楊艷俊，楊秀東，張 艷

(吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

山里紅(Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.)是中國(guó)藥典中山楂藥材的兩種來(lái)源品種之一，屬于薔薇科果樹(shù)的果實(shí)，也稱(chēng)為北山楂、仙果，廣泛分布于中國(guó)北方，屬于天然的有機(jī)食品，重要的藥食同源之物[1].山里紅干燥成熟的果實(shí)，有活血化瘀、理氣通脈、化濁降脂的功能.山里紅中有許多類(lèi)型的生物活性成分，主要分為兩大類(lèi)：黃酮類(lèi)和有機(jī)酸.已經(jīng)分離出金絲桃苷素、槲皮素、牡荊素等黃酮類(lèi)化合物[2-6].黃酮類(lèi)化合物具有較強(qiáng)的擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、改善微循環(huán)的功效，較好的抗氧化能力，同時(shí)能夠抵抗動(dòng)脈粥樣硬化，改善細(xì)胞糖脂代謝等作用[7-11].因此，山里紅總黃酮的研究開(kāi)發(fā)具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益.以山里紅的干燥果實(shí)為研究對(duì)象，應(yīng)用BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲輔助提取工藝，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)其含量，通過(guò)清除超氧陰離子、DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力來(lái)評(píng)估抗氧化活性，為山里紅的深入開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

野生山里紅干燥果實(shí)，吉林市周邊山區(qū)采集；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，95%乙醇，三氯化鐵，鎂粉，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉，三羥甲基氨基甲烷，濃鹽酸，鄰苯三酚，DPPH，ABTS，過(guò)硫酸鉀，以上均為國(guó)產(chǎn)分析純.

紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；電子分析天平，上海舜宇恒平科學(xué)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；恒溫水浴鍋，常國(guó)華電器有限公司；超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)，上海姚氏儀器設(shè)備廠；高速粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮的鑒定

山里紅提取液，加入FeCl3溶液，溶液變?yōu)樯罹G色；另取提取液加入少許的鎂粉，搖勻，加入2滴濃鹽酸，1～2 min后，溶液呈紫色，證明提取液含有黃酮類(lèi)化合物.

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

(1)對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品置于50 mL容量瓶中，用80%乙醇溶解并定容，得0.2 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)品溶液.

(2)供試品溶液的制備

燒瓶中加入山里紅粉末2.0 g，40 mL 60%乙醇溶液，在30 ℃下超聲提取30 min，過(guò)濾，得黃酮提取液，備用.

(3)測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)

取供試液1 mL置于25 mL容量瓶中，加少量5%的NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min；加10%的Al2(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；加4%的NaOH溶液4 mL，60%乙醇定容至刻度，在400～600 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描，在504 nm處有最大吸收峰.如需測(cè)定樣品吸光度，則每次測(cè)定3個(gè)數(shù)據(jù)取平均值.

(4)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過(guò)用梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液測(cè)吸光度后，依據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.2.3 方法學(xué)研究

(1)精密度實(shí)驗(yàn)

移取2 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液并放進(jìn)10 mL容量瓶中，按照1.2.2(3)項(xiàng)顯色處理后，在504 nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定6次吸光度，計(jì)算相對(duì)偏差.

(2)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

各吸取少量供試液，使時(shí)間間隔分別為5、10、15、30、60、90 min，按1.2.2(3)項(xiàng)顯色處理后，在504 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度，計(jì)算相對(duì)偏差.

(3)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

各吸取少量供試液分別放入6個(gè)小容量瓶中，按1.2.2(3)項(xiàng)顯色處理后，在504 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算相對(duì)偏差.

(4)加樣回收實(shí)驗(yàn)

精密吸取上述溶液0.2 mL，并置于10 mL量瓶中，加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(0.41 mg·mL-1)2 mL.按1.2.2(3)項(xiàng)顯色處理后，在504 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差與回收率.

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

(1)乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響

精密稱(chēng)取5份山里紅粉各2.0 g，以40 mL乙醇溶液作為溶劑，設(shè)定乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%，在30 ℃條件下，超聲提取30 min，抽濾得濾液.

(2)液料比對(duì)黃酮提取率的影響

(3)提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響

(4)提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

分別精密吸取上述各濾液0.1 mL，按1.2.2(3)項(xiàng)顯色處理后，在504 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮提取率.

1.2.5 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

為進(jìn)一步優(yōu)化山里紅總黃酮的最佳工藝條件，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，對(duì)應(yīng)的4因素3水平的響應(yīng)面分析工藝參數(shù)見(jiàn)表1.

