丁慶林，魏艷紅, 胡康洪

(湖北工業(yè)大學(xué)中德生物醫(yī)學(xué)中心，湖北 武漢 430068)

肝細(xì)胞癌(LIHC)作為最常見的、與多種信號(hào)通路改變相關(guān)的肝原發(fā)性惡性腫瘤，是全世界癌癥相關(guān)死亡的第二大死因。大多數(shù)患者只在肝癌晚期表現(xiàn)出臨床癥狀，其復(fù)雜的病理生理機(jī)制導(dǎo)致預(yù)后很差[1]。血清甲胎蛋白(Alpha Fetoprotein , AFP)和計(jì)算機(jī)斷層掃描(Computed Tomography, CT)或磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)的診斷成像已成為肝癌主要的診斷方式[2]。作為有價(jià)值的肝癌生物標(biāo)志物，AFP、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3, GPC-3)、Cluster of Differentiation 147(Cluster of Differentiation 147, CD147)、黏蛋白1(Mucin-1, Muc1)和上皮細(xì)胞黏附分子(Epithelial Cell Adhesion Molecule, EpCAM)等標(biāo)志物檢測(cè)的靈敏性和特異性有限[3]，應(yīng)用生物標(biāo)志物聯(lián)用，可提高診斷準(zhǔn)確率，已成為臨床診斷癌癥的新方向。因此，鑒定其他小分子在肝癌中的作用具有重要意義[2]。研究發(fā)現(xiàn)，mRNA前加工因子3(pre-mRNA processing factor 3, PRPF3)在多個(gè)LIHC腫瘤組織中上調(diào)，與較差的總生存期(Overall Survival, OS)和無病生存期(Disease-Free Survival, DFS)相關(guān)[4]；Kelch-like)蛋白家族成員21(Kelch Like Family Member 21, KLHL21)在LIHC中上調(diào)，其表達(dá)顯著抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，代表最有可能進(jìn)行治療干預(yù)的靶標(biāo)[5]；核小體組裝蛋白1-like-1(Nucleosome Assembly Proteins 1-like 1 Protein, NAP1L1)在LIHC中高表達(dá)與侵襲性臨床病理特征有關(guān)，促進(jìn)化療耐藥性[6]；驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員C1(Kinesin Family Member C1, KIFC1)在LIHC中表達(dá)上調(diào)，通過調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)介導(dǎo)LIHC轉(zhuǎn)移，并且與DFS和OS顯著相關(guān)[7]。這些研究揭示了LIHC中具有預(yù)后意義的潛在基因靶標(biāo)，也為PRIM1在LIHC中的研究提供了參考。

DNA引物酶亞基1(PRIM1)是異源四聚體真核聚合酶α-引物酶復(fù)合物的最小亞基，具有酶催化功能，對(duì)DNA合成具有關(guān)鍵作用，對(duì)細(xì)胞增殖同樣十分重要[8-9]。PRIM1催化的RNA合成可激活DNA損傷反應(yīng)[9-10]，PRIM1異常可影響細(xì)胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)變[11]；PRIM1下調(diào)和缺失可導(dǎo)致細(xì)胞S期停滯、延遲或延長(zhǎng)[12]；PRIM1突變會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。研究表明，PRIM1與多種良性和惡性腫瘤疾病相關(guān)。PRIM1參與了雌激素誘導(dǎo)的乳腺癌形成[9]；PRIM1可能參與肺腺癌的發(fā)生[13]；PRIM1在體外和體內(nèi)均可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的增殖[14]。以上結(jié)果提示，PRIM1與多種癌癥進(jìn)程相關(guān)。PRIM1在LIHC中失調(diào)，提示其可能在LIHC的發(fā)生發(fā)展中具有潛在作用。

1 材料和方法

1.1 TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫

使用TIMER 2.0[15-17](http:∥timer.cistrome.org/)分析PRIM1在各類型癌癥中的表達(dá)情況。

1.2 GEO數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)

從GEO數(shù)據(jù)庫[18-19](https: ∥ www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)挑選包含LIHC腫瘤和非腫瘤樣品的GEO基因芯片系列(GSE19665，GSE84402、GSE121248)，GEO芯片系列的平臺(tái)和樣品(表1)[20-22]。

表1 分析中包含的GEO系列詳細(xì)信息

1.3 R語言分析

使用R語言版本3.5.1，通過R Limma[23]包將每個(gè)GEO數(shù)據(jù)集的微陣列原始CEL文件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并將標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)水平表示為log2轉(zhuǎn)化值，比較腫瘤和非腫瘤樣品mRNA的表達(dá)。使用R clusterProfiler[24]包的enrichplot功能和GOplot[25]包將共表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，包括生物學(xué)過程(Biological Process, BP)，細(xì)胞成分(Cellular Component, CC)和分子功能(Molecular Function, MF)與KEGG富集分析，并輸出可視化結(jié)果。

