孫貝貝， 孫海英， 朱偉豪， 洪 浩， 洪智慧， 杜偉鋒,*， 葛衛(wèi)紅， 李昌煜

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 311402；2.浙江省臺(tái)州醫(yī)院，浙江 臺(tái)州 317000；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制技術(shù)研究中心，浙江 杭州 311401；4.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院，浙江 杭州 310053)

薏苡仁為禾本科植物薏苡Coixlacrma-jobiL. var.mayuen(Roman.)Stapf的干燥成熟種仁，甘、淡、涼，歸脾、胃、肺經(jīng)[1]。作為一種藥食兩用的常用中藥，薏苡仁具有利水消腫、滲濕止瀉、健脾、除痹、解毒散結(jié)之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，薏苡仁具有抗腫瘤、提高免疫力、抗炎、降血糖等藥理作用[2-4]，常用于治療腫瘤性疾病、免疫性疾病、關(guān)節(jié)炎、高血糖等病癥[5-9]。薏苡仁中主要化學(xué)成分是脂肪酸及其酯類[10-11]、生物堿[12]、三萜類[12-13]、甾醇類、糖類化合物[14-15]。其中因薏苡仁中含有大量脂肪油，脂肪酸及其酯類成為薏苡仁中主要的化學(xué)成分。現(xiàn)代研究表明，油脂類成分在抗腫瘤方面發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。目前藥典標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定只有甘油三油酸酯單一成分含量測(cè)定，且薏苡仁生品和麩炒薏苡仁的限度要求一致，難以體現(xiàn)出炮制特色。

中藥指紋圖譜能夠較為全面的反映中藥化學(xué)成分的種類和數(shù)量，能從整體上體現(xiàn)中藥的內(nèi)在質(zhì)量。中藥譜效關(guān)系的研究旨在將中藥中復(fù)雜的化學(xué)成分與藥效相結(jié)合，通過(guò)二者之間的關(guān)聯(lián)度反映化學(xué)成分與藥效數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性，從而確定中藥中不同化學(xué)成分對(duì)藥效的貢獻(xiàn)度大小，從而研究與藥效相關(guān)的化學(xué)成分。

中藥炮制作為中藥的一大特色，具有增強(qiáng)藥物療效，降低毒副作用，純凈藥材，改變藥物的性能功效，便于儲(chǔ)存，引藥入經(jīng)，最大限度發(fā)揮藥材本身的功效。麩炒作為中藥炮制方法的一種，可增強(qiáng)藥物的健脾療效，金傳山等[16]通過(guò)小鼠抗疲勞實(shí)驗(yàn)及建立大黃脾虛小鼠模型，考察蒼術(shù)不同炮制品對(duì)小鼠健脾作用的影響，得出麩炒品健脾作用明顯，李爽等[17]通過(guò)研究薏苡仁及其麩炒品對(duì)動(dòng)物胃腸動(dòng)力的影響，發(fā)現(xiàn)薏苡仁麩炒品健脾作用強(qiáng)于生品，說(shuō)明炮制后藥效增強(qiáng)，但目前薏苡仁質(zhì)量控制僅規(guī)定單一成分含量，針對(duì)其麩炒前后的多成分譜效關(guān)系研究，尚未見報(bào)道。本研究從麩炒前后薏苡仁指紋圖譜與治療脾虛水濕不化藥效入手，采用灰色關(guān)聯(lián)度法對(duì)譜效關(guān)系進(jìn)行研究，旨在比較麩炒前后薏苡仁指紋圖譜與藥效的關(guān)聯(lián)度，為后續(xù)研究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 BIOBASE-EL10A博科酶標(biāo)儀(濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)；華興HX-T電子秤(杭州三里亭電子秤行)；NT-xs105電子分析天平(0.01 mg，瑞士Mettler-Toledo公司)；DFD-700電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；U3000高效液相色譜儀(美國(guó)Dionex公司)，配置四元梯度泵、在線真空脫氣機(jī)自動(dòng)進(jìn)樣器恒溫柱箱、變色龍譜數(shù)據(jù)工作站；林恩3000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；MIL-SYN型超純水儀(美國(guó)Milipore公司)。

