芪箭消癭方對(duì)自身免疫性甲狀腺炎大鼠甲狀腺炎癥損傷的作用

牧亞峰， 左新河,*， 向 楠,*， 趙 勇， 華 川,， 陳繼東,

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430061；2.湖北省中醫(yī)院甲狀腺疾病診療中心，湖北 武漢 430074)

自身免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT)，也稱(chēng)為橋本甲狀腺炎，是最常見(jiàn)的自身免疫性甲狀腺疾病。流行病學(xué)調(diào)查顯示，AIT患病率為0.03%～0.15%[1],已成為導(dǎo)致原發(fā)性甲狀腺功能減退癥的首要因素[2]。目前，本病尚沒(méi)有特效藥物，病情進(jìn)展為甲減可能需要甲狀腺激素終生替代治療，因此，亟待需要尋找有效的防治方法。

AIT的發(fā)生涉及一系列復(fù)雜的致病機(jī)制，主要與甲狀腺自身抗體介導(dǎo)、細(xì)胞因子失衡、細(xì)胞凋亡等病理過(guò)程有關(guān)。Toll樣受體4(toll like receptor 4，TLR4)是甲狀腺細(xì)胞上廣泛存在的模式識(shí)別受體，可通過(guò)識(shí)別結(jié)合內(nèi)源性分子激活先天免疫應(yīng)答[3]。經(jīng)配體刺激的TLR4可與下游的髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)結(jié)合，導(dǎo)致核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)激活并產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，對(duì)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)過(guò)程起重要作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，TLRs及下游靶標(biāo)MyD88在A(yíng)IT患者外周血單個(gè)核細(xì)胞及血清中高表達(dá)[5]。正常大鼠甲狀腺細(xì)胞有TLR4及其輔助分子的表達(dá)[6]，該證據(jù)表明甲狀腺細(xì)胞具有激活先天免疫反應(yīng)的能力。由此提示，TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的激活可能參與AIT的發(fā)病機(jī)制。

芪箭消癭方是全國(guó)名中醫(yī)陳如泉教授治療AIT的經(jīng)驗(yàn)方，具有較好的臨床療效。本課題前期研究[7]發(fā)現(xiàn)芪箭消癭方能夠降低AIT小鼠TGAb、TPOAb水平，減輕甲狀腺組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，改善免疫紊亂狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，圍繞TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路探討芪箭消癭方對(duì)AIT大鼠作用的潛在機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)6周齡雌性SD大鼠48只，體質(zhì)量 (110±10) g，由三峽大學(xué)提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(鄂)2017-0012，飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度 (23±2) ℃，相對(duì)濕度 (55±10)%，晝夜明暗12 h/12 h，自由攝食飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物 芪箭消癭方主要組方藥材為黃芪30 g、白芍15 g、鬼箭羽15 g、穿山龍15 g(江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，由湖北省中醫(yī)院中藥配方顆粒藥房調(diào)配)。硒酵母片(牡丹江靈泰藥業(yè)有限公司，批號(hào)H10940161)。

1.3 試劑 豬甲狀腺球蛋白、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)分別為180801、F5881、F5506)；FT3、FT4、IFN-γ、TNF-α試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為0079c、0122c、R0009c、R2856c)；TPOAb試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)E11199r)；TGAb試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司，批號(hào)R0551)；Trizol(美國(guó)Ambion公司，批號(hào)15596-026)；HiScript Reverse Transcriptase、SYBR Green Master Mix for qPCR(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為R101-01/02、Q111-02)；TLR4、NF-κB p65抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為19811-1-AP、13409-1-AP)；MyD88抗體(武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司，批號(hào)A0980)；IKKβ、p-IKKβ(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為4880R、3232R)；β-actin、山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)分別為BM0627、BA1051、BA1054)。

1.4 儀器 離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)MD公司)；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠(chǎng))；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 造模 采用高碘水喂養(yǎng)聯(lián)合皮下注射豬甲狀腺球蛋白與弗氏佐劑誘導(dǎo)建立AIT大鼠模型[8]。適應(yīng)性喂養(yǎng)后，自實(shí)驗(yàn)第2～7周分別于大鼠皮下多點(diǎn)予以2次初次免疫、4次加強(qiáng)免疫，每周1次，每次注射豬甲狀腺球蛋白100 μg/只，同時(shí)給予碘化鈉水(0.64 g/L)喂養(yǎng)，造模期間大鼠自由飲水。