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1.2.6 山里紅總黃酮抗氧化性研究

(1)超氧陰離子的清除能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[12]～[13]，取緩沖溶液預(yù)熱后，分別加入不同濃度的供試品溶液和鄰苯三酚溶液，反應(yīng)后加入8 mol·L-1的鹽酸終止反應(yīng)，在325 nm處測(cè)吸光度，為A1；蒸餾水代替鄰苯三酚溶液，重復(fù)上述步驟，吸光度A0.Vc做對(duì)照實(shí)驗(yàn).清除率如公式(1)所示：

(1)

(2)對(duì)DPPH自由基的清除能力測(cè)定

測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[14]～[15]，將2 mL濃度為0.1 mmol·L-1的DPPH溶液與0.1 mg·mL-1的樣品溶液(0.4～2.0 mL)混合，室溫避光反應(yīng)35 min，在517 nm處測(cè)定其吸光度Ai；測(cè)量不同濃度樣品的吸光度Aj.以2 mL乙醇代替樣品，與2 mL DPPH混勻，其吸光度A0.

(2)

(3)ABTS自由基清除能力的測(cè)定

測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[16]～[17]，將ABTS和過(guò)硫酸鉀混合，靜置過(guò)夜(至少12 h)，稀釋后使之在734 nm處吸光度為0.7±0.02.樣品管中加入0.1 mL黃酮溶液、3.9 mL ABTS工作液，靜置6 min，測(cè)吸光度A樣，移取2 mL無(wú)水乙醇，按同樣方法處理測(cè)定吸光度A0.同法測(cè)定Vc清除ABTS自由基的能力.清除率如公式(3)所示：

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=11.054x-0.002，R2=0.999 9，在濃度為0.2～0.8 mg·mL-1范圍內(nèi)，蘆丁濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系.

2.2 方法學(xué)研究結(jié)果

2.2.1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

吸光度值RSD=0.5%<1%，表明精密度良好.

1）冒漿。注漿過(guò)程中，要認(rèn)真觀察地表及相鄰管線的變化情況，由于漿液的注入引起地層變化，并且封閉強(qiáng)度較低的地方可能會(huì)冒出漿液，需要加以堵塞，必要時(shí)采用間歇注漿方式，確保漿液有效的注入地層。

2.2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明吸光度A隨時(shí)間改變表現(xiàn)出逐漸減弱趨勢(shì)，在30 min內(nèi)樣品溶液的吸光度降低不顯著，RSD值為1.6%；在60 min內(nèi)樣品溶液吸光度值的RSD值為3.2%，隨著時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)降低.結(jié)果表明，供試品溶液顯色后在30 min內(nèi)較為穩(wěn)定.

2.2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

6組吸光度值經(jīng)計(jì)算RSD=0.91%<1%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好.

2.2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

5組吸光度值經(jīng)計(jì)算RSD=1.19%<2%，平均加樣回收率為98.52%.結(jié)果表明：回收率較高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差偏小，該方法準(zhǔn)確度較高.

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響

乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響如圖1所示.

乙醇濃度/%圖1 乙醇濃度的影響

由圖1可見(jiàn)，當(dāng)乙醇濃度逐步增大，總黃酮提取率呈先增大后減小的趨勢(shì).當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，黃酮類(lèi)化合物提取率最高.原因可能是60%乙醇的溶液極性與黃酮的極性相當(dāng).

2.3.2 液料比對(duì)黃酮提取率的影響

液料比對(duì)黃酮提取率的影響如圖2所示.

液料比(mL/mg)圖2 液料比的影響

2.3.3 提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響

提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響如圖3所示.

提取溫度/℃圖3 提取溫度的影響

由圖3可見(jiàn)，當(dāng)溫度逐漸升高，山里紅干燥果實(shí)粉末的提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì).提取溫度50 ℃時(shí)，提取率達(dá)到最高.溫度越高越有利于擴(kuò)散進(jìn)行，有效成分即可快速滲透到溶劑中，但溫度過(guò)高時(shí)雜質(zhì)也易溶出.

2.3.4 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響如圖4所示.

提取時(shí)間/min圖4 提取時(shí)間的影響

由圖4可見(jiàn)，當(dāng)提取時(shí)間逐漸增加時(shí)，提取率呈現(xiàn)先增大后減小并逐漸平緩的趨勢(shì).說(shuō)明此時(shí)黃酮類(lèi)化合物已經(jīng)基本提取完全，延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取率增大不明顯，可取最佳提取時(shí)間為20 min.

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

2.4.1 采用響應(yīng)面法優(yōu)化山里紅總黃酮提取工藝

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)匯總見(jiàn)表2，實(shí)驗(yàn)號(hào)3、22、26、28、29條件是4因素最佳組合，隨機(jī)分布于29次響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中.剩余實(shí)驗(yàn)號(hào)為分析實(shí)驗(yàn)，用來(lái)估算實(shí)驗(yàn)誤差，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充優(yōu)化，最后統(tǒng)一分析進(jìn)行擬合，得出最優(yōu)條件.由Design-Expert 8.0.6.1軟件處理數(shù)據(jù)，根據(jù)二次回歸方程擬合分析，得出多組變量之間的函數(shù)關(guān)系，多因素組合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，其方差分析結(jié)果見(jiàn)表3.回歸方程為：

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表3 回歸方程方差分析表

Y=-38.45500+0.51300A+0.71771B+0.11300C+0.85533D-7.18750E-004AB-3.50000E-004AC+7.05000E-003AD-1.68750E-003BC+2.09375E-003BD+2.77500E-003CD6.88333E-003A2-0.014564B2-4.53333E-003C2-0.013471D2

2.4.2 方差結(jié)果分析

由表3回歸方程方差分析結(jié)果可知，模型項(xiàng)P值<0.000 1，表明該模型高度顯著；失擬項(xiàng)0.626 1>0.05，說(shuō)明該模型可信度高.回歸模型的決定系數(shù)R2為0.981 7，調(diào)整型決定系數(shù)Adj-R2為0.963 4，說(shuō)明該模型能夠很好地描述此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果.模型預(yù)測(cè)了乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)山里紅總黃酮提取率效果的影響，由表3可知：A、B、D、AD、CD、A2、B2、C2、D2為顯著影響因素.