1.2 對(duì)照品 甘油三亞油酸酯(純度99.8%，批號(hào)G601535)、甘油二亞油酸酯(純度99.8%，批號(hào)D460610)、棕櫚酸二亞油酸甘油酯(純度99.8%，批號(hào)D460615)、亞油酸二油酸甘油酯(純度99.8%，批號(hào)D482250)、棕櫚酸二油酸甘油酯(純度99.8%，批號(hào)D484205)、1,3-二棕櫚酸-2-油酸甘油酯(純度99.8%，批號(hào)D486845)購(gòu)自加拿大多倫多研究化學(xué)公司；棕櫚酸亞油酸甘油酯(純度≥98%，批號(hào)SLBX4380)購(gòu)自瑞典Larodan公司；甘油三油酸酯(純度99.6%，批號(hào)111692-202007)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；1,3-二棕櫚酸-2-亞油酸甘油酯(純度99.8%，批號(hào)34-1618-7)購(gòu)自德國(guó)西格瑪奧德里奇公司。

1.3 試劑 大鼠胃泌素(GAS)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、大鼠胃動(dòng)素(MTL)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、大鼠血管活性腸肽(VIP)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、大鼠生長(zhǎng)抑素(SS)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。乙腈、二氯甲烷、異丙醇(美國(guó)Tedia公司)為色譜純；水為超純水。

1.4 藥材 薏苡仁、麩炒薏苡仁飲片(生薏苡仁飲片5批，編號(hào)YXS-1～YXS-5；麩炒薏苡仁飲片5批，編號(hào)YXC-1～YXC-5)購(gòu)自山東百味堂藥業(yè)、四川康泉堂藥業(yè)、安徽鶴年堂藥業(yè)、遵義銀花藥業(yè)、安順寶林科技及浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司等國(guó)內(nèi)正規(guī)中藥飲片企業(yè)，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)葛衛(wèi)紅教授鑒定為正品。

1.5 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(浙)2018-0012，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，光亮/黑暗條件12 h/12 h。

2 方法

2.1 麩炒前后薏苡仁指紋圖譜建立

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取甘油三亞油酸酯、甘油二亞油酸酯、棕櫚酸二亞油酸甘油酯、亞油酸二油酸甘油酯、棕櫚酸亞油酸甘油酯、1,3-二棕櫚酸-2-亞油酸甘油酯、甘油三油酸酯、棕櫚酸二油酸甘油酯、1,3-二棕櫚酸-2-油酸甘油酯對(duì)照品適量，流動(dòng)相[乙腈-二氯甲烷(65∶35)]制成質(zhì)量濃度約為1.0 mg/mL的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 取薏苡仁及麩炒薏苡仁粉末(過(guò)3號(hào)篩)各5批，每批約0.6 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入流動(dòng)相50 mL，稱定質(zhì)量，浸泡2 h，超聲處理(功率300 W、頻率50 kHz)30 min，放冷，流動(dòng)相補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈-二氯甲烷(65∶35)；柱溫25 ℃；體積流量1.0 mL/min；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，空氣體積流量2.0 L/min；漂移管溫度70 ℃，保留時(shí)間50 min，增益值2；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.4 方法學(xué)考察 精密吸取供試品溶液，在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，每次10 μL，記錄色譜峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，計(jì)算其RSD，對(duì)重復(fù)性進(jìn)行考察。

取薏苡仁粉末(過(guò)3號(hào)篩)，平行制備6份供試品溶液，在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，計(jì)算其RSD，對(duì)精密度進(jìn)行考察。

取供試品溶液適量，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，計(jì)算其RSD，對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行考察。

2.1.5 色譜峰指認(rèn) 取對(duì)照品溶液適量，在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄對(duì)照品色譜圖，并與樣品色譜圖進(jìn)行比對(duì)，指認(rèn)色譜峰。

2.1.6 圖譜生成 取供試品溶液，在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄對(duì)照品色譜圖，并將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2004版)，以樣品S1的圖譜為參照，時(shí)間窗寬度設(shè)定為0.1 min，采用中位數(shù)法，以參照峰進(jìn)行峰匹配，并以生品、麩炒品各5批的指紋圖譜共有模式為對(duì)照?qǐng)D譜R。