2.2 分組及給藥 48只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、硒酵母組及芪箭消癭方低、中、高劑量組，每組8只。自實(shí)驗(yàn)第7周開(kāi)始，對(duì)照組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，硒酵母組大鼠給予硒酵母混懸液(36 μg/kg)灌胃，芪箭消癭方低、中、高劑量組大鼠分別給予芪箭消癭方(1.8、3.6、7.2 g/kg)灌胃，每天1次，連續(xù)6周，于實(shí)驗(yàn)第12周結(jié)束后取材，劑量按大鼠與人等效劑量折算系數(shù)換算。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 ELISA法 大鼠采血后靜置1～2 h，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取得血清，按照相關(guān)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)FT3、FT4、TGAb、TPOAb、TNF-α、IFN-γ水平。

2.3.2 HE染色 大鼠采血后冰上快速分離氣管兩側(cè)甲狀腺組織，一部分置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，另一部分浸泡?%多聚甲醛中固定，制成4 μm厚切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，在顯微鏡下觀(guān)察拍照。參照Verginis等[9]制定的甲狀腺組織炎癥評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行打分，具體為0分，無(wú)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；1分，2個(gè)或3個(gè)甲狀腺濾泡之間的間質(zhì)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；2分，1個(gè)或2個(gè)甲狀腺濾泡大小的浸潤(rùn)灶；3分，廣泛浸潤(rùn)面積達(dá)10%～40%；4分，廣泛浸潤(rùn)面積達(dá)40%～80%；5分，廣泛浸潤(rùn)面積達(dá)80%以上。

2.3.3 RT-qPCR法 Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-qPCR法檢測(cè)待測(cè)基因，反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析，采用2-ΔΔCT法計(jì)算數(shù)據(jù)，以β-actin為內(nèi)參基因，引物由武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成提供，序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.3.4 Western blot法 取剪碎的大鼠甲狀腺組織，加入含磷酸酶抑制劑的裂解液后勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液，檢測(cè)蛋白濃度。制備10% SDS-PAGE凝膠，蛋白上樣，電泳分離轉(zhuǎn)膜，TBST封閉，將膜浸泡于稀釋后的一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，浸入稀釋后的二抗(1∶50 000)，37 ℃孵育2 h，ECL顯影曝光，掃描膠片，BandScan軟件分析條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1 芪箭消癭方對(duì)大鼠血清FT3、FT4水平的影響 如圖1所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清FT3、FT4水平增加(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組大鼠血清FT3、FT4水平減少(P<0.05，P<0.01)。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖1 各組大鼠血清FT3、FT4水平Fig.1 Serum FT3 and FT4 levels of rats in each group

3.2 芪箭消癭方對(duì)大鼠甲狀腺組織病理的影響 如圖2A所示，對(duì)照組大鼠甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)規(guī)則，呈類(lèi)圓形或多邊形，濾泡上皮細(xì)胞呈單層立方形，排列整齊，濾泡腔內(nèi)充滿(mǎn)膠質(zhì)，濾泡間隙未見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞呈扁平狀，大部分濾泡結(jié)構(gòu)破壞萎縮，可見(jiàn)彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；硒酵母組大鼠甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞排列尚整齊，濾泡腔萎縮，膠質(zhì)水平減少，可見(jiàn)吸收空泡；芪箭消癭方各劑量組大鼠甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)完整性改善，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，病變程度有所減輕。如圖2B所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠甲狀腺組織炎癥評(píng)分增加(P<0.01)，而各給藥組大鼠甲狀腺組織炎癥評(píng)分較模型組降低(P<0.01)。

注：箭頭處為淋巴細(xì)胞聚集。與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖2 各組大鼠甲狀腺組織形態(tài)學(xué)變化 (HE，×100)Fig.2 Histological changes of rat thyroid in each group (HE，×100)