1.4 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析

使用UALCAN[26](http:∥ualcan.path.uab.edu)分析各個(gè)癌癥分期、腫瘤等級(jí)等腫瘤亞組中腫瘤和正常樣品中基因的相對(duì)表達(dá)。

1.5 cBioPortal數(shù)據(jù)庫分析

使用cBioPortal[27-28](http:∥cbioportal.org)分析了LIHC中PRIM1的突變情況，拷貝數(shù)變異(Copy number variation, CNV)，通過共表達(dá)模塊功能分析出排名前50的共表達(dá)基因。

1.6 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析

使用Kaplan-Meier Plotter[29](https:∥kmplot.com/analysis/index.php?p=background)比較PRIM1高低表達(dá)組的生存時(shí)間差異。

1.7 OncoLnc 數(shù)據(jù)庫

使用OncoLnc(http:∥www.oncolnc.org/)評(píng)估驗(yàn)證PRIM1對(duì)LIHC預(yù)后的影響。

1.8 The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫分析

使用The Human Protein Atlas(HPA)[30](https:∥www.proteinatlas.org/)比較PRIM1蛋白在肝癌組織和正常組織中的表達(dá)情況。

1.9 細(xì)胞培養(yǎng)和qPCR

對(duì)HL7702(正常肝細(xì)胞系，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫)和Hep G2(肝癌細(xì)胞系，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫)進(jìn)行10% FPS/DMEM培養(yǎng)，TRIZOL裂解細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。參考PRIM1引物序列[9]，通過LightCycler 96進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)檢測(cè)PRIM1和內(nèi)參基因β-actin的表達(dá)，評(píng)估PRIM1 mRNA在正常和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 PRIM1 mRNA在LIHC中表達(dá)水平

TIMER數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，PRIM1在包括LIHC在內(nèi)的多種癌癥中失調(diào)(圖1a)，GEO數(shù)據(jù)庫LIHC相關(guān)的多個(gè)GSE數(shù)據(jù)集、qPCR結(jié)果和HPA數(shù)據(jù)庫免疫組化的結(jié)果均證實(shí)了PRIM1在LIHC中高表達(dá)(圖1b-f)。

(a)PRIM1在包括LIHC在內(nèi)的多種癌癥中的表達(dá)水平

2.2 PRIM1表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)

為探究PRIM1表達(dá)量與臨床特征之間的關(guān)系，對(duì)TCGA中371例HCC樣品根據(jù)性別、年齡、種族、癌癥分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、腫瘤分級(jí)和TP53突變狀態(tài)(p<0.05)進(jìn)行多亞組分析(圖2)。

(a)樣本類型 (b)性別

結(jié)果表明，PRIM1高表達(dá)且與患者性別無關(guān)(圖2b)；41-60年齡組PRIM1表達(dá)明顯高于61-80年齡組(圖2c)，可區(qū)分不同年齡段患者；高加索組PRIM1表達(dá)低于亞洲組(圖2d)，可區(qū)分不同種族；1～3期PRIM1表達(dá)高于正常組，4期出現(xiàn)大幅減低(圖2e)，可輔助判斷癌癥分期；無轉(zhuǎn)移組PRIM1表達(dá)高于正常組(圖2f)，可判斷是否出現(xiàn)轉(zhuǎn)移；3級(jí)PRIM1表達(dá)顯著高于1級(jí)(圖2g)，可輔助判斷腫瘤分級(jí)；TP53突變組顯著高于未突變組(圖2h)，表明TP53突變顯著影響PRIM1表達(dá)。以上結(jié)果表明，高PRIM1表達(dá)與LIHC多種臨床特征相關(guān)，可將PRIM1的表達(dá)作為L(zhǎng)IHC中潛在的診斷指標(biāo)。

2.3 PRIM1基因組突變和共表達(dá)基因

基因組突變與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[31]。為此，使用cBioPortal數(shù)據(jù)庫分析了LIHC中PRIM1的基因組改變情況。數(shù)據(jù)顯示，在353患者中有7例(2%)PRIM1 發(fā)生改變(圖3a)。這些改變包括意義未知的錯(cuò)義突變1例，意義未知的截?cái)嗤蛔?例和擴(kuò)增5例的多種改變，且存在拷貝數(shù)變異(Copy number variation, CNV)和氨基酸點(diǎn)位突變(圖3a-d)。以上結(jié)果提示，LIHC中發(fā)現(xiàn)PRIM1的基因改變，可能在LIHC的發(fā)生發(fā)展中具有潛在作用，有待深入探究。使用共表達(dá)模塊，分析出與PRIM1共表達(dá)前50個(gè)關(guān)鍵基因。

