，P<0.01，圖2D）；ROC曲線分析顯示，曲線下面積（AUC）為0.827 7（95%CI：0.728 0~0.941 0，P<0.000 1），提示miR-374c-5p表達變化可敏感區(qū)分URSA患者與正常早孕婦女（圖2E）。

圖2 調(diào)控ATG12表達篩選差異miRNAsFig.2 Screening of differential miRNAs by regulating ATG12 expression

2.3 調(diào)控miR-374c-5p表達對ATG12表達及自噬的影響HTR-8/SVneo細胞轉(zhuǎn)染miR-374c-5p mimics后，miR-374c-5p表達顯著升高（P<0.001），ATG12 mRNA及蛋白表達、LC3Ⅱ/Ⅰ比值顯著降低（P<0.001），P62蛋白表達顯著升高（P<0.001，P<0.000 1）；轉(zhuǎn)染miR-374c-5p inhibitor后，miR-374c-5p顯 著 降低（P<0.001），同時ATG12 mRNA及蛋白表達、LC3Ⅱ/Ⅰ比值顯著升高（P<0.05），P62蛋白表達顯著降低（P<0.001，圖3）。提示miR-374c-5p可負向調(diào)控ATG12表達影響滋養(yǎng)細胞自噬。

圖3 調(diào)控miR-374c-5p表達對ATG12 mRNA及自噬蛋白表達的影響Fig.3 Effect of regulating miR-374c-5p expression on ex?pressions of ATG12 mRNA and autophagy proteins

2.4 miR-374c-5p對ATG12的靶向調(diào)控作用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-374c-5p與ATG12 mRNA 3′UTR存在潛在堿基互補結(jié)合位點（圖4A），雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)顯示，miR-374c-5p mimics可顯著降低WT-pmirGLO-ATG12 3'UTR相對熒光素酶活性（P<0.01，圖4B），而對Mut-pmirGLO-ATG12 3'UTR相對熒光素酶活性無影響（P>0.05，圖4C），提示miR-374c-5p通過堿基互補直接結(jié)合ATG12 mRNA 3′UTR抑制其轉(zhuǎn)錄和翻譯。

圖4 ATG12是miR-374c-5p的直接靶點Fig.4 ATG12 is a direct target of miR-374c-5p

2.5 壽胎丸含藥血清對miR-374c-5p/ATG12信號軸及自噬的影響與空白血清組相比，壽胎丸含藥血清組miR-374c-5p表達顯著升高（P<0.01），同時ATG12 mRNA及蛋白表達顯著降低（P<0.000 1），LC3Ⅱ/Ⅰ比值顯著降低（P<0.000 1），P62蛋白水平顯著升高（P<0.01，圖5），提示壽胎丸含藥血清可體外調(diào)控miR-374c-5p/ATG12信號軸抑制滋養(yǎng)細胞自噬。

圖5 壽胎丸含藥血清對miR-374c-5p及自噬的影響Fig.5 Effect of Shoutai Pill medicated serum on miR-374c-5p and autophagy

2.6 壽胎丸靶向miR-374c-5p/ATG12信號軸抑制滋養(yǎng)細胞自噬發(fā)揮妊娠保護作用與對照組相比，壽胎丸治療組小鼠胚胎吸收率明顯降低（P<0.001），miR-374c-5p表達顯著升高（P<0.000 1），ATG12 mRNA及蛋白表達顯著降低（P<0.001），同時LC3Ⅱ/Ⅰ比值顯著降低（P<0.000 1），P62蛋白水平顯著升高（P<0.001），提示壽胎丸可通過調(diào)控miR-374c-5p/ATG12信號軸抑制滋養(yǎng)細胞自噬發(fā)揮妊娠保護作用。尾靜脈注射miR-374c-5p inhibitor可逆轉(zhuǎn)壽胎丸對妊娠的保護作用，小鼠胚胎吸收率明顯升高（P<0.01），miR-374c-5p表達顯著降低，ATG12表達及LC3Ⅱ/Ⅰ比值顯著升高，P62表達顯著下降（P<0.01，圖6）。進一步證實壽胎丸通過調(diào)控miR-374c-5p/ATG12信號軸抑制滋養(yǎng)細胞自噬發(fā)揮妊娠保護作用。

