陳 思，李俐霜，王 毅，孫婭楠，糜志遠

(1 湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068；2 中國中醫(yī)科學院醫(yī)學實驗中心，北京 100700)

皮膚是脊椎動物全身最大的器官，是保護各種組織和器官免受物理、機械、化學和病原微生物侵害的第一道防線[1-2]。皮膚創(chuàng)傷愈合是一個動態(tài)的過程，涉及一系列復雜的生物過程[3]，包括防止炎癥的產(chǎn)生、細胞的增殖與分化、血管系統(tǒng)的重塑與恢復和結締組織的形成，對傷口愈合都具有重要意義[4-5]。皮膚由表皮層、真皮層、皮下組織構成，真皮層位于表皮層下方，是構成皮膚的主體。真皮層是致密的結締組織，有許多彈力纖維和膠原纖維，故具有彈性和韌性；有豐富的血管和神經(jīng)，故能感受外界刺激[6]。因此，創(chuàng)面愈合過程中膠原纖維的變化與血管及其他附屬器官的重建直接影響了創(chuàng)面愈合后的皮膚屏障功能，所以活體評估創(chuàng)面部位的病理變化，可為臨床用藥和治療提供指導。

鹿茸是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的唯一一個具有完全再生能力的哺乳動物附屬器官[7]，可在90～120 d內完成血管、神經(jīng)、表皮等組織的分化、發(fā)育到成熟的全過程[8]。鹿茸中存在表皮生長因子[9]，可以推測其含有一些有效活性成分，具有很強的促進皮膚創(chuàng)傷愈合的能力。

本實驗通過利用雙光子激發(fā)熒光(Two-Photon Excitation Fluorescence，TPEF)成像、二次諧波(Second Harmonic Generation，SHG)成像與毛細血管鏡系統(tǒng)活體評估鹿茸蛋白粗提物(Pilose Antler Extract，PAEs)給藥后創(chuàng)面組織表皮厚度、真皮層膠原纖維的含量情況及毛細血管的構建情況，建立一種基于光學成像技術活體評價皮膚愈合過程的實驗方法，為研究藥物促愈合過程提供新的研究思路與研究方法；并以PAEs為代表藥物應用該方法評價其促進創(chuàng)傷愈合的藥效作用。

1 材料

1.1 試驗動物

SD大鼠，15只，雄性，體重(150±10)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號為SCXK(京)2016-0006。將其飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗的環(huán)境中，自由攝食和飲水。

1.2 儀器與試劑

鹿茸來源為吉林云鹿集團，為鹿茸上段。

氨基酸標品(Aglient)；HPLC-MS/MS系統(tǒng)(Sciex)；BCA蛋白含量測定試劑盒(Thermo，23227)；蛋白marker(Thermo，26619)；重組人表皮生長因子(易孚，國藥準字S20020112)；SDS-PAGE電泳預制膠試劑盒(索萊寶，P1200)；凝膠成像儀(BIO-RAD，733BR2310)；電泳儀(BIO-RAD，MP Tetra)；酶標儀(Bio-Rad, PR4100)；雙光子掃描顯微鏡(Olympus，F(xiàn)V1000MPE)；CapiScope毛細血管鏡系統(tǒng)(KK Technology，CAM1CVF)。

2 方法

2.1 鹿茸水溶性蛋白粗提取

2.1.1鹿茸水溶性蛋白粗提取按照本實驗室前期提取工作進行提取[9]，得到PAEs。

2.1.2PAEs蛋白成分分析按照Thermo公司BCA蛋白含量測定試劑盒的要求測定蛋白含量。

PAEs采用10%的分離膠，5%濃縮膠進行SDS-PAGE凝膠電泳。利用SDS-PAGE進行分離，電泳結束后，經(jīng)考馬斯亮藍染色后，白光下觀察蛋白條帶，與蛋白質量標準條帶的相對位置確定蛋白分子量分布范圍。

PAEs交由華大基因有限公司進行蛋白質鑒定。

2.1.3PAEs游離氨基酸成分分析

1)色譜條件 PFP色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters)；流動相為A(水，含0.1%甲酸)∶B(甲醇)，梯度洗脫程序：0～6.0 min，5%～95% B；6.0～8.0 min，95% B～95%B；8.0～8.01 min，95% B～5%B；8.01～10.0 min，5% B～5% B。流速為0.2 mL·min-1；柱溫為35℃；樣品室溫度為6 ℃；進樣量為1 μL。