2.2 麩炒前后薏苡仁對(duì)脾虛水濕不化大鼠的藥效學(xué)比較

2.2.1 分組 60只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組，每組5只；生品給藥組、麩炒品給藥組，每組25只，分組后于新環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

2.2.2 模型建立 除空白組外，其余各組大鼠每天飼以高脂低蛋白飼料，以10%體質(zhì)量尾部負(fù)重，放入(20±2)℃、水深50 cm的圓筒中游泳到力竭為止，以鼻尖沒(méi)入水中10 s為力竭標(biāo)志，連續(xù)誘導(dǎo)6周，記錄體質(zhì)量變化。

2.2.3 給藥 空白組、模型組大鼠灌胃給予10 mL/kg生理鹽水，每天1次，連續(xù)2周。生品及麩炒品給藥組按成人臨床劑量換算大鼠等效劑量，以15 g/kg灌胃給藥，每天1次，連續(xù)2周。末次給藥前禁食不禁水24 h，稱定大鼠體質(zhì)量，3%戊巴比妥麻醉，腹主動(dòng)脈取血，置于肝素鈉抗凝管中靜置1 h，離心(3 000 r/min)10 min后取上層血清，置于-80 ℃超低溫冰箱中，采用ELISA法檢測(cè)胃泌素(GAS)、胃動(dòng)素(MTL)、血管活性腸肽(VIP)、生長(zhǎng)抑素(SS)水平，同時(shí)稱定胸腺、脾臟的質(zhì)量。

2.3 灰色關(guān)聯(lián)度分析

2.3.1 原始數(shù)據(jù)的無(wú)量綱化處理 采用均值法對(duì)原數(shù)據(jù)進(jìn)行變換。變換的母序列記為{Ym(k)}，子序列記為{Yz(k)}。將生品、麩炒薏苡仁治療脾虛水濕不化的藥效指標(biāo)作為母序列，生品、麩炒薏苡仁的共有峰峰面積作為子序列。

3 結(jié)果

3.1 指紋圖譜

3.1.1 方法學(xué)考察 樣品色譜峰峰面積RSD分別為1.03%～1.98%、0.51%～1.63%、0.32%～1.88%，保留時(shí)間RSD分別為0.06%～0.55%、0.02%～0.23%、0.03%～0.58%，均小于2.0%，說(shuō)明該方法重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性良好，可用于建立指紋圖譜。

3.1.2 結(jié)果 經(jīng)色譜峰匹配后，5批薏苡仁、麩炒薏苡仁的HPLC指紋圖譜與其對(duì)照?qǐng)D譜之間的相似度分別為0.996～0.999、0.992～0.999，說(shuō)明薏苡仁生品與麩炒品化學(xué)成分整體差異性不大，但共有成分存在差異，見圖1、表1，符合譜效相關(guān)研究對(duì)樣品的要求。另外，與圖譜對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，峰1～9為薏苡仁麩炒前后的共有峰，與相關(guān)對(duì)照品比對(duì)后，確認(rèn)峰1為甘油三亞油酸酯，峰2為甘油二亞油酸酯，峰3為棕櫚酸二亞油酸甘油酯，峰4為亞油酸二油酸甘油酯，峰5為棕櫚酸亞油酸甘油酯，峰6為1,3-二棕櫚酸-2-亞油酸甘油酯，峰7為甘油三油酸酯，峰8為棕櫚酸二油酸甘油酯，峰9為1,3-二棕櫚酸-2-油酸甘油酯。

圖1 薏苡仁指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of Coicis Semen

表1 麩炒前后薏苡仁9種共有成分色譜峰峰面積

3.2 藥效學(xué)

3.2.1 GAS、MTL、VIP、SS水平 如表2、圖2所示，與空白組比較，模型組大鼠血清GAS、MTL水平均降低(P<0.01)，VIP、SS水平均升高(P<0.01)，證明大鼠胃腸功能基本紊亂，同時(shí)出現(xiàn)典型的納呆、皮毛干枯、脫毛、倦臥懶動(dòng)等癥狀，與脾虛水濕不化的臨床表現(xiàn)基本一致；與模型組比較，生品給藥組、麩炒品給藥組大鼠血清VIP、SS水平降低(P<0.05,P<0.01)，GAS、MTL水平升高(P<0.05,P<0.01)，以后者更明顯。

