趙愛月，蘇云霞，傅德強

（福建醫(yī)科大學 附屬第二醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，福建 泉州 362000）

卵巢癌是女性最常見惡性腫瘤之一，其臨床治療尚無重大突破性進展，5年生存率保持在25%～35%［1］。雖然腫瘤免疫治療在多個瘤種已顯示出令人振奮的治療前景［2-4］，并部分應(yīng)用于卵巢癌治療領(lǐng)域，但仍然缺乏對卵巢癌的精準的療效預測指標。

腫瘤免疫微環(huán)境（tumor immune microenvironment，TIME）的格局直接影響化療和腫瘤免疫治療的轉(zhuǎn)歸，與腫瘤患者預后密切相關(guān)［5-6］。CD8 T細胞浸潤預示卵巢癌患者預后良好［7-8］，而瘤內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞（regulat T cell，Tregs）［7，9］或中性粒細胞［10］浸潤提示預后不佳。細胞毒T淋巴細胞相關(guān)蛋白4／CD80分子（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4／CD80 molecule，CTLA-4／CD80）和程序性細胞死亡分子1／程序性死亡配體1（programmed cell death 1／programmed death ligand 1，PD-1／PD-L1）等免疫共信號通路主導免疫細胞的功能狀態(tài)，在腫瘤免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用［11］。近年來有研究基于免疫相關(guān)基因的表達水平評估TIME格局和預測腫瘤患者的預后［11-13］，但是具體機制尚未完全明朗。微小RNA（microRNAs，miRNAs）是內(nèi)源性非編碼RNA，通常由20～25個核苷酸組成。miRNAs可降解或抑制翻譯調(diào)控靶基因表達［14］，參與多種腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展［15］，對TIME具有調(diào)控作用。Wang等［16］在小鼠肺癌模型中發(fā)現(xiàn)miRNA424可以下調(diào)肺癌細胞PD-L1表達。另一項研究表明，let-7b可通過下調(diào)CD8 T細胞PD-1表達和肺癌細胞PD-L1表達來重塑TIME［17］。De Mattos-Arruda等［18］報道m(xù)iRNA21可通過激活I(lǐng)L-6／STAT3／NF-κB和PI3K通路改變?nèi)橄侔㏕IME格局。在卵巢癌中，miRNA92［19］、miRNA145［20］、miRNA424［21］等可通過不同機制上調(diào)或下調(diào)PDL1表達并改變TIME格局。然而，介導TIME形成的關(guān)鍵miRNA仍不清楚。

本研究以癌癥基因圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）和高通量基因表達（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫為數(shù)據(jù)來源，擬通過生物信息學方法來篩選卵巢癌關(guān)鍵miRNAs及相關(guān)基因，探討其對腫瘤免疫格局和預后的影響，闡明潛在的機制。

1 方法

1.1 數(shù)據(jù)采集與預處理

所有卵巢癌患者數(shù)據(jù)均來源于TCGA（https：／／portal.gdc.cancer.gov／）和GEO（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／geo／）。以TCGA數(shù)據(jù)集作為訓練隊列，以GEO數(shù)據(jù)集（GSE30161、GSE32062和GSE63885）作為驗證隊列。對所有數(shù)據(jù)進行歸一化處理，使用“sva”R包去除GEO數(shù)據(jù)集的批間誤差。排除總生存時間（overall survival，OS）小于1個月的患者。最終，TCGA數(shù)據(jù)集共納入294例卵巢癌患者資料，GEO數(shù)據(jù)集共納入393例卵巢癌患者資料。選擇GSE129880、GSE117007和GSE119056數(shù)據(jù)集驗證hsa-mir-7702與TIME的相關(guān)性。數(shù)據(jù)采集流程和分析均遵守TCGA和GEO的所有規(guī)定。

