利用超微量光度計評價脂肪組織總RNA提取方法的改進(jìn)效果

何 萍 徐春陽 馬 鵬 王子婧 侯碧玉 強(qiáng)桂芬 * 杜冠華*

(1.中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院，深圳 518033； 2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室，北京 100050；3. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院，北京 100026)

RNA的分離和鑒定對于研究組織特異性基因表達(dá)以及探究多種細(xì)胞調(diào)控過程具有重要意義。RNA提取過程中易于受到基因組DNA、蛋白質(zhì)以及苯酚等的污染，影響RNA質(zhì)量，從而直接影響實驗結(jié)果。因此，為了利用RNA進(jìn)行基因表達(dá)和調(diào)控等相關(guān)研究且得到可靠的研究數(shù)據(jù)，提取得到高產(chǎn)量、高純度的RNA至關(guān)重要。

脂肪組織是一種重要的能量調(diào)控和分泌器官，主要分為白色脂肪組織(white adipose tissue, WAT)和棕色脂肪組織(brown adipose tissue, BAT)。脂肪細(xì)胞是脂肪組織的主要組成成分，分布于由結(jié)締組織纖維構(gòu)成的松散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。白色脂肪細(xì)胞是一種球形的單房細(xì)胞，由甘油三酯組成的單個脂滴占細(xì)胞體積的90%以上，并含有細(xì)長的，數(shù)量可變的線粒體，主要負(fù)責(zé)儲存能量。相比之下，棕色脂肪細(xì)胞通常是具有可變直徑的多邊形的多房細(xì)胞，含有多個大小不一的脂滴，線粒體豐富，血管化程度高，通過非震顫產(chǎn)熱耗散能量[1, 2]。白色脂肪組織又可分為內(nèi)臟脂肪組織(visceral adipose tissue, VAT)和皮下脂肪組織(subcutaneous adipose tissue, SAT)。內(nèi)臟脂肪組織含有許多致病性的大脂肪細(xì)胞，而皮下脂肪組織則含有更多小脂肪細(xì)胞，這些小脂肪細(xì)胞對胰島素更敏感，更易于吸收游離脂肪酸和甘油三酯，防止它們在非脂肪組織中沉積。此外，與皮下脂肪組織相比，內(nèi)臟脂肪組織具有更多的血管、更豐富的血液供應(yīng)和更強(qiáng)的神經(jīng)支配[3]。研究顯示，內(nèi)臟脂肪組織的過度堆積與肥胖、糖尿病以及心血管疾病發(fā)病率的升高密切相關(guān)[4]。然而皮下脂肪組織的增加顯示出較小的代謝危險性，甚至可能具有保護(hù)作用[5, 6]。由于脂肪組織組成成分的特殊性，單位體積的脂肪組織中RNA含量較少，且小鼠的脂肪組織較少，常規(guī)用于致密性組織RNA提取的方法較難獲得高質(zhì)量的脂肪組織RNA，常需通過加大樣本量或試劑用量，延長裂解時間才能獲得所需RNA[7]，造成了較大的樣品及試劑浪費，且RNA質(zhì)量不好往往影響實驗結(jié)果。基于此，本研究以小鼠脂肪組織為材料，通過比較不同的組織破碎方法并優(yōu)化后續(xù)提取步驟，對脂肪組織RNA的提取方法進(jìn)行了改進(jìn)，采用超微量分光/熒光光度計對RNA質(zhì)量進(jìn)行評價，從而獲得符合科研要求的高得率、高質(zhì)量的脂肪組織總RNA。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑

戊巴比妥鈉(P3761)、TRIzol(TR201)、無水乙醇(色譜級)；RNA提取試劑盒(R2052)；OMNI Bead Ruptor 24多功能研磨珠均質(zhì)器；手持式勻漿機(jī) (F6/10)；DS-11FX/FX+超微量分光/熒光光度計。

1.2 實驗動物

8周齡C57BL/6N雄性小鼠，體重22～24 g，購于某實驗動物技術(shù)有限公司(SPF級，許可證編號SCXK(京) 2016-0006)，動物福利和實驗過程均遵循中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物倫理委員會的規(guī)定。

1.3 脂肪組織取材

小鼠腹腔注射0.45%戊巴比妥鈉(45mg·kg-1)麻醉，下腔靜脈取血，隨后分別于附睪區(qū)取出內(nèi)臟脂肪組織，于腹股溝區(qū)取出皮下脂肪組織，于肩胛骨區(qū)取出棕色脂肪組織，液氮凍存。

1.4 總RNA提取

1.4.1脂肪組織破碎

1.4.1.1多功能研磨珠均質(zhì)器脂肪組織破碎

(1)于研磨管中加入5顆研磨珠并加入700 μL TRIzol，置于冰上，加入約50 mg內(nèi)臟脂肪組織，或30 mg皮下脂肪組織，或20 mg棕色脂肪組織。