2)質譜條件 電噴霧離子源(ESI)，氣簾氣(N2)為276 kPa，碰撞氣(N2)為9×6.895kPa，噴霧電壓為+5500.00 V，霧化溫度為550.00 °C，霧化氣(Ion Source Gas1, N2)和輔助氣(Ion Source Gas2, N2)均為55.00×6.895 kPa。采用多反應監(jiān)測(MRM)模式正離子掃描。

2.2 動物實驗

2.2.1模型建立異氟烷氣麻大鼠，用脫毛膏脫去背部區(qū)域毛發(fā)，溫水擦干。手術區(qū)域局部消毒后，于大鼠背部脊柱兩側旁開1 cm處減去一塊直徑1.4 cm，創(chuàng)面面積1.54 cm2的圓形。全層切除皮膚，開放創(chuàng)面，深達肌層，充分止血，單籠飼養(yǎng)。做好標記。

2.2.2分組給藥15只大鼠隨機分為陽性藥(rh-EGF)組，鹿茸蛋白(PAEs-H/M/L)高、中、低劑量組，模型組(Konjac gum)等5組，每組3只。每只實驗動物左側創(chuàng)口外敷生理鹽水；依據(jù)前期實驗結果PAEs水溶后混合魔芋膠制成水凝膠外敷：低劑量組(2 mg/mL)PAEs,中劑量組(4 mg/mL)PAEs，高劑量組(8 mg/mL)外敷100 μL;陽性藥組用生理鹽水配成濃度為 7IU/μL的溶液外敷100 μL。待吸收后,將大鼠置于清潔籠內單籠飼養(yǎng)，自由食水，每天用藥。

2.2.3創(chuàng)面愈合情況測定造模首次敷藥10 d后用游標卡尺分別測量未愈合創(chuàng)面的縱徑和橫徑，計算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面面積-殘余創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。

2.2.4創(chuàng)面TPEF成像掃描將用異氟烷氣麻后的大鼠固定于雙光子顯微鏡載物臺上，采用數(shù)值孔徑為1.05的25倍水浸顯微物鏡對表皮組織進行Z軸掃描。采用激射波長750 nm，步進2 μm，圖像采集像素512×512 pixel，采集速度4 μm/pixel。

2.2.5創(chuàng)面皮膚病理染色給藥10 d后進行大鼠皮膚活組織取材。取創(chuàng)面及皮膚周圍的全層及皮下組織，將皮膚組織置于4%多聚甲醛中固定48 h，常規(guī)組織修塊、脫水、透明、石蠟包埋后，制成4 μm組織切片后行常規(guī)HE染色，光鏡觀察創(chuàng)面組織結構改變。

2.2.6創(chuàng)面SHG信號采集將用異氟烷氣麻后的大鼠固定于雙光子顯微鏡載物臺上，采用數(shù)值孔徑為1.05的25倍水浸顯微物鏡收集創(chuàng)面皮膚SHG信號，分色鏡690 nm，激射波長950 nm，濾光片475 nm/10nm(中心波長/帶寬)，對創(chuàng)面皮膚進行縱向掃描，步進2 μm，圖像采集像素512×512 pixel，采集速度4 μm/pixel。

2.2.7創(chuàng)面毛細血管數(shù)據(jù)采集將麻醉后的大鼠固定于毛細血管鏡系統(tǒng)下，記錄創(chuàng)面部位新生的毛細血管及毛囊的生長情況。

圖 1 鹿茸蛋白電泳圖

3 實驗結果

3.1 PAEs總蛋白含量測定及蛋白成分測定

使用BCA法蛋白含量測定試劑盒測得的OD值均在標準曲線y= 0.9431x+ 0.198上(R2=0.9965)，計算得出蛋白含量為61.29%。由SDS-PAGE蛋白電泳圖(圖1)可以得出鹿茸蛋白廣泛分布于55～250 kD 之間，且多為大分子蛋白。通過PAEs蛋白質鑒定分析共鑒定出135種蛋白。其中，Kelch-like protein 20促進肌動蛋白聚合和高爾基體后轉運，在血管生成過程中作為內皮細胞遷移的調節(jié)劑。