圖6 壽胎丸靶向ATG12調(diào)控自噬對妊娠的保護作用Fig.6 Protective effect of Shoutai Pill targeting ATG12 to regulate autophagy on pregnancy

3 討論

妊娠類似于同種異體移植，是母胎間復(fù)雜而精細的調(diào)控過程，任何因素失衡都可能導(dǎo)致流產(chǎn)。自噬是維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性的一種保護機制，通過形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體吞噬包裹細胞內(nèi)待降解的大分子蛋白與細胞器等，并形成自噬溶酶體對其進行降解［11-12］。適度自噬對維持細胞正常功能及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要作用，但自噬過度及不足均可導(dǎo)致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腫瘤等多種疾病發(fā)生與發(fā)展［13-14］。隨著生殖醫(yī)學(xué)研究深入，發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)細胞自噬過度激活參與URSA發(fā)生過程，如URSA患者滋養(yǎng)細胞表達下調(diào)的音猬因子（shh）信號通路通過激活自噬促進E-鈣黏素（E-Cad）表達抑制滋養(yǎng)細胞遷移［7］；線粒體融合蛋白-2（MFN2）缺乏導(dǎo)致滋養(yǎng)細胞ATG5表達增加促進自噬進而抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9及整合素β1表達損傷滋養(yǎng)細胞植入功能［15］。

自噬相關(guān)蛋白ATG12是一種泛素樣蛋白，在自噬體形成過程中扮演關(guān)鍵角色，可與多種蛋白相互作 用，如ATG12與ATG5耦 聯(lián) 并 激 活A(yù)TG7和ATG10，ATG12-ATG5共軛物與ATG16L1相互作用形成ATG12-ATG5-ATG16L1復(fù)合物并促進ATG8（LC3）脂質(zhì)化，指導(dǎo)其正確的亞細胞定位，是自噬體延長和成熟所必需的［16］。因此，ATG12是調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵分子，其表達變化可影響自噬體形成及功能。人ATG12基因是由140個氨基酸編碼的定位于染色體5q21-q22 34區(qū)的蛋白，普遍表達于各種組織。研究表明ATG12介導(dǎo)的細胞自噬參與帕金森病、骨肉瘤等多種疾病病理過程，但其介導(dǎo)的滋養(yǎng)細胞自噬在URSA中的作用及上游調(diào)控機制尚不清楚［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)URSA患者絨毛組織中ATG12 mRNA及蛋白表達均顯著上升，同時發(fā)現(xiàn)LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高、P62表達明顯下降，提示ATG12介導(dǎo)的滋養(yǎng)細胞自噬參與URSA發(fā)生，未來將繼續(xù)尋找URSA發(fā)生時ATG12表達升高的上游調(diào)控機制。

隨著人類多個基因組計劃的完成及測序技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的非編碼RNA被分離和鑒定。miRNA是一類長約22個核苷酸的單鏈非編碼RNA，其前體在Drosha和Dicer水解酶剪切下與Ago蛋白結(jié)合為成熟的miRNA。成熟的miRNA通過與靶基因3'UTR堿基互補結(jié)合，降解靶基因或抑制靶基因轉(zhuǎn)錄和翻譯。越來越多證據(jù)表明，miRNA參與多種病理和生理過程，對細胞增殖、分化、遷移、侵襲及凋亡等發(fā)揮重要調(diào)控作用［19］。miRNA在URSA中的作用日益受到關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)miRNA對滋養(yǎng)細胞功能及母胎免疫耐受均具有重要調(diào)控作用［20-21］。miRNA通過調(diào)控細胞自噬在多種疾病中發(fā)揮重要作用，如人心肌缺血細胞中miR-103a-3p表達降低促進ATG5介導(dǎo)的心肌細胞自噬［22］。急性心肌梗死患者及缺血再灌注小鼠模型中，miR-26a-5p表達下調(diào)促進ATG12介導(dǎo)的心肌細胞自噬［23］。此外，研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌細胞中miR-23b表達降低促進ATG12介導(dǎo)的細胞自噬從而導(dǎo)致放療抵抗［24］。盡管已證明miRNA在URSA及自噬中均具有重要作用，但miRNA調(diào)控滋養(yǎng)細胞自噬在URSA中的作用與調(diào)控機制尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)URSA患者絨毛滋養(yǎng)細胞ATG12表達及其介導(dǎo)的細胞自噬均顯著升高，通過生物信息學(xué)分析結(jié)合前期高通量檢測篩選到對ATG12具有潛在調(diào)控作用的miR-374c-5p，并證實miR-374c-5p在URSA患者絨毛組織中表達顯著下降，且與ATG12表達呈顯著負相關(guān)，ROC分析表明miR-374c-5p可顯著區(qū)分URSA患者和正常妊娠婦女，提示miR-374c-5p調(diào)控ATG12介導(dǎo)的滋養(yǎng)細胞自噬參與URSA發(fā)生，有望成為新的臨床生物學(xué)診斷標志物及藥物干預(yù)靶點。