3.3 芪箭消癭方對(duì)大鼠血清TGAb、TPOAb水平的影響 如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清TGAb、TPOAb水平升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組大鼠血清TGAb、TPOAb水平降低(P<0.05，P<0.01)。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖3 各組大鼠血清TGAb、TPOAb水平Fig.3 Serum TGAb and TPOAb levels of rats in each group

3.4 芪箭消癭方對(duì)大鼠血清IFN-γ、TNF-α水平的影響 如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清IFN-γ、TNF-α水平升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組大鼠血清IFN-γ、TNF-α水平降低(P<0.05)。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖4 各組大鼠血清IFN-γ、TNF-α水平Fig.4 Serum IFN-γ and TNF-α levels of rats in each group

3.5 芪箭消癭方對(duì)大鼠甲狀腺組織TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA表達(dá)的影響 如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠甲狀腺組織TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，硒酵母組及芪箭消癭方中、高劑量組大鼠甲狀腺組織TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA表達(dá)降低(P<0.01)。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖5 各組大鼠甲狀腺組織TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA表達(dá)Fig.5 mRNA expressions of TLR4, MyD88 and NF-κB p65 of rat thyroid tissue in each group

3.6 芪箭消癭方對(duì)大鼠甲狀腺組織TLR4/MyD88/NF-κB相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響 如圖6所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠甲狀腺組織TLR4、MyD88、IKKβ、p-IKKβ、NF-κB p65蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，硒酵母組及芪箭消癭方中、高劑量組大鼠甲狀腺組織TLR4、MyD88、IKKβ、p-IKKβ、NF-κB p65蛋白表達(dá)降低(P<0.01)。

注：A為蛋白條帶，B為蛋白表達(dá)。與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖6 各組大鼠甲狀腺組織TLR4/MyD88/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.6 Expressions of TLR4/MyD88/NF-κB pathway related proteins in rat thyroid tissues of each group

4 討論

自身免疫性甲狀腺炎(AIT)是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的器官特異性自身免疫性疾病，表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)甲狀腺，導(dǎo)致甲狀腺細(xì)胞凋亡，并伴有TGAb、TPOAb的產(chǎn)生。異原性抗原免疫法通過(guò)攝入過(guò)量碘或甲狀腺球蛋白免疫，可使易感大小鼠品系輕松誘發(fā)，是國(guó)際公認(rèn)的AIT經(jīng)典模型之一[10]。本研究模型組大鼠TGAb、TPOAb水平升高，甲狀腺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞且炎癥評(píng)分增高，表明AIT動(dòng)物模型誘導(dǎo)成功。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)多中心、前瞻性研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)硒治療可以有效降低AIT患者TPOAb水平[11]。目前，硒酵母廣泛應(yīng)用于A(yíng)IT的臨床治療，故將其作為陽(yáng)性對(duì)照藥。給予芪箭消癭方后，大鼠血清中TGAb、TPOAb水平及炎癥評(píng)分降低，甲狀腺組織炎癥浸潤(rùn)有不同程度改善，這與前期研究[7]結(jié)果基本一致。當(dāng)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞因炎癥破壞后，儲(chǔ)存在濾泡中的大量甲狀腺激素釋放入血，F(xiàn)T3、FT4可一過(guò)性升高[12]，這一現(xiàn)象也在本實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)[13]中得到證實(shí)。經(jīng)芪箭消癭方干預(yù)后，F(xiàn)T3、FT4水平下降。有研究表明穿山龍有降低FT3、FT4的作用[14]，說(shuō)明芪箭消癭方對(duì)AIT大鼠甲狀腺功能的抑制作用可能與方中穿山龍的藥理作用有關(guān)。