(2)于多功能研磨珠均質(zhì)器中進(jìn)行脂肪組織研磨，研磨速度6.00 m/s，研磨5次，每次8 s。研磨結(jié)束觀察勻漿液均勻，無塊狀組織。

1.4.1.2 手持式勻漿機(jī)脂肪組織破碎

(1)于4 mL EP管中加入700 μL TRIzol，置于冰上，加入約50 mg內(nèi)臟脂肪組織，或30 mg皮下脂肪組織，或20 mg棕色脂肪組織。

(2)應(yīng)用手持式勻漿機(jī)對置于冰上的脂肪組織進(jìn)行研磨，研磨速度5000轉(zhuǎn)/分，每次30 s，等待10 s，研磨5次，研磨結(jié)束觀察勻漿液均勻，無可見塊狀組織。

1.4.2脂肪組織總RNA提取

(1)4℃，12000 r·min-1，離心5 min。

(2)取不含油脂上清液，加入等量無水乙醇，混勻，4℃，12000轉(zhuǎn)/分，離心1 min。

(3)取上清液，加入連有收集管的過濾柱中，12000轉(zhuǎn)/分，常溫離心1 min。

(4)換新的收集管，于過濾柱中加入400 μL RNA PreWash緩沖液，12000轉(zhuǎn)/分，常溫離心30 s。

(5)棄去收集管中液體，重復(fù)步驟(4)。

(6)棄去收集管中液體，于過濾柱中加入700 μL RNA Wash緩沖液，靜置2 min，12000轉(zhuǎn)/分，常溫離心30 s。

(7)棄去收集管中液體，12000轉(zhuǎn)/分，常溫離心2 min。

(8)將過濾柱轉(zhuǎn)移至1.5 mL無菌EP管中，于過濾柱中滴加25 μL無核酸酶水，室溫靜置5 min。13000轉(zhuǎn)/分，室溫離心1 min，將EP管置于冰上待測。

1.5 RNA質(zhì)量檢測和定量

采用超微量分光/熒光光度計進(jìn)行所提取RNA 的質(zhì)量檢測和定量。該儀器使用分光光度法，參照不同分子的吸收特性進(jìn)行吸光度的測定，以獲得樣品中特定分子的存在和含量情況。

(1)開機(jī)后，選擇RNA模式，使用干燥的實驗室擦拭用紙仔細(xì)清潔樣品放置處，吸取1μL提取時使用的無核酸酶水到樣品測量尖端，閉合臂，點擊blank進(jìn)行校準(zhǔn)，儀器運行完成后吸去液體。

(2)小心吸移1μL樣品到測量尖端，閉合臂后點擊sample進(jìn)行測量，讀取RNA濃度值和A260/230、A260/280的比值并記錄，立即仔細(xì)擦拭后繼續(xù)進(jìn)行下一樣品的測量。全部測量完成后再次清理儀器，退出程序并關(guān)閉電源。

(3)A260/230和A260/280比值一般分別被用來檢測核酸樣品中的有機(jī)物和蛋白質(zhì)污染，其正常值應(yīng)分別為：接近2.0，處于1.8～2.1之間。過低的A260/230(低于1.8)表明樣品中有較為嚴(yán)重的有機(jī)物污染，而A260/280比值較低表明樣品中含有蛋白質(zhì)污染。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)臟脂肪組織總RNA提取方法比較

與皮下脂肪組織和棕色脂肪組織相比，內(nèi)臟脂肪組織含有更多的大脂肪細(xì)胞，脂質(zhì)含量更為豐富，而RNA含量相對較少，因而增加了內(nèi)臟脂肪組織總RNA提取的難度[3]。本研究首先利用多功能研磨珠均質(zhì)器對內(nèi)臟脂肪組織進(jìn)行破碎，然后進(jìn)行后續(xù)RNA提取工作。結(jié)果如表1所示，該方法提取出的總RNA濃度較低，不利于進(jìn)行后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄操作，且A260/230數(shù)值較低，表明存在一定程度的有機(jī)物污染問題。接下來，我們改用手持式勻漿機(jī)對內(nèi)臟脂肪組織進(jìn)行破碎，并在后續(xù)RNA提取過程中延長RNA Wash緩沖液洗脫時間。由表1列出的實驗結(jié)果可知，通過方法的改進(jìn)，提取得到的內(nèi)臟脂肪組織總RNA的濃度明顯升高，得率穩(wěn)定，并且質(zhì)量良好，極大地減少了有機(jī)物類等的污染。

