玻璃化冷凍對卵母細胞、胚胎和子代的影響及其相關表觀遺傳學的研究進展

以善佳，李慕軍，馬文紅,3*

(1.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧 530022；2.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院，桂林 541001；3.柳州市婦幼保健院，柳州 545002)

人類輔助生殖技術(ART)是通過各種醫(yī)療輔助手段幫助不孕不育夫婦獲得妊娠與活產(chǎn)的技術，由于促排卵技術的廣泛應用，以及全胚冷凍策略的興起，體外受精-胚胎移植(IVF-ET)助孕過程中卵母細胞和胚胎冷凍現(xiàn)象越來越普遍，且不同時期卵母細胞及胚胎的冷凍保存和復蘇是IVF技術的一個重要環(huán)節(jié)。卵母細胞和胚胎的冷凍方法主要分為玻璃化冷凍和程序化冷凍。相對于程序化冷凍，玻璃化冷凍復蘇操作更加簡單，不需要使用昂貴的程序冷凍儀，條件更容易滿足，冷凍速度更快[1]。玻璃化冷凍復蘇技術已被廣泛運用于各個生殖中心，但是玻璃化冷凍對于卵母細胞、胚胎及其相關DNA甲基化、基因組印跡和組蛋白修飾等表觀遺傳修飾的影響，目前仍知之甚少。本文就這一問題進行相關文獻復習和總結，期望為改善玻璃化冷凍后卵母細胞及胚胎質量的實驗及臨床活動提供理論依據(jù)。

一、玻璃化冷凍在ART中的應用背景

在上世紀80年代，“玻璃化冷凍”技術首次問世。Rall等[2]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度冷凍保護劑及極速降溫的方法可減少小鼠胚胎在冷凍過程中冰晶形成，避免冰晶對胚胎損傷，從此開啟了世界各國對動物及人類胚胎及配子玻璃化冷凍的實驗研究及探索。隨著冷凍保護劑的不斷改善以及冷凍技術的進步，玻璃化冷凍已廣泛應用于卵裂期及囊胚期胚胎冷凍，也是臨床生育力保存中的主要應用技術[1，3-4]。卵母細胞因其細胞結構特殊性導致玻璃化冷凍的臨床應用時間及范圍遠不及胚胎，近幾十年卵母細胞玻璃化冷凍技術已不斷改進，取得了質的飛躍。陳子江教授團隊報道了我國第1例卵母細胞經(jīng)玻璃化冷凍復蘇后受精，患者成功受孕并分娩一對雙胞胎[5]。孫賢等[6]通過回顧其中心玻璃化冷凍卵母細胞行卵胞漿內單精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)患者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)經(jīng)玻璃化冷凍的卵母細胞可獲得與新鮮卵母細胞相近的臨床結局。雖然卵母細胞及胚胎玻璃化冷凍相比于過去的程序化冷凍有較好的臨床結局，但由于卵母細胞及胚胎的玻璃化冷凍過程中需使用高濃度的冷凍保護劑以及許多人為干預操作，因此玻璃化冷凍對卵母細胞和胚胎的質量、臨床結局和子代的安全性是否有不良影響而備受關注和重視。

二、卵母細胞玻璃化冷凍對胚胎及子代的影響

1999年，Kuleshova等[7]首次報道運用開放式拉細麥管對人類卵母細胞玻璃化冷凍及復蘇，再行ICSI獲得可移植胚胎并使患者順利分娩一健康子代。動物實驗表明，相較于傳統(tǒng)程序化冷凍，小鼠MⅡ期卵母細胞經(jīng)玻璃化冷凍后存活率更高，保存效果更好；而玻璃化冷凍卵母細胞解凍后更容易形成8細胞期胚胎和囊胚[8]。

1.卵母細胞玻璃化冷凍對胚胎的影響：與新鮮卵母細胞相比較，哺乳動物卵母細胞玻璃化冷凍復蘇過程會導致卵母細胞損傷[3，9]。卵母細胞經(jīng)玻璃化冷凍后可出現(xiàn)空泡增多、線粒體-平滑內質網(wǎng)與線粒體-囊泡復合物聚集以及皮質顆粒增多等超微結構改變[10]。Cobo等[11]研究顯示，玻璃化冷凍復蘇后卵母細胞發(fā)育到囊胚期的速度減慢，但胚胎著床率并無明顯改變。在胚胎發(fā)育質量與發(fā)育潛能上，小鼠卵母細胞經(jīng)玻璃化冷凍后其卵裂率和囊胚率下降[12]。近期研究結果顯示，人卵母細胞玻璃化冷凍復蘇后再行ICSI治療，冷凍組優(yōu)質胚胎率較新鮮組明顯下降[13]，說明卵母細胞玻璃化冷凍可能會降低胚胎發(fā)育潛能。Chamayou等[14]使用植入前遺傳學診斷(PGD)技術對玻璃化冷凍卵母細胞發(fā)育的囊胚進行整倍體分析，結果表明其囊胚整倍體率和非整倍體率與新鮮卵母細胞發(fā)育囊胚無統(tǒng)計學差異。