1.2 生物信息學分析

根據(jù)卵巢癌患者療效與OS的線性相關(guān)性，通過“surv_cutpoint”函數(shù)計算獲得PD-L1表達最佳閾值；采用“survival”和“survminer”包進行生存差異分析；利用“l(fā)imma”包篩選差異表達基因（differentially expressed gene，DEGs），并以P＜0.05，｜logFC｜（即｜log2FC｜）＞0.5作為選擇條件進行后續(xù)分析。通過ESTIMATE算法評估TIME格局，包括基質(zhì)細胞和免疫細胞［22］。根據(jù)Bindea等［23］提供的數(shù)據(jù)集，采用單樣本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）算法評估免疫細胞浸潤和免疫相關(guān)通路富集水平?；谕負渲丿B矩陣，采用權(quán)重基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）進行平均連鎖聚類，分析某些疾病基因表達的相關(guān)性，根據(jù)基因的權(quán)重、連接度和相關(guān)系數(shù)篩選關(guān)鍵基因［24］。利用STRING 數(shù)據(jù)庫（https：／／www.string-db.org／）［25］分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）。利用“clusterProfiler”軟件包對關(guān)鍵基因進行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析［26］。

1.3 關(guān)鍵基因的鑒定

Pearson相關(guān)性分析獲得DEGs（包括miRNAs和mRNA）相關(guān)系數(shù)并以P＜10-8，｜logFC｜≥0.5，頻次＞100為條件篩選重要DEGs，以Cor＞0.5，P＜0.05為條件篩選重要miRNAs，即hsa-mir-7702及其相關(guān)基因。根據(jù)WGCNA結(jié)果，選擇藍色模塊中連接度Top100與PD-L1相關(guān)性Top100的基因交集，即權(quán)重基因。根據(jù)圖1所示流程，篩選出關(guān)鍵基因。

圖1 關(guān)鍵基因篩選流程圖Figure 1 Flowchart of hub-genes identification

1.4 統(tǒng)計分析

應(yīng)用R4.0.2軟件進行統(tǒng)計分析，使用limma數(shù)據(jù)包中的Student t檢驗方法篩選DEG。KEGG中選擇差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）的信號轉(zhuǎn)導通路進行研究。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率的比較采用log-rank檢驗。連續(xù)變量采用t檢驗計算比較，分類變量通過χ2檢驗分析（n＜5時行連續(xù)校正χ2檢驗）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

本研究所有患者數(shù)據(jù)均來自TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫。TCGA數(shù)據(jù)庫共294例卵巢癌患者資料作為訓練隊列；GEO數(shù)據(jù)庫共393例卵巢癌患者資料作為驗證隊列，包括GSE30161數(shù)據(jù)集58例，GSE32062數(shù)據(jù)集260例，GSE63885數(shù)據(jù)集75例。卵巢癌患者的臨床特征見表1。

表1 TCGA和GEO隊列卵巢癌患者臨床特征Table 1 Clinicopathological characteristics of patients w ith ovarian cancer in TCGA cohort and GEO cohort

2.2 卵巢癌患者PD-L1表達最佳閾值

基于卵巢癌患者OS和生存狀態(tài)，計算獲得PD-L1表達閾值（即第60百分位數(shù)）。根據(jù)PDL1表達閾值將所有患者分為高表達組和低表達組，生存分析結(jié)果表明，相比低表達組，高表達組具有顯著生存優(yōu)勢（P＝0.004，圖2A）；在療效方面兩組未見明顯差異。卵巢癌患者療效與OS存在明顯線性相關(guān)（OR＝0.68，圖2B）。因此，基于OS和療效計算并獲得PD-L1表達最佳閾值為1.316，即第90百分位數(shù)。根據(jù)最佳閾值分組，高、低表達組在生存（P＝0.018，圖2C）和療效（P＝0.006）方面均具有顯著差異。驗證隊列分析結(jié)果顯示，與低表達組比較，高表達組表現(xiàn)出顯著生存獲益（P＝0.019，圖2D）。

圖2 卵巢癌腫瘤組織PD-L1表達最佳閾值與生存的關(guān)系Figure 2 The relationship between the optimal cutoff point of PD-L1 expression and the survival in ovarian cancer patients