miR-374c-5p是由23個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，由人X染色體轉(zhuǎn)錄而來，屬于miR-374家族，已被廣泛研究并證實其表達異常參與宮頸癌、阿爾茨海默病、動脈粥樣硬化等疾病發(fā)生發(fā)展［25-26］。本研究通過生物信息學(xué)軟件結(jié)合前期全轉(zhuǎn)錄組高通量檢測發(fā)現(xiàn)，miR-374c-5p與ATG12 mRNA 3′UTR存在堿基互補結(jié)合位點，并通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)證實miR-374c-5p與ATG12 mRNA 3'UTR可通過堿基互補直接結(jié)合。體外實驗發(fā)現(xiàn)過表達miR-374c-5p可顯著抑制ATG12 mRNA及蛋白表達、降低LC3Ⅱ/Ⅰ比值、促進P62蛋白表達；而抑制miR-374c-5p表達作用相反，提示miR-374c-5p通過堿基互補結(jié)合對ATG12發(fā)揮負向調(diào)控作用，靶向miR-374c-5p/ATG12信號軸調(diào)控滋養(yǎng)細胞自噬可能成為治療URSA的有效途徑。

URSA屬中醫(yī)學(xué)“滑胎”范疇，亦稱“數(shù)墮胎”“屢孕屢墮”，歷代醫(yī)家對其病機認識和治療積累了許多寶貴經(jīng)驗。中醫(yī)認為“腎主生殖”，腎虛沖任不固是URSA的根本病機，補腎固沖是本病基本治則，張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中創(chuàng)制補腎固沖經(jīng)典方劑壽胎丸，流傳至今，取得良好臨床療效，但其作用靶點與機制尚未完全闡明［27］。本研究發(fā)現(xiàn)壽胎丸含藥血清可顯著促進HTR-8/SVneo細胞miR-374c-5p表達，抑制ATG12 mRNA及其蛋白表達、降低LC3Ⅱ/Ⅰ比值、促進P62表達。同時，體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)壽胎丸治療后小鼠胚胎吸收率明顯下降，同時發(fā)現(xiàn)miR-374c-5p表達顯著升高、ATG12表達及LC3Ⅱ/Ⅰ比值顯著降低、P62蛋白表達顯著升高，而尾靜脈注射miR-374c-5p inhibitor可拮抗壽胎丸妊娠保護及對自噬的調(diào)控作用，進一步證實壽胎丸通過調(diào)控miR-374c-5p/ATG12信號軸減輕滋養(yǎng)細胞自噬進而治療URSA。

綜上所述，本研究揭示了miR-374c-5p通過堿基互補直接結(jié)合ATG12負向調(diào)控其表達的作用，證實miR-374c-5p/ATG12信號軸介導(dǎo)的滋養(yǎng)細胞自噬在URSA發(fā)病中的作用，闡釋了中藥復(fù)方壽胎丸靶向調(diào)控miR-374c-5p/ATG12信號軸減輕滋養(yǎng)細胞自噬治療URSA的作用與分子機制。從非編碼RNA調(diào)控角度進一步揭示了URSA發(fā)病機制，為臨床診斷及治療提供了新的靶點與思路。