2.4.3 兩因素交互作用分析

響應(yīng)面對(duì)于因素A、B、C、D值所構(gòu)成的三維空間在二維平面上的等高線圖，可直觀地反映各因素之間的相互作用，等高線的形狀可以反映出交互相的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反.由響應(yīng)面三維立體曲線分析可知各個(gè)因素對(duì)響應(yīng)面值的影響，例如，乙醇濃度的響應(yīng)曲面坡度陡峭，表明該因素對(duì)于黃酮提取率作用明顯[18].液料比、乙醇濃度交互作用，表現(xiàn)為曲面陡峭，表明對(duì)其響應(yīng)值的影響明顯.通過(guò)軟件處理得到響應(yīng)面分析結(jié)果見(jiàn)圖5～10.

圖6 乙醇濃度與提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面和等高線

圖7 乙醇濃度與提取溫度對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖8 液料比與提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖9 液料比與提取溫度對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖10 提取時(shí)間與提取溫度對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖

2.4.4 模型方程的驗(yàn)證試驗(yàn)

2.5 山里紅總黃酮抗氧化性研究

2.5.1 對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力測(cè)定

測(cè)定山里紅總黃酮的抗氧化活性，與Vc做對(duì)照，測(cè)定結(jié)果如下圖11.

不同濃度的山里紅總黃酮都有抗氧化活性，且隨總黃酮濃度的增加，吸光度增大.通過(guò)使用SPSS進(jìn)行模擬計(jì)算，山里紅總黃酮的IC50=0.36 mg·mL-1，Vc的IC50=0.14 mg·mL-1，通過(guò)對(duì)比山里紅總黃酮樣品的IC50與Vc的IC50，發(fā)現(xiàn)山里紅總黃酮有較強(qiáng)的清除超氧陰離子自由基的能力.

濃度/(mg·mL-1)圖11 山里紅總黃酮提取液和Vc對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力

2.5.2 對(duì)DPPH自由基的清除能力測(cè)定

對(duì)山里紅總黃酮及Vc的抗氧化活性進(jìn)行了分析研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖12.

如圖所示，隨著山里紅總黃酮的濃度增加，其清除DPPH自由基能力逐漸增強(qiáng).通過(guò)SPSS進(jìn)行模擬計(jì)算，山里紅總黃酮的IC50=0.05 mg·mL-1，而Vc的IC50=0.01 mg·mL-1時(shí)由此可見(jiàn)山里紅總黃酮對(duì)清除DPPH自由基具有一定的作用.

濃度/(mg·mL-1)圖12 山里紅總黃酮提取液和Vc對(duì)DPPH自由基的清除能力

2.5.3 對(duì)ABTS自由基的清除能力測(cè)定

對(duì)山里紅總黃酮及Vc的抗氧化活性進(jìn)行了分析研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖13.

濃度/(mg·mL-1)圖13 濃度梯度下的總黃酮和Vc對(duì)ABTS自由基的清除能力

由圖可知，山里紅總黃酮及Vc均對(duì)ABTS自由基有一定的清除能力，且在一定范圍內(nèi)，隨濃度的增大，其清除率增大，呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系.通過(guò)使用SPSS進(jìn)行模擬計(jì)算，山里紅總黃酮的IC50=0.35 mg·mL-1，Vc的IC50=0.34 mg·mL-1.通過(guò)對(duì)比山里紅總黃酮樣品的IC50與Vc的IC50，發(fā)現(xiàn)山里紅總黃酮有較強(qiáng)的抗氧化活性.

3 結(jié) 論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面分析對(duì)山里紅總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，總黃酮提取的最佳工藝條件：乙醇濃度62%，液料比26 mL/mg，提取時(shí)間21 min，提取溫度52 ℃，在此條件總黃酮的提取率預(yù)測(cè)值為10.19%，驗(yàn)證值為10.13%，預(yù)測(cè)值與驗(yàn)證值非常接近，說(shuō)明響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方法用于山里紅總黃酮提取工藝優(yōu)化科學(xué)可靠.

山里紅果總黃酮具有一定的清除自由基的能力，與總黃酮濃度呈線性關(guān)系.超氧陰離子、ABTS和DPPH自由基清除能力的IC50分別為0.36、0.05、0.35 mg·mL-1，均具有顯著的抗氧化能力.