楊敏捷（綜述） 王小林△（審校）

（1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院介入治療科 上海 200032；2上海市影像醫(yī)學(xué)研究所 上海 200032；3國家放射與治療臨床醫(yī)學(xué)中心 上海 200032）

人體內(nèi)穩(wěn)態(tài)需要自我更新和分化之間的精確平衡。不同組織中存在干細胞，其中少數(shù)保留再生潛能，而大多數(shù)細胞進入不可逆分化過程，最終產(chǎn)生特定類型的細胞。干細胞存在于造血干細胞、神經(jīng)干細胞、腸、皮膚、心肌、肺等組織中［1］。人體對于某種抗原能夠產(chǎn)生長達幾十年甚至終身的特異性免疫記憶［2］。理論上存在一種能夠自我更新以及分化為其他類型T細胞的記憶性干細胞樣T細胞（stem cell-like memory T cells，TSCM）［3］。2006年，人們在移植物抗宿主疾病小鼠模型中發(fā)現(xiàn)一群長期生存、具有干細胞特性的記憶T細胞，逐步揭開了TSCM神秘的面紗［4］。由于TSCM所占比例稀少（正常人外周血中TSCM占T細胞的2%～3%）［5］，確定人類的TSCM表型特征十分具有挑戰(zhàn)性。最近，通過TSCM細胞標記物CD62L、CCR7、IL2Rβ、BCL-2和趨化因子（C-X-C基序）受 體3（chemokine（C-X-C motif）receptor 3，CXCR3）的表達可在多個物種中鑒別出TSCM［4-5］。使用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（carboxy fluorescein N-succinimidyl ester，CSFE）追蹤細胞分裂的實驗已經(jīng)證明：TSCM細胞能夠自我更新，且分化為 不 同 類 別 的T細 胞［6］。雖 然 中 央 記 憶T細 胞（central memory T cell，TCM）和 效 應(yīng) 記 憶T細 胞（effector memory T cell，TEM）也可以進行自我更新，但是只有TSCM細胞能夠產(chǎn)生所有3種記憶T細胞以及效應(yīng)T細胞（effector T cell，TEFF）［5］。

細胞免疫治療是腫瘤治療的新方向，其中基因修飾T細胞（如嵌合抗原受體T細胞，CAR-T）已經(jīng)在血液系統(tǒng)腫瘤中取得突破性進展。但是實體腫瘤的CAR-T細胞治療效果欠佳。研究表明大部分的T細胞在輸注后耗竭失能［7］，而輸注記憶性T細胞等其他具有長期生存能力的T細胞亞型有望提高臨床療效［8-11］。采用傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)方案擴增T細胞會導(dǎo)致T細胞分化和增殖潛力的喪失。由于TSCM能夠更好地適應(yīng)腫瘤微環(huán)境并且能夠長期生存分化為其他類型的T細胞，這使其成為腫瘤細胞免疫治療的理想工具［12-13］。目前，首個采用Piggybac基因編輯技術(shù)以抗B細胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）為靶點的CAR-TSCM的臨床試驗正在進行中（NCT03288493）。

通過小分子藥物在體外誘導(dǎo)或者重新編程誘導(dǎo)干細胞、心肌細胞、神經(jīng)細胞、β-胰島細胞等［14-15］。TSCM表型研究的重要進展也是在小分子藥物處理下誘導(dǎo)產(chǎn)生足夠量的細胞（用于細胞測序，發(fā)現(xiàn)表型特征）的前提下而取得［5-6，16］。另外，抗原識別、共刺激配體和細胞因子共同調(diào)控T細胞活化和分化。本文將主要聚焦于TSCM，對其誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)機制的最新研究進展進行綜述。