2.卵母細胞玻璃化冷凍對子代的影響：因為人類卵母細胞玻璃化冷凍技術應用時間較短，目前并沒有其相關兒童健康的長期跟蹤研究，因此分析圍產(chǎn)期結局以及出生兒童發(fā)育有利于排除該項技術對后代的不利影響。國內外研究顯示，經(jīng)玻璃化冷凍卵母細胞出生兒童與新鮮卵母細胞出生兒童相比，其出生體重、新生兒出生缺陷率、圍產(chǎn)兒死亡率等結局均無統(tǒng)計學差異[11，13]。

總之，以往研究雖然顯示卵母細胞玻璃化冷凍后其超微結構、胚胎發(fā)育速度及發(fā)育潛能有所改變，但妊娠結局、新生兒情況與新鮮卵母細胞相比無顯著差異，且卵母細胞玻璃化冷凍后胚胎形成和胚胎質量優(yōu)于程序化冷凍，這些也初步證明了卵母細胞玻璃化冷凍的安全性及有效性。當然，玻璃化冷凍技術在人類卵母細胞的應用仍是近10～20年的事情，其遠期風險不詳，仍需要進一步密切觀察評估。

三、胚胎玻璃化冷凍對妊娠結局及子代的影響

人類胚胎玻璃化冷凍技術的開展稍早于卵母細胞玻璃化冷凍技術。1998年日本學者Mukaida等[15]已經(jīng)報道了世界首例通過玻璃化冷凍技術凍存并復蘇人類胚胎從而使患者獲得成功妊娠及胎兒分娩。

1.胚胎玻璃化冷凍對胚胎發(fā)育的影響：目前研究顯示，不同時期小鼠胚胎經(jīng)玻璃化冷凍對胚胎的存活率影響不一。與新鮮胚胎相比，2細胞期小鼠胚胎經(jīng)玻璃化冷凍后胚胎發(fā)育速率較低，但是囊胚形成率沒有顯著下降[16]。而8細胞期胚胎經(jīng)玻璃化冷凍可導致小鼠胚胎存活率下降[17]。與程序化冷凍相比，人類胚胎經(jīng)玻璃化冷凍可顯著提高胚胎復蘇率和胚胎利用率，胚胎存活率通常高于95%，并且可以從受精卵到囊胚期的任何階段進行玻璃化冷凍保存，但最有效且對患者最有利的冷凍保存階段是囊胚期[3，18]。重要的是，人類胚胎玻璃化冷凍復蘇后移植并不增加胚胎染色體核型異常的發(fā)生率[19]。

2.胚胎玻璃化冷凍對妊娠結局的影響：與新鮮胚胎移植組比較，胚胎玻璃化冷凍組在胚胎著床率、臨床妊娠率、多胎妊娠率、流產(chǎn)率等臨床結局上均無明顯差異，甚至有更高的胚胎著床率和臨床妊娠率，而胚胎玻璃化冷凍組單胎分娩新生兒早產(chǎn)率較新鮮胚胎移植組增高[3，20]。

3.胚胎玻璃化冷凍對子代的影響：目前關于玻璃化冷凍復蘇胚胎移植對子代影響的研究尚存在較多分歧。有研究顯示，與新鮮胚胎移植比較，玻璃化冷凍復蘇胚胎移植并未增加子代出生缺陷的風險[19]。另一項研究結果則認為，玻璃化冷凍復蘇胚胎移植會增加子代巨大兒發(fā)生率[21]。而小鼠胚胎研究顯示，凍胚移植子代小鼠在性成熟期脂肪含量高于鮮胚移植或自然交配產(chǎn)生的子代小鼠[22]。

綜上所述，相較于新鮮胚胎移植，胚胎經(jīng)玻璃化冷凍復蘇后移植并未降低胚胎著床率，未增加胚胎染色體異常發(fā)生率，但對子代出生缺陷的風險尚不明確，并且有可能對子代后期的生長發(fā)育存在負面影響。除此之外，胚胎玻璃化冷凍是否會對母嬰結局有其他影響需加強后續(xù)子代的長期隨訪研究。

四、玻璃化冷凍對卵母細胞、胚胎影響的相關表觀遺傳學改變

為了更透徹的認識卵母細胞及胚胎經(jīng)玻璃化冷凍后對胚胎質量、生育結局及子代的影響，研究者們從分子層面探索玻璃化冷凍對卵母細胞和胚胎的影響機制。目前研究發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍不會引起DNA序列的改變，但可導致核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下基因表達水平的可遺傳變化即表觀遺傳修飾的變化，這種基因表達水平的改變可以在一生中都非常穩(wěn)定，或只在生長發(fā)育過程中發(fā)生短暫變化[23]。胚胎形成期表觀遺傳修飾的改變是目前研究的熱點。常見的表觀遺傳修飾改變包括但不限于DNA甲基化、基因組印跡、組蛋白修飾、染色質重塑、非編碼RNA調控等一系列DNA和染色質修飾[24]，最常見的是DNA甲基化和組蛋白修飾，而基因組印跡的分子機理與DNA甲基化、組蛋白修飾密切相關。