圖 3 LIHC中PRIM1的基因組突變

2.4 LIHC中PRIM1共表達(dá)基因的富集分析

PRIM1在LIHC中潛在的功能，可能是由于PRIM1基因組改變以及和多個(gè)基因共同作用的結(jié)果。為此，利用R語言 enrichplot和GOplot包對(duì)PRIM1共表達(dá)前50基因進(jìn)行GO注釋和KEGG分析(圖4a-d)。

(a)生物學(xué)過程(BP)富集結(jié)

結(jié)果表明，其參與的生物學(xué)過程(BP)有：DNA復(fù)制、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)、有絲分裂核分裂、有絲分裂細(xì)胞周期G1/S期過渡、細(xì)胞周期G1/S相變等。組成的細(xì)胞成分(CC)有：染色體區(qū)域、染色體著絲粒區(qū)、濃縮染色體、染色體端粒區(qū)、復(fù)制叉、MCM復(fù)合體等。涉及到的分子功能(MF)有：ATP酶活性、作用于DNA的催化活性、DNA依賴性ATP酶活性、單鏈DNA結(jié)合、DNA復(fù)制起點(diǎn)結(jié)合、3′-5′ DNA解旋酶活性等。參與的信號(hào)通路(KEGG)有：細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、錯(cuò)配修復(fù)、鉑耐藥等。對(duì)共表達(dá)基因進(jìn)行富集分析，有助于了解PRIM1與其共表達(dá)基因在LIHC中的作用機(jī)理和過程。

2.5 PRIM1在LIHC中的預(yù)后價(jià)值

使用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫評(píng)估PRIM1表達(dá)與LIHC患者的預(yù)后關(guān)系。根據(jù)PRIM1表達(dá)水平的中位數(shù)，將患者分為兩組。數(shù)據(jù)(圖5)顯示：與低表達(dá)組相比，PRIM1高表達(dá)組患者5年OS、無進(jìn)展生存(Progression Free Survival, PFS)、無復(fù)發(fā)生存(Relapse Free Survival, RFS)和疾病特異性生存(Disease Free Survival, DSS)均較差(logrankp<0.05)(圖5a-d)。OncoLnc數(shù)據(jù)庫表明，PRIM1高表達(dá)與LIHC較差的OS相關(guān)。以上結(jié)果提示，LIHC中高PRIM1表達(dá)可能是一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，其導(dǎo)致LIHC患者的不良預(yù)后。

圖 5 PRIM1表達(dá)的Kaplan-Meier曲線

3 討論與結(jié)論

Sine Oculis Homeobox Homolog 1(SIX1)表達(dá)的增加導(dǎo)致PRIM1等上調(diào)，促進(jìn)了宮頸癌細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)[32]；PRIM1失活通過S期停滯和Wee1介導(dǎo)的caspase8依賴的凋亡，使結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)磷脂酰肌醇3激酶相關(guān)激酶ATR和CHK1激酶抑制劑敏感[33]；PRIM1受到血清雌二醇(E2)誘導(dǎo)的ER激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，靶向PRIM1蛋白表達(dá)顯著降低ER+乳腺癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[9]。目前針對(duì)PRIM1的研究較少，其功能和作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

本研究中，我們闡述了PRIM1在多種類型癌中失調(diào)且在LIHC中高表達(dá)?；谂R床病例特征進(jìn)行亞組分析表明，PRIM1對(duì)所有亞型和不同種族的LIHC診斷有用，其可能是潛在的診斷和預(yù)后標(biāo)志物有待臨床驗(yàn)證。癌癥進(jìn)程伴隨著基因組變異，PRIM1基因組發(fā)生的遺傳改變，提示其可能在LIHC中具有潛在作用。對(duì)PRIM1相關(guān)的共表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，有助于了解PRIM1在LIHC中參與的生物學(xué)過程和信號(hào)通路，為研究PRIM1在LIHC中的作用提供方向。分析預(yù)后因素有助于臨床治療的決策。研究表明，高表達(dá)PRIM1與較差的OS、PFS、RFS和DSS有關(guān)，可能是LIHC預(yù)后不良的預(yù)測(cè)指標(biāo)，表明PRIM1表達(dá)水平可能是LIHC生存需要考慮的重要因素，值得進(jìn)一步探究。我們的研究為理解PRIM1在LIHC中的潛在作用及其作為癌癥生物標(biāo)志物的應(yīng)用提供了新視角。