2.3 PD-L1表達最佳閾值對卵巢癌TIME的評價作用

ssGSEA分析結(jié)果顯示，與低表達組相比較，高表達組免疫細胞浸潤更為顯著，包括CD8 T細胞（CD8 positive T cells，CD8+T cells）、腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）、T輔助細胞（T helper cells）、樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）、活化樹突狀細胞（activated dendritic cells，aDCs）、未成熟 樹突狀細胞（immature dendritic cells，iDCs）、中性粒細胞（neutrophils）、巨噬細胞（macrophages）、自然殺傷細胞（natural killer cells，NK cells）、漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）和調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）（圖3A）；高表達組免疫細胞功能更強，包括免疫檢查點（check point）、T細胞共抑制（T cell co-inhibition）、T細胞共刺激（T cell co-simulation）、抗原呈遞細胞共刺激（antigen-presenting cell co-simulation，APC cosimulation）、細胞溶解活性（cytolytic activity）、主要組織相容性復合體I類分子（major histocompatibility complex class I，MHC class I）、CC軸趨化因子受體（CC chemokine receptor，CCR）、I型干擾素反應(yīng)（type I IFN reponse）、炎癥刺激（inflammation promoting）、副炎癥（parainflammation）和抗原呈遞細胞共抑制（antigen-presenting cell co-inhibition，APC co-inhibition）（圖3B）。ESTIMATE分析結(jié)果表明（圖3C），與PD-L1低表達組比較，PD-L1高表達組具有較高免疫細胞評分（P＜0.001）和ESTIMATE評分（P＜0.001）。驗證隊列基于ssGSEA和ESTIMATE分析獲得類似結(jié)論（圖3 D-F）。

圖3 PD-L1表達對卵巢癌腫瘤免疫格局的影響Figure 3 The effect of PD-L1 expression on tumor immune profile in ovarian cancer

2.4 DEGs的篩選結(jié)果

差異表達基因分析結(jié)果表明，共840個基因篩選為DEGs（｜logFC｜＞0.5，P＜0.05），其中，549個DEGs顯著上調(diào)，291個基因顯著下調(diào)（圖4A）。基于DEGs的Pearson相關(guān)性分析，篩選出101個重要DEGs（P＜10-8，｜log FC｜≥0.5，頻次＞100，圖4B）。

圖4 差異表達基因分析篩選Figure 4 The identification of DEGs

2.5 DEGs的WGCNA結(jié)果

840個DEGs的WGCNA結(jié)果（cut height＝650，β＝4，R2＝0.9，圖5 A-C）表明，有646個DEGs的藍色模塊與PD-L1表達高度相關(guān)（Cor＝0.78，P＝3.2×10-133，圖5D-E）。

2.6 hsa-m ir-7702選擇和關(guān)鍵基因篩選

按照圖1所示流程，根據(jù)DEGs相關(guān)性分析和WGCNA結(jié)果，篩選重要miRNA和關(guān)鍵基因。101個重要DEGs的Cytoscape分析表明，hsa-mir-7702和75個相關(guān)DEGs具有重要作用（Cor＞0.5，P＜0.05，圖6A）。WGCNA結(jié)果顯示，藍色模塊中基因連接度和PD-L1相關(guān)性Top100基因交集后篩選出48個權(quán)重基因。7個PD-L1表達相關(guān)的miRNA分析表明，hsa-mir-7702具有較高基因連接度（connectivity＝15.37），與PD-L1表達具有顯著相關(guān)性（Cor＝0.48，-lg P＝17.56，圖6B）。因此，選擇 hsa-mir-7702作為關(guān)鍵miRNA，同時篩選出202個hsa-mir-7702相關(guān)基因（Weight≥0.3）。

圖6 hsa-mir-7702和關(guān)鍵基因篩選Figure 6 Identification of hsa-mir-7702 and hub genes

進一步分析表明，46個基因共存于重要DEGs和權(quán)重基因，即DEG-WGCNA基因；30個基因共存于hsa-mir-7702相關(guān)DEGs和hsa-mir-7702相關(guān)基因，即hsa-mir-7702互作基因。DEGWGCNA基因和hsa-mir-7702互作基因交集分析獲得15個關(guān)鍵基因，包 括 TIGIT（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains，攜有Ig和ITIM 結(jié)構(gòu)域的T細胞免疫受體）、IL2RG（interleukin 2 receptor subunitgamma，白介素2受體γ亞基）、ICOS（inducible T cell costimulator，誘導T細胞共刺激因子）、SH2D1A（SH2 domain containing 1A，攜有1A 的SH2域）、SLAMF6（SLAM family member 6，SLAM 家族成員6）、GZMA（granzyme A，顆粒酶A）、P2RY10（P2Y receptor family member 10，P2Y受體家族成員10）、SLAMF8（SLAM familymember 8，SLAM家族成員8）、CD247（CD247 molecule，CD247分子）、PDCD1LG2（programmed cell death 1 ligand 2，程序性細胞死亡1配體2）、CYTIP（cytohesin 1 interacting protein，細胞蛋白1相互作用蛋白）、RHOH（ras homolog family member H，ras同源家族成員H）、LCK（LCK proto-oncogene，LCK原癌基因）、STX11（syntaxin 11，突觸融合蛋白11）和CXCR6（C-X-Cmotif chemokine receptor 6，CX-C軸趨化因子受體6）（圖6C）。