1.DNA全基因組甲基化：在受精卵到囊胚的發(fā)育過程中，母本和父本基因組均不可避免的經(jīng)歷DNA去甲基化到再次建立DNA甲基化的過程，而配子和胚胎玻璃化冷凍與其關系密切。

目前卵母細胞經(jīng)玻璃化冷凍后是否引起胚胎全基因組甲基化水平改變尚無定論。De Munck等[25]發(fā)現(xiàn)，與新鮮卵母細胞比較，經(jīng)玻璃冷凍后人類卵母細胞以及發(fā)育至第3天的胚胎其全基因組甲基化水平均無明顯改變。然而一些研究結果則相反，顯示小鼠卵母細胞玻璃化冷凍會導致其DNA甲基化水平顯著下降[26-27]。

與卵母細胞不同，多項研究結果均顯示，胚胎經(jīng)玻璃化冷凍后其整體甲基化水平發(fā)生顯著變化。Movahed等[16]研究顯示，小鼠2細胞胚胎經(jīng)玻璃化冷凍后，囊胚形成率沒有顯著下降，但胚胎DNA甲基化水平穩(wěn)步下降。Yao等[28]研究表明，小鼠8細胞胚胎經(jīng)玻璃化冷凍后其囊胚形成率沒有顯著下降，但8細胞胚胎及囊胚DNA甲基化水平明顯下降。

2.基因組印跡：基因組印跡又稱為遺傳印跡、親代印跡或配子印跡，是指在配子或合子發(fā)生期間，來源于親本染色體或等位基因發(fā)生的獨特改變和修飾，使父本或母本的某一方等位基因被沉默，導致其子代體細胞中來自于父本和母本等位基因出現(xiàn)表達活性差異。因此，具有這種差異的基因被稱為印跡基因。基因組印跡的分子機理與DNA甲基化、組蛋白修飾密切相關。

H19基因是父源印跡而母源表達的印跡基因，胰島素樣生長因子2(IGF2)基因是母源印跡基因并與H19基因緊密相連，受同一個差異性甲基化區(qū)域(DMR)調控[29]。大量實驗研究證明，玻璃化冷凍會影響配子及胚胎基因組印跡水平[29-30]。在胚胎早期發(fā)育過程中，印跡首先在初級生殖細胞中被擦除，在配子發(fā)生期間重新建立，然后在后期的胚胎發(fā)育以及胎兒生長至成年保持不變[31]。因此在受精卵形成至胚胎早期，H19基因與IGF2基因表達是一個動態(tài)變化的過程。玻璃化冷凍胚胎會導致H19和IGF2基因異常甲基化。H19基因異常低甲基化狀態(tài)或高甲基化狀態(tài)均可導致胎兒發(fā)育異常，與胎兒生長受限綜合征(SRS)及胎兒生長過度綜合征(BWS)密切相關[32]。Wang等[29]實驗結果顯示，小鼠桑椹胚經(jīng)玻璃化冷凍復蘇后移植可導致胎鼠H19基因甲基化水平下降。而另一項實驗結果則表明，玻璃化冷凍小鼠胚胎可導致胚胎存活率較新鮮胚胎下降，著床后胚胎H19基因表達水平明顯增高；但H19基因水平變化并未出現(xiàn)在后期胎盤組織中，并且玻璃化冷凍并未改變小鼠胚胎及胎盤H19基因甲基化水平[17]。卵母細胞及早期胚胎的玻璃化冷凍是否會導致H19基因異常甲基化狀態(tài)，還需進一步實驗驗證。

母源性印跡、父源性表達印跡基因Peg3、Peg10與參與促進胎盤發(fā)育的C2H2型鋅指蛋白生成密切相關[33]。動物實驗研究顯示，小鼠卵母細胞經(jīng)玻璃化冷凍后Peg3甲基化水平無明顯改變，但其囊胚Peg3-DMR甲基化水平顯著下降[30]；而小鼠卵母細胞經(jīng)玻璃化冷凍后Peg10表達水平顯著上升，相反IGF2R基因表達水平明顯下降[34]。同樣是母源性印跡、父源性表達的小核核糖核蛋白N(Snrpn)印跡基因，與細胞分化、增殖、胚胎正常發(fā)育有關[35]。印跡基因Snrpn的異常甲基化狀態(tài)與Prader-Willi綜合征、Angelman綜合征有關[36-37]。姚建鳳等[35]發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠婦女分娩后胎盤組織比較，接受IVF-ET治療的婦女新鮮周期組和玻璃化冷凍組胎盤組織Snrpn mRNA水平和蛋白質水平均表達增高，但新鮮周期組和玻璃化冷凍組組間差異無統(tǒng)計學意義。相關研究顯示，玻璃化冷凍一定程度上可影響卵母細胞、胚胎甚至胎盤中Peg3、Peg10、Snrpn等印跡基因的表達。

3.組蛋白修飾：基因被組蛋白包裹會影響其與轉錄復合物結合，影響基因轉錄。若想開啟基因轉錄表達，需要改變組蛋白修飾狀態(tài)，使其和DNA的結合變得松弛才能實現(xiàn)。常見的組蛋白修飾包括