T細胞的分化幼稚T細胞（na?ve T cell，TN）在 接 受 抗 原 刺 激 后 表 達CD45RO［17］，分 化 為TM及TEFF。根據(jù)是否表達淋巴結(jié)歸巢標志CCR7，TM分為TCM（CCR7+）及TEM（CCR7-）［18］。與TN比較，TM在抗原再次刺激時能夠迅速增殖，釋放TNFα、IL-2、IFN-γ等細胞因子，轉(zhuǎn)化為TEFF細胞［19］。TCM細胞保持表達CD62L及CCR7但TEM兩者均為陰性，前者能夠更高效地釋放IL-2而后者則釋放更多的IFNγ從而更具細胞毒性［18］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)T細胞的分化呈漸進式：效應(yīng)相關(guān)基因的表達隨著TN細胞→TSCM細胞→TCM細胞→TEM細胞逐漸升高，而初始相關(guān)基因的表達則逐漸丟失［5，20］；T細胞效應(yīng)相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄因子隨著細胞分化程度去甲基化并處于準備表達的狀態(tài)，在IL-5、IL-7介導(dǎo)的細胞增殖中效應(yīng)分子的去甲基化得以保存而CCR7、Tcf7位點則 逐 漸 甲 基 化［21］。TSCM是 幼 稚T細胞接受抗原刺激后分化最少的一群T細胞其基因表達譜更接近于TM。

2006年Takahashi等［22］報道導(dǎo)入4種 轉(zhuǎn) 錄因子將體細胞轉(zhuǎn)化為干細胞的iPSC技術(shù)。iPSC技術(shù)開啟了人類編輯細胞的新篇章。近年來，人們利用不同的細胞譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子組合，通過iPSC技術(shù)成功誘導(dǎo)出神經(jīng)細胞、心肌細胞、肝細胞、β-胰腺細胞［23-26］。然而，用于遞送重編程因子的轉(zhuǎn)基因載體一般是病毒，這對干細胞的臨床應(yīng)用產(chǎn)生影響。小分子藥物可取代部分轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控相關(guān)通路促進干細胞的產(chǎn)生［27］。近年來，基于這種思維以及前期對于T細胞記憶產(chǎn)生機制相關(guān)通路的研究，利用小分子藥物促進TSCM的分化取得了重大的研究進展（表1）。

表1 TSCM體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的機制Tab 1 Mechanisms of in vitro induction of TSCM

WNT信號通路在TSCM中的作用WNT信號對維持干細胞的自我更新具有重要的作用，通過GSK3β抑制劑激活WNT通路可以增加iPSC的轉(zhuǎn)換效率［28-30］。T細胞在胸腺的發(fā)育、分化、成熟中WNT信號通路同樣扮演著重要的角色。成熟的T細 胞 表 達WNT信 號 通 路 分 子LEF1和TCF1［31］。另外LEF1及TCF1在TN受到抗原刺激后降低表達［32］。Gattinoni等［6］發(fā) 現(xiàn)TWS-119（GSK3β抑 制劑）抑制TN細胞向TEFF細胞分化，產(chǎn)生一群CD44lowCD62LhighSca-1highCD122highBcl-2highTSCM。這群細胞能在小鼠體內(nèi)長期生存且在大量增殖后有將近一半的細胞依然保持TSCM的特性。相較于TEM及TCM，TSCM細胞在體內(nèi)具有更加高效的抗腫瘤能力。值得注意的是研究中每只小鼠所注射的T細胞量為5×104，這僅僅是CAR-T常用方案劑量的千分之一。GSK3β抑制劑的使用能夠產(chǎn)生足夠量的TSCM，這為確定人TSCM的表型提供支持。進一步研究發(fā)現(xiàn)，CD95和IL-2Rβ的表達能夠區(qū)分人類的TN及TSCM。TSCM在α-CD3/CD2/CD28微球的刺激下迅速產(chǎn)生IFN-γ、IL-2及TNFα。腹腔注射靶向間皮素的TSCM相較于TEM及TCM明顯延長晚期（模型建立3個月后）腹腔間皮癌小鼠生存期［5］。