2.7 hsa-m ir-7702在卵巢癌TIME的作用

根據(jù)hsa-mir-7702表達中位值將卵巢癌患者分為高表達組和低表達組，無監(jiān)督聚類分析結(jié)果表明，與低表達組相比較，高表達組展現(xiàn)出更顯著免疫細胞浸潤和更強的免疫應(yīng)答能力（圖7A）。驗證隊列包括GSE119056、GSE115019和GSE129880數(shù)據(jù)集中，也有類似現(xiàn)象（圖7B）。

圖7 hsa-mir-7702表達對卵巢癌腫瘤免疫格局的影響Figure 7 Tumor immune profile in high-and low-expression groups according to median of hsa-mir-7702 in TCGA cohort and validation cohort

2.8 關(guān)鍵基因功能富集和PPI分析

KEGG分析表明，關(guān)鍵基因主要涉及免疫相關(guān)信號通路，包括PD-L1表達和PD-1檢查點通路、自然殺傷細胞介導細胞毒作用、T細胞受體信號通路（圖8A）。GO分析表明，關(guān)鍵基因主要介導免疫相關(guān)生物學功能（圖8A）。其中，主要生物學過程（biological processes，BP）包括細胞-細胞黏附、T細胞活化正調(diào)控和T細胞共刺激；主要細胞成分（cellular components，CC）包括質(zhì)膜外側(cè)面結(jié)構(gòu)和免疫突觸；主要分子功能（molecular function，MF）包括C-C趨化因子結(jié)合、C-C趨化因子受體活化、T細胞受體結(jié)合、免疫受體活化等。PPI分析結(jié)果顯示，15個關(guān)鍵基因與PD-L1存在直接或間接的相互作用（confidence＝0.6，圖8B）。

圖8 關(guān)鍵基因的功能富集分析和PPI分析Figure 8 Function analysis and PPIanalysis of15 hub genes

2.9 關(guān)鍵基因的生存分析

根據(jù)關(guān)鍵基因表達中位值分為高、低表達組，生存分析結(jié)果表明，訓練隊列6個關(guān)鍵基因（TIGIT、IL2RG、ICOS、SH2D1A、SLAMF6和GZMA）表達與患者生存顯著相關(guān)（圖9A）；驗證隊列13個關(guān)鍵基因（TIGIT、SH2D1A、LCK、PD-L1、GZMA、CXCR6、ICOS、IL2RG、SLAMF8、STX11、CD247、RHOH和PDCD1LG2）表達與患者生存密切相關(guān)（圖9B）。

圖9 15個關(guān)鍵基因與卵巢癌預后的關(guān)系Figure 9 Survival curves of 15 hub genes grouped by themedian of each gene expression

3 討論

TIME是腫瘤細胞所處周圍環(huán)境的免疫格局，包含淋巴細胞、固有免疫細胞、中性粒細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞。大量研究證實，TIME與多種腫瘤疾病預后密切相關(guān)［27］，包括卵巢癌［7，28］、非小細胞肺癌［29］、三陰性乳腺癌［30］和結(jié)直腸癌［31］。本研究中，ssGSEA分析和ESTIMATE分析的結(jié)果證實了PD-L1表達對卵巢癌TIME的影響，高表達組具有更強的免疫應(yīng)答能力，并提示患者良好的預后。

本研究旨在探討miRNAs對卵巢癌TIME的影響，而辨別不同的腫瘤免疫格局非常重要。PD-L1是最重要的免疫相關(guān)基因之一，與T細胞免疫功能密切相關(guān)，大量研究將其作為判斷腫瘤免疫狀態(tài)的評價指標。然而，截至目前，PD-L1表達最佳閾值尚不清楚。本研究基于卵巢癌患者療效和OS獲得PD-L1表達最佳閾值，即第90百分位數(shù)。生存分析結(jié)果高度支持PD-L1表達最佳閾值的適用性和可靠性。