TNF-α和IFN-γ是Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答過(guò)程中釋放的關(guān)鍵細(xì)胞因子[15]，而Th1/Th2細(xì)胞因子失衡在A(yíng)IT的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，以Th1細(xì)胞因子占主導(dǎo)地位[16-17]。TNF-α是炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的主要介質(zhì)，與IFN-γ廣泛存在于A(yíng)IT甲狀腺慢性炎癥環(huán)境中[18]。二者協(xié)同作用不僅可以持續(xù)加強(qiáng)AIT的病理過(guò)程，還可通過(guò)甲狀腺細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)甲狀腺組織炎癥損傷[19]。研究發(fā)現(xiàn)，阻斷TNF-α能夠調(diào)節(jié)AIT大鼠甲狀腺促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生及細(xì)胞凋亡的表達(dá)，有助于甲狀腺組織炎癥消退并抑制其纖維化[20]。本研究模型組大鼠血清TNF-α、IFN-γ水平升高，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。芪箭消癭方干預(yù)后，促炎細(xì)胞因子水平降低，這和其他中藥研究結(jié)果相似[21]。

炎癥反應(yīng)是免疫系統(tǒng)與受損組織之間相互作用的結(jié)果，而TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路則在機(jī)體炎癥與免疫的調(diào)節(jié)中扮演重要角色[22,4]。TLR4是人類(lèi)目前研究最深入的TLRs之一，可通過(guò)識(shí)別脂多糖、DNA片段等內(nèi)源性分子與胞內(nèi)的MyD88結(jié)合啟動(dòng)依賴(lài)性途徑[23]；NF-κB是引發(fā)下游炎癥的關(guān)鍵因素,下游的IKKβ磷酸化后激活I(lǐng)KK，促使NF-κB移位進(jìn)入細(xì)胞核，最終促使TNF-α、IFN-γ等促炎因子表達(dá)[24]。而TNF-α又能夠反過(guò)來(lái)激活NF-κB，啟動(dòng)TNF-α的轉(zhuǎn)錄，形成環(huán)路加重炎癥損傷[25]。體外研究證實(shí)TLR4可在FRTL-5細(xì)胞中表達(dá)，并能通過(guò)識(shí)別脂多糖活化NF-κB[26]。后又有學(xué)者通過(guò)刺激甲狀腺細(xì)胞上的TLR4而促進(jìn)促炎因子的表達(dá)[27]。祁崗等[28]發(fā)現(xiàn)AIT大鼠中NF-κB通路的持續(xù)激活可啟動(dòng)Bcl-2和ICAM-1基因表達(dá)，促使炎癥細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)甲狀腺組織。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠甲狀腺組織中TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因及其蛋白表達(dá)升高，表明該通路被激活。給予藥物干預(yù)后，硒酵母組及芪箭消癭方中、高劑量組TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因及其蛋白表達(dá)降低，表明該信號(hào)通路被抑制。李嫚等[29]也發(fā)現(xiàn)中藥制劑夏枯草膠囊可通過(guò)抑制AIT大鼠NF-κB信號(hào)通路的活化，改善甲狀腺功能并減輕甲狀腺組織炎癥反應(yīng)。

AIT在中醫(yī)學(xué)中屬“癭病”范疇，病因多與先天稟賦、體質(zhì)因素、水土因素等有關(guān)。主要病機(jī)為氣郁化火傷及氣陰，遷延日久耗傷正氣，形成氣陰兩虛，氣滯、痰濁、瘀血結(jié)于頸前而成。本病存在虛實(shí)夾雜之象，治宜標(biāo)本兼治；只用益氣扶正，則有形之邪難消；單用活血化痰之藥，難收正本清源之效。因此陳如泉教授主張益氣養(yǎng)陰、活血化痰聯(lián)合應(yīng)用，使病因消失、病理產(chǎn)物清除，達(dá)到正復(fù)邪祛[30]，并根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)及國(guó)內(nèi)外研究成果設(shè)立芪箭消癭方，重用甘溫之黃芪為君以益氣扶正；臣以白芍柔肝斂陰；佐以鬼箭羽活血行氣；穿山龍活血之余兼能化痰，共奏益氣養(yǎng)陰，化痰活血之功。

綜上所述，芪箭消癭方可能通過(guò)調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，改善甲狀腺組織炎癥損傷，起到保護(hù)甲狀腺的作用。然而，對(duì)于芪箭消癭方調(diào)節(jié)免疫降低抗體水平的其他可能機(jī)制以及如何通過(guò)復(fù)雜通路減少細(xì)胞凋亡來(lái)改善甲狀腺炎癥損傷，仍需進(jìn)一步研究。