表2 炮制對(duì)大鼠血清GAS、MTL、VIP、SS水平的影響

注：與空白組比較，**P<0.01;與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與生品給藥組比較,△P<0.05。圖2 炮制對(duì)大鼠血清GAS、MTL、VIP、SS水平的影響Fig.2 Effects of bran stir-frying on the serum levels of GAS, MTL, VIP and SS in rats

3.2.2 炮制對(duì)大鼠體質(zhì)量、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響 如表3、圖3所示，與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均降低(P<0.05)，表明模型建立成功；與模型組比較，生品給藥組、麩炒品給藥組大鼠體質(zhì)量、胸腺指數(shù)、脾指數(shù)均有上升趨勢(shì)，以后者更明顯(P<0.05)。

表3 炮制對(duì)大鼠體質(zhì)量、胸腺、脾臟指數(shù)的影響

注：與空白組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05。圖3 炮制對(duì)大鼠體質(zhì)量、胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的影響Fig.3 Effects of bran stir-frying on rat body mass, thymus and spleen indices

3.3 譜效關(guān)系 如表4所示，麩炒薏苡仁中9種共有成分與GAS、MTL、SS、體質(zhì)量、胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的關(guān)聯(lián)度均明顯高于生薏苡仁，而生薏苡仁中9種共有成分與VIP的關(guān)聯(lián)度明顯高于麩炒薏苡仁。

表4 麩炒前后薏苡仁9種共有成分對(duì)各藥效指標(biāo)的關(guān)聯(lián)度

4 討論

中藥譜效關(guān)系的研究是指將中藥中內(nèi)在的化學(xué)成分與該中藥相對(duì)應(yīng)的藥效指標(biāo)進(jìn)行結(jié)合，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法將二者進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，科學(xué)、系統(tǒng)的闡述中藥內(nèi)在化學(xué)成分與藥效之間的關(guān)系[18]。

血漿胃泌素(GAS)能提高胃電慢波頻率和加速胃竇收縮，舒張幽門泵，促進(jìn)胃排空，對(duì)小腸、結(jié)腸的收縮也有一定的促進(jìn)作用[19]。MTL由十二指腸及空腸黏膜單核細(xì)胞分泌，可直接作用于平滑肌細(xì)胞上的受體，引起平滑肌收縮和加快小腸蠕動(dòng)，同時(shí)MTL還可以增強(qiáng)胃體收縮，加速胃排空液體，被認(rèn)為是一種內(nèi)源性激素促胃動(dòng)素[20]。VIP是胃腸抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，延遲胃排空，抑制小腸環(huán)形括約肌的收縮，降低十二指腸收縮頻率，松弛結(jié)腸平滑肌，減弱結(jié)腸運(yùn)動(dòng)[21]。SS是一種典型的腦腸肽，對(duì)胃排空、腸道內(nèi)容物轉(zhuǎn)運(yùn)、回腸膽囊收縮等生物功能均有抑制作用[22]。根據(jù)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組大鼠血清GAS、MTL水平均降低，VIP、SS水平均升高，證明大鼠胃腸功能基本紊亂，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠出現(xiàn)典型的納呆、皮毛干枯、脫毛、倦臥懶動(dòng)等癥狀與脾虛水濕不化的臨床表現(xiàn)基本一致。給藥后，與模型組比較，生品給藥組大鼠血清VIP及SS水平降低，GAS、MTL水平升高；麩炒品給藥組大鼠血清VIP及SS水平降低，GAS、MTL水平升高。與生品給藥組比較，麩炒品給藥組大鼠血清MTL水平升高，GAS水平有所升高，VIP和SS水平有所降低，但無(wú)顯著性差異。生品給藥組與麩炒品給藥組比較，后者對(duì)脾虛水濕不化的臨床癥狀的治療作用較優(yōu)。說(shuō)明薏苡仁炮制后對(duì)GAS、MTL、VIP及SS相關(guān)藥效具有明顯的提升。本研究為薏苡仁麩炒前后藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了理論依據(jù)。