mTOR信號通路在TSCM中的作用mTOR是一種調(diào)節(jié)細胞生長的代謝酶。mTOR整合PI3KAKT通路的細胞因子和生長因子信號以及WNTGSK3β等信號，是調(diào)節(jié)代謝的樞紐［33］。雷帕霉素能夠特異性結(jié)合FKBP12蛋白阻斷mTORC1信號通路，是器官移植術(shù)后常用的免疫抑制藥物［34-35］。近年來研究發(fā)現(xiàn)低劑量的雷帕霉素能夠促進TM細胞的 分 化［36-37］。mTOR通 路 中mTORC1、S6K1及eIF4E參與調(diào)控TM的形成，mTOR是直接作用于T細胞從而發(fā)揮調(diào)控作用［36］。研究表明雷帕霉素或WNT激動 劑TWS119對mTORC1的抑制，可以 促進CD4+TSCM和CD8+TSCM細胞的誘導(dǎo)。藥物誘導(dǎo)的TSCM細胞具有優(yōu)越的在體長期增殖能力，WNT信號通路激活劑TWS119同時也抑制mTOR信號通 路［38］。這 與GSK3通 過 磷 酸 化TSC2以 依 賴 于AMPK-引發(fā)磷酸化的方式抑制mTOR途徑類似［39-40］。當 然，TWS119是 否 能 夠 通 過 獨 立 于mTOR信號通路促進TSCM的產(chǎn)生還需要進一步研究。另外，值得注意的是該研究所用的細胞因子為IL-2（300 IU/mL）。聯(lián)合其他促進記憶性T細胞產(chǎn)生及增殖的細胞因子可能進一步增加TSCM的比例，為其臨床轉(zhuǎn)化打下基礎(chǔ)。

表觀遺修飾信號通路調(diào)控誘導(dǎo)TSCM真核細胞的基因組被包裝成被稱為核小體的緊密折疊結(jié)構(gòu)。核小體可以通過控制轉(zhuǎn)錄因子對DNA的可及性來協(xié)調(diào)細胞類型特異性基因表達。在細胞分化過程中，命運決定因子的DNA以及染色質(zhì)獲得了多個層次的表觀修飾［41］。調(diào)控DNA或者組蛋白修飾的小分子藥物能夠加速或者增加iPS的誘導(dǎo)、替代某些轉(zhuǎn)錄因子［14，42］。

Crompton等［43］對 體 外 產(chǎn) 生 的 小 鼠CD8+TCM、TEM和TSCM細 胞 進 行 了H3K4me3和H3K27me3修飾的全基因組分析，發(fā)現(xiàn)TCM和TEM高效富集了包括IFN-γ、GZMB和PRF在 內(nèi) 的 效 應(yīng) 分 子 位點的H3K4me3組蛋白修飾，這使得記憶細胞在再次遇到抗原時能夠迅速表達這些基因。值得注意的是，雖然TSCM在許多檢測到的效應(yīng)分子位點處具有H3K4me3組蛋白修飾，其修飾程度與初始CD8 T細胞相似。Kakaradov等［20］通過單細胞測序發(fā)現(xiàn)，在CD8+TN第一次分裂后產(chǎn)生的子代細胞中，CD8+TE的前體細胞迅速上調(diào)幾百個基因，而CD8+TM的前體細胞則只有幾個特定基因的改變。理論上通過小分子藥物調(diào)節(jié)相關(guān)因子的表觀修飾可以影響T細胞的分化方向。

Kagoya等［44］通過高通量小分子篩選促進TSCM產(chǎn)生表觀遺傳學(xué)修飾靶點。研究發(fā)現(xiàn)JQ1在體外刺激CD8+TN細胞后，TSCM和TCM細胞增加。在體內(nèi)，JQ1處理的細胞表現(xiàn)出更好的細胞生存、細胞增殖能力和細胞因子產(chǎn)生能力。JQ1是含溴結(jié)構(gòu)域蛋白的BET家族的抑制劑。JQ1處理后T細胞減少賴氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子（human basic leucine zipper transcription factor，BATF）表達。通過siRNA沉默BATF增加TSCM和TCM細胞群。這與之前報道的JQ1通過抑制BATF增強沉默信息調(diào)節(jié)因子（Sirtuin1，SIRT1）抑 制T-bet減少TE一致［45-46］。研究中細胞培養(yǎng)方案包括細胞因子為IL-2（100 IU/mL）及IL-15（10 ng/mL）。初始培養(yǎng)細胞為CD3+T細胞，JQ1處理后CD4+TSCM細胞的比例為10%左右。IL-15可以促進TM細胞的增殖。JQ1處理也同時顯著降低T細胞mTOR通路中的S6K蛋白的磷酸化，同時其上游的AKT磷酸化狀態(tài)沒有改變。JQ1對于mTOR通路的作用位點可能在AKT的下游。這提示表觀修飾調(diào)節(jié)小分子藥物對于細胞命運的改變是通過多通路的調(diào)節(jié)而實現(xiàn)。Youngblood等［47］發(fā)現(xiàn)CD8+T細胞中的幼稚相關(guān)基因的甲基化可以逆轉(zhuǎn)從而產(chǎn)生能夠長期生存的CD8 TM細胞。表明記憶T細胞也可能起源于效應(yīng)T細胞。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a（DNA Methyltransferase 3A，DnMt3a）在CD8+T細胞受到刺激后升高［48］。在TE細胞中DnMt3a特異性的靶向幼稚相關(guān)的基因為：Sell（Cd62L），Ccr7以及Tcf7。研究者通過CSFE標記CD62L（-）的T細胞，發(fā)現(xiàn)未分裂的第一代細胞可以通過去除Cd62L基因啟動子的甲基化而重新表達CD62L蛋白［47］。另外的研究［49］表明，調(diào)節(jié)甲基化的TET2的丟失促進記憶性T細胞的產(chǎn)生。