表1 PAEs中主要蛋白質

3.2 PAE成分分析

由圖2可知，確定了PAEs中的18種游離氨基酸。其中Glycine、Leucine、Alanine含量最高，為生物體內組成蛋白質的主要氨基酸。另外，還檢測出了Proline、Hydroxyproline等組成動物膠原蛋白的重要成分。由表2可知，18種游離氨基酸大多在生物體內的蛋白質代謝過程中處于重要地位，參與許多重要化學反應，主要功能為促進身體正常生長，修復組織、肌肉，并給身體組織提供能量。

圖 2 PAEs中游離氨基酸含量

表2 主要氨基酸功能

3.3 創(chuàng)面愈合情況測定

給藥10 d后，對大鼠創(chuàng)傷部位進行拍照，觀察創(chuàng)面愈合情況(圖3a)。實驗結果表明，在未給予PAEs時創(chuàng)面緩慢愈合，模型組左(N.S)、右(Konjac gum)無顯著性差異，表明藥物所用基質魔芋膠及生理鹽水不具有促進傷口愈合的作用，造模成功(圖3b)；由圖3c可見，造模后1 d各給藥組均具有促進傷口愈合的作用，但創(chuàng)面愈合率無顯著性差異；給藥10 d，PAEs中高劑量組及rh-EGF組創(chuàng)面愈合率顯著高于空白對照組(p<0.05)。

圖 3 PAEs促創(chuàng)面愈合情況

3.4 創(chuàng)面TEPF成像

通過TPEF成像技術對大鼠新生皮膚邊緣表皮厚度進行檢測。結果表明，在10 d，與模型組比較，PAEs-H/M組大鼠表皮厚度明顯增加(p<0.05)(圖4c)。

(a)大鼠創(chuàng)面皮膚TEPE成像

圖 5 創(chuàng)面皮膚切片HE染色結果

3.5 創(chuàng)面皮膚病理染色

給藥10 d，除模型組外，各組創(chuàng)口邊緣出現(xiàn)大量處于生長期的毛囊，外側可見少量毛發(fā)，創(chuàng)面面積有不同程度的縮小。模型組創(chuàng)口面積較大，區(qū)域內完全缺乏附件生長。其余各組創(chuàng)面收縮明顯,表皮層厚度增加，PAE-H/M組厚度較模型組顯著增加(p<0.05)。

3.6 創(chuàng)面SHG信號采集

為了研究創(chuàng)傷周圍膠原纖維的排列及含量變化，通過SHG成像技術檢測真皮層膠原纖維，并通過Image J軟件分析膠原纖維[11]含量變化情況圖6a顯示，網(wǎng)狀層、乳頭層均向創(chuàng)口方向延伸填充修復創(chuàng)口，膠原纖維呈隨機排列的網(wǎng)狀結構。如圖6b顯示，模型組左、右膠原纖維的排列及含量無統(tǒng)計學差異。給藥10 d后各組膠原纖維變粗增多，SHG信號增強。與模型組相比，PAEs-H、M組膠原纖維顯著增多(p<0.05)，SHG信號更強，表明PAEs組新生膠原含量較高。

圖 6 創(chuàng)面愈合過程中真皮層膠原纖維SHG成像

3.7 創(chuàng)面毛細血管數(shù)據(jù)采集

將麻醉后的大鼠固定于毛細血管鏡系統(tǒng)下，記錄創(chuàng)面部位的毛細血管的生長情況。10 d，創(chuàng)口邊緣出現(xiàn)較多新生血管，交織成網(wǎng)狀(圖7a)。其中：模型組毛細血管未交織成網(wǎng)，新生游離毛細血管較多；給藥組毛細血管交織成網(wǎng)，毛細血管網(wǎng)數(shù)目增多，游離毛細血管較少。如圖7b所示，給藥10 d后，各給藥組較正常皮膚毛細血管網(wǎng)數(shù)目顯著降低(p<0.01)，與模型組相比略有增加但無統(tǒng)計學差異。rh-EGF、PAEs-H/M/L組較正常皮膚游離毛細血管數(shù)目顯著降低(p<0.01)，與模型組相比PAEs-L組游離毛細血管數(shù)目顯著降低(p<0.05)。PAEs-H組較模型組血流量顯著下降(p<0.05)，提示毛細血管構建良好，血流趨于穩(wěn)定(圖7d)。