表1 兩種方法提取內(nèi)臟脂肪組織總RNA的質(zhì)量比較

2.2 皮下脂肪組織總RNA提取方法比較

脂肪組織是一種特殊的結(jié)締組織，并且在3種脂肪組織中，皮下脂肪組織中結(jié)締組織纖維含量最為豐富。研究顯示，腹部和臀部的皮下脂肪組織皆富含纖維結(jié)構(gòu)，且老年個體與年輕個體相比，皮下脂肪中較粗的結(jié)締組織網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)增加，脂肪細(xì)胞周圍結(jié)締組織網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)增厚[8]。由于結(jié)締組織基質(zhì)的存在，使得皮下脂肪組織在RNA提取過程中較難完全破碎，從而影響總RNA的得率與質(zhì)量。本研究首先應(yīng)用多功能研磨珠均質(zhì)器對皮下脂肪組織進(jìn)行破碎，再進(jìn)行RNA提取。實驗結(jié)果如表2所示，通過該方法得到的總RNA濃度較低，得率差異較大，且RNA質(zhì)量不佳，難以用于后續(xù)科學(xué)研究。隨后，實驗使用手持式勻漿機(jī)進(jìn)行皮下脂肪組織破碎，并進(jìn)行RNA提取。如表2所示，應(yīng)用該方法獲得的總RNA濃度較高，得率較為穩(wěn)定，且質(zhì)量較好，能夠滿足后續(xù)科學(xué)研究要求。

表2 兩種方法提取皮下脂肪組織總RNA的質(zhì)量比較

2.3 棕色脂肪組織總RNA提取

與白色脂肪組織相比，棕色脂肪組織含有多腔脂滴結(jié)構(gòu)，富含線粒體，血管密集，結(jié)構(gòu)較為致密[9]，因此相較于白色脂肪組織更易于提取總RNA。我們分別應(yīng)用多功能研磨珠均質(zhì)器和手持式勻漿機(jī)對棕色脂肪組織的總RNA進(jìn)行了提取。如表3所示，通過兩種提取方法獲得的總RNA均濃度較高，質(zhì)量較好，能夠應(yīng)用于后續(xù)研究，因此這兩種方法皆可以用于棕色脂肪組織總RNA的提取。

表3 兩種方法提取棕色脂肪組織總RNA的質(zhì)量比較

3 討論

脂肪組織是機(jī)體中一種重要的調(diào)節(jié)及分泌器官，它對于機(jī)體的營養(yǎng)供應(yīng)及適應(yīng)環(huán)境溫度變化具有重要作用。脂肪組織功能紊亂是導(dǎo)致肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病和心血管疾病的主要危險因素[10]。因此，對于脂肪組織的深入研究對于治療代謝性疾病和心血管疾病，維持機(jī)體健康具有重要意義。脂肪組織主要由成熟的脂肪細(xì)胞組成，并富含結(jié)締組織纖維，因而脂質(zhì)含量高，組織韌性大，單位體積細(xì)胞數(shù)量和RNA含量相對較少[7]，因此難于從脂肪組織中提取得到高質(zhì)量總RNA。

為了獲得符合科學(xué)研究要求的高得率、高質(zhì)量脂肪組織總RNA，本研究對組織總RNA的常規(guī)提取方法進(jìn)行了比較與改進(jìn)，并利用超微量分光/熒光光度計進(jìn)行RNA質(zhì)量檢測。由于組織細(xì)胞破碎是提取組織RNA的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，破碎的完全程度能夠直接影響所提取獲得的組織總RNA的產(chǎn)量和質(zhì)量，因此我們分別使用了多功能研磨珠均質(zhì)器和手持式勻漿機(jī)對小鼠脂肪組織進(jìn)行了破碎處理。實驗結(jié)果顯示，由于手持式勻漿機(jī)操作可控性更強(qiáng)，機(jī)械性能好，使得破碎更為充分，因而適用于內(nèi)臟脂肪組織和皮下脂肪組織總RNA的提取。而多功能研磨珠均質(zhì)器由于操作簡便，省時省力，因而更適用于較為致密的棕色脂肪組織總RNA的提取。除此之外，RNA提取過程中容易發(fā)生有機(jī)物類及蛋白質(zhì)污染，嚴(yán)重影響RNA質(zhì)量，因此本研究也對脂肪組織總RNA提取試劑盒的提取步驟進(jìn)行了優(yōu)化，延長Wash buffer的保留時間，清除殘留的有機(jī)物類污染，從而得到高得率、高質(zhì)量的總RNA。

綜上所述，本研究通過比較和改進(jìn)傳統(tǒng)組織總RNA提取方法，優(yōu)化了適用于小鼠脂肪組織總RNA的提取方法，其優(yōu)點為節(jié)省脂肪組織用量，獲得的脂肪組織總RNA產(chǎn)量高，質(zhì)量好，能夠滿足脂肪組織基因表達(dá)和調(diào)控等相關(guān)研究的要求，獲得滿意的實驗結(jié)果。