Notch信號通路在TSCM中的作用Notch轉(zhuǎn) 導(dǎo)通路是細胞高度保守的信號通路，參與調(diào)節(jié)不同的祖細胞和干細胞類型的增殖和分化。Notch信號與造血干細胞的維持、T細胞的分化及成熟有關(guān)［50-51］。另外，Notch與IL-2R、mTOR及T-bet形成正 反 饋促 進TE細 胞 的 產(chǎn) 生［52］。在iPS誘 導(dǎo) 方 面，抑 制Notch通路能夠抑制p21從而顯著提高了iPSC的產(chǎn)生［53］。這些信息似乎暗示Notch信號的阻斷可以促進TM的生成。與此相反的是通過OP9-hDLL1系統(tǒng)激 活 人TEM（CD45RA+CD45RO-CCR7+CD95+）Notch信號能夠高效地促進其轉(zhuǎn)變?yōu)門SCM［54］。其潛在機制可能在于NOTCH-FOXM1代謝通路調(diào)控［55］。這也說明，激活狀態(tài)的TEM也可以是TSCM的來源。通過測序發(fā)現(xiàn)，Notch誘導(dǎo)的TSCM的基因表達譜系與TWS119誘導(dǎo)的TSCM最為相似［54］。Notch信號可以促進TH17細胞的長期生存，這說明Notch信號在T細胞應(yīng)答收縮和記憶階段中可能發(fā)揮不同的作用［56］。TSCM轉(zhuǎn)化研究中細胞培養(yǎng)的條件近乎苛刻，OP9-DL1系統(tǒng)、IL-7（10 ng/mL）以及IFN-γ抗體缺一不可。而加入IL-15則顯著減少轉(zhuǎn)化效率。這也提示細胞因子在Notch信號通路T細胞類別轉(zhuǎn)換中扮演重要角色。

細胞因子在TSCM產(chǎn)生中的作用細胞因子全程參與T細胞的發(fā)育、成熟、分化、效應(yīng)和記憶形成［57］。在TSCM的產(chǎn)生中也扮演著至關(guān)重要的作用。近年來，多項研究表明IL-7、IL-15及IL-21能夠增加T細 胞 增殖 及 腫 瘤 殺傷 能 力［58-63］。IL-7及IL-15能夠促進TSCM的產(chǎn)生，另外TSCM在IL-15或IL-7的作用下能夠大量分裂、增殖，而且該組合產(chǎn)生TSCM的效率優(yōu)于TWS119+IL-2［64］。為了培養(yǎng)臨床應(yīng)用級別的TSCM，Gattinoni等［5］采用逐步分離法從外周血中分離TN，培養(yǎng)基中加入5 ng/mL IL-7及30 ng/mL IL-21，9天后TSCM的比例高達52.2%±12.52%，而IL-2組TSCM的比例只有1.2%［5，65］。相較于體細胞，細胞因子對于T細胞的分化、生存及凋亡起著至關(guān)重要的作用。在對T細胞的重新編程、誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化中，必須考慮細胞因子的作用。令人深思的是，IL-2增強抗原誘導(dǎo)的脫中胚蛋白（Eomes）、顆粒酶B和CD44表達促進CD8+TN細胞向CD8+TE細胞分化。IL-21抑制IL-2Rα的表達并抑制IL-2介導(dǎo)的CD8（+）TE細胞表型獲得，但IL-21在過繼免疫治療中顯著增強了抗腫瘤效果［66］，這與IL-21調(diào)控CD8+T細胞表達L-選擇蛋白提高細胞體內(nèi)的增殖有關(guān)。IL-2猶如T細胞之“興奮劑”，使之瘋狂，然后“消耗殆盡”。對于腫瘤或者慢性病毒感染，需要的是“持久的戰(zhàn)斗”，IL-7、IL-15及IL-21所培育出的“戰(zhàn)士”更具耐受性，能夠以一當十。