藍色箭頭：游離毛細血管，綠色箭頭：毛細血管網(wǎng)

4 討論與結論

對鹿茸蛋白進行成分分析，其蛋白含量為61.29%，主要為大分子蛋白，存在多種具有促進身體組織修復、生長相關的蛋白質和氨基酸。這很好地解釋了其具有促創(chuàng)傷愈合的作用，與“鹿茸具有加速創(chuàng)傷愈合的能力”的記載相一致。

既往研究創(chuàng)傷愈合過程的方法主要為切片染色。由于對切片的主觀選擇性導致只能對局部創(chuàng)面進行檢測分析而無法評估整個創(chuàng)面在愈合過程中的三維結構變化[12]。而TPEF可以直接獲得生物組織樣本不同深度的圖像和光譜信息[13]。TPEF成像技術具有靈敏度高、分辨率強和無創(chuàng)的特點，可以活體追蹤表皮層活細胞組織中內源性熒光基團的動態(tài)過程，反映表皮厚度的變化[14]，這彌補了HE染色不能檢測活體組織的缺點。結果顯示，與模型組相比，給藥10 d后PAEs-M/H組表皮厚度明顯增加，推測此時期表皮層中的皮膚附屬物較成熟，皮膚分層和皮膚附屬物重建是皮膚成熟的關鍵步驟[15-17]。在PAE-H/M表皮層厚度的顯著增加和腺體、細胞器的生成方面，傳統(tǒng)HE染色的驗證與光學成像結果基本吻合。

SHG成像技術以生物組織非中心對稱性的內源性信號為來源而進行激光掃描非線性光學顯微術，無需進行離體組織染色，可以活體成像，對組織探測深、損傷小、分辨率高[18]。膠原纖維具有強烈的二階非線性極化率和結構非中心對稱性，可以產(chǎn)生SHG。SHG成像技術可以活體觀察膠原纖維的病理變化。結果顯示，給藥10 d后PAEs-H/M組SHG信號強度增加。

毛細血管鏡系統(tǒng)是一種非侵入性、無創(chuàng)性檢測手段，能夠直接獲得皮膚表面毛細血管的高分辨率成像圖，同時進行實時量化分析，通過分析可得皮膚表面的毛細血管的生長情況。在受損皮膚區(qū)域能否快速建立血液循環(huán)，也是對正常皮膚功能的一種評價[19]。給藥10 d后，各給藥組較正常皮膚毛細血管網(wǎng)數(shù)目顯著降低，與模型組相比略有增加但無統(tǒng)計學差異，PAEs-H組較模型組血流量顯著下降，提示毛細血管構建良好，血流趨于穩(wěn)定。毛細血管鏡系統(tǒng)觀察新生毛細血管具有一定的局限性，既往研究表明部分新生毛細血管垂直于創(chuàng)面生長[20]，而毛細血管鏡系統(tǒng)只拍取平行于皮膚表面的一些新生毛細血管。

綜上所述，本研究通過TEPF、SHG和毛細血管鏡系統(tǒng)聯(lián)合使用檢測皮膚創(chuàng)傷大鼠皮下表皮層厚度變化、真皮層膠原纖維的排列與含量變化和新生毛細血管的生長情況，評估PAEs促創(chuàng)傷愈合后表皮層、真皮層及血管的功能恢復和重建。結果表明，PAEs中高劑量具有良好的促創(chuàng)傷愈合作用，能夠加速創(chuàng)傷愈合，改善愈合質量，促進膠原纖維的形成和毛細血管的重建，為鹿茸蛋白促創(chuàng)傷愈合提供了新的證據(jù)。而TEPF成像、SHG成像和毛細血管鏡系統(tǒng)將成為一種新型對無創(chuàng)活體皮下組織和附屬器官直接進行成像，為創(chuàng)傷相關疾病的診斷和藥物治療提供新的檢測方法，為促創(chuàng)傷愈合的研究提供新思路。