DEG篩選和WGCNA分析是甄別關(guān)鍵基因的重要方法。本研究結(jié)合兩種分析方法，根據(jù)基因相關(guān)性、連接度、頻次和權(quán)重篩選重要miRNA和關(guān)鍵基因。DEGs相關(guān)性分析和WGCNA結(jié)果均高度支持hsa-mir-7702在卵巢癌患者腫瘤免疫格局形成過程的重要性。15個hsa-mir-7702相關(guān)的關(guān)鍵基因主要包括ICOS、PDCD1LG2、TIGIT、SH2D1A、IL2RG、CXCR6、STX11、SLAMF6、P2RY10、RHOH、CD247、GZMA、SLAMF8、CYTIP和LCK。已經(jīng)明 確，ICOS、PDCD1LG2、TIGIT 和SLAMF6是重要的免疫相關(guān)共信號分子［32］。PPI分析提示，15個關(guān)鍵基因存在直接或間接的相互作用。進一步的KEGG分析和GO分析結(jié)果提示15個關(guān)鍵基因主要涉及腫瘤免疫相關(guān)信號通路，并介導T細胞免疫應(yīng)答的所有環(huán)節(jié)，包括致敏、激活、增殖、遷移、識別和殺傷。因此，推測hsamir-7702可能通過調(diào)控15個關(guān)鍵基因介導卵巢癌TIME形成。

許多研究證實了miRNA對卵巢癌TIME的調(diào)控作用，如miRNA424可通過抑制PD-L1和CD80表達，恢復T細胞免疫應(yīng)答能力，扭轉(zhuǎn)化療藥物耐藥［21］；miRNA145可在體外通過結(jié)合c-Myc轉(zhuǎn)錄因子下調(diào)卵巢癌細胞PD-L1的表達［20］；miRNA92可通過抑制LATS2表達介導卵巢癌細胞PD-L1表達上調(diào)［19］。目前，尚未有hsa-mir-7702對卵巢癌TIME影響的相關(guān)報道。一項涉及結(jié)直腸癌的研究表明，hsa-mir-7702可通過靶向作用于轉(zhuǎn)錄銜接因子1（transcriptional adaptor 1，TADA1）而抑制腫瘤細胞遷移和侵襲［33］；另一項關(guān)于惡性黑色素瘤研究發(fā)現(xiàn)，hsa-mir-7702表達與PD-L1呈正相關(guān)［34］。此外，hsa-mir-7702在多個生物信息學相關(guān)的腫瘤風險預測模型均有報道，包括結(jié)直腸癌［35］、黑色素瘤［36］、膀胱癌［37-38］和乳腺癌［39］。本研究ssGSEA分析結(jié)果提示，hsamir-7702表達上調(diào)有利于促進卵巢癌患者的腫瘤免疫應(yīng)答能力，包括免疫功能和免疫細胞浸潤。盡管驗證隊列樣本量有限，但是也表現(xiàn)出同樣趨勢。此外，PD-L1和hsa-mir-7702均高表達的患者具有更強的免疫應(yīng)答能力?；谝陨辖Y(jié)果，本研究認為hsa-mir-7702可能通過調(diào)控15個關(guān)鍵基因而對卵巢癌腫瘤免疫格局產(chǎn)生影響。

關(guān)鍵基因通過各種機制參與腫瘤疾病發(fā)生、發(fā)展并影響患者預后。本研究發(fā)現(xiàn)訓練隊列6個關(guān)鍵基因與卵巢癌患者生存密切相關(guān)，包括IL2RG、TIGIT、ICOS、SH2D1A、SLAMF6和GZMA；驗證隊列13個關(guān)鍵基因與患者預后顯著相關(guān)。表明15個關(guān)鍵基因?qū)β殉舶╊A后轉(zhuǎn)歸具有重要作用，但由于惡性腫瘤具有異質(zhì)性，在不同群體中所主導作用可能存在一定差異。

本研究支持hsa-mir-7702對卵巢癌腫瘤微環(huán)境的免疫調(diào)節(jié)作用，但仍存在一定局限性，首先，本課題基于生物信息學方法進行數(shù)據(jù)分析，方法較為單一；其次，部分驗證隊列樣本量小，所得結(jié)論可能存在一定誤差。因此，后續(xù)研究將針對hsa-mir-7702深入挖掘。

作者貢獻聲明

趙愛月：數(shù)據(jù)收集和整理，文獻檢索，撰寫論文；蘇云霞：數(shù)據(jù)收集和整理；傅德強：提出研究思路、統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，論文審閱和修改。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。