不對稱分裂與TSCM不對稱分裂是干細胞的特征之一［67］。T細胞在穿越血管內(nèi)皮、與腫瘤組織接觸、輔助細胞和APC接觸以及細胞因子的作用下均可誘導(dǎo)T細胞產(chǎn)生不對稱分裂。通過不對稱分裂子細胞可以獲得不同的命運決定因子從而分化為不同類型的細胞。TN細胞在接觸抗原呈遞細胞（antigen-presenting cells，APC）后產(chǎn)生第一代子細胞：靠近APC的子代細胞分化為TE；遠離APC的分化為TM［68］。這種分化與c-Myc的不對稱分裂有關(guān)。進一步研究表明：Notch、WNT、mTOC、表觀修飾、細胞因子等信號通路均與細胞的不對稱分裂有關(guān)［69-72］。另外，T細胞通過不對稱分裂子代細胞可以獲 得 不 同 的 代 謝方式［69，73-74］。低 表 達mTOC1的子代細胞脂肪代謝能力提高并且能夠在小鼠體內(nèi)長期生存［69］。CD4+細胞在刺激后分裂產(chǎn)生的子代細胞一部分保留了TCF1具有更強的自我更新能力，而另一部分子代細胞由于mTOC1抑制TCF1向終末分化的TE細胞分化［75］。TCR信號的強弱參與T細胞的極化從而引發(fā)不對稱分裂［76］。在IL-5及IL-17存在的條件下高強度的antiCD3刺激促進TN細 胞向TE細胞分化［64］，而 低 強 度 刺 激 可 以 促 進TSCM細 胞 產(chǎn) 生［77-80］。攜 帶 抗 原 肽-MHC復(fù) 合 物 的APC細胞對T細胞的極化是多方面的，具體在什么條件下，哪一方面對于所接觸的幼稚T細胞的分化方向起到?jīng)Q定性的作用還需要進一步研究。另外血管內(nèi)皮細胞、腫瘤細胞等其他類型的細胞對于T細胞極化、不對稱分裂、命運轉(zhuǎn)化的影響也有待探索［81］。

結(jié)語基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、表觀修飾組學(xué)、單細胞測序、基因編輯技術(shù)不斷發(fā)展，通過整合各種信息的綜合分析，新的TSCM命運決定因子會不斷被發(fā)現(xiàn)［82］。目前，對于TSCM的轉(zhuǎn)化研究多為體外研究，值得注意的是誘導(dǎo)產(chǎn)生的iTSCM與自然狀態(tài)的TSCM不 同：TWS119及NOTCH誘 導(dǎo) 的TSCM更 多 地表達IFN-γ、IFN-α、mTORC1信號基因，更少表達NF-κB導(dǎo) 致 的TNFα信 號、缺 氧 信 號、TGF-β信號［54］。對于TSCM在體內(nèi)如何產(chǎn)生，其長期生存的位置是位于骨髓、淋巴結(jié)還是其他部位需要進一步的研究。綜合目前的研究結(jié)果，多數(shù)證據(jù)支持幼稚T細胞在接觸APC細胞活化時在特定的細胞因子組合情況下通過不對稱分裂產(chǎn)生保持一定幼稚T細胞特性的活化的TSCM（圖1）。

圖1 體內(nèi)產(chǎn)生的TSCM關(guān)鍵因素Fig 1 Key factors that determine differentiation and generation of Stem cell-like memory T cells in vivo

未來我們在運用各種組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)TSCM產(chǎn)生的關(guān)鍵因子基礎(chǔ)上，通過納米材料技術(shù)等人工合成促進TSCM的微環(huán)境、基因編輯技術(shù)、小分子藥物、相關(guān)細胞因子調(diào)控細胞分化命運，能夠創(chuàng)造出更加適應(yīng)腫瘤微環(huán)境、安全、長效的TSCM應(yīng)用于實體腫瘤的治療［83-84］。

作者貢獻聲明楊敏捷論文撰寫和修訂，制圖。王小林論文構(gòu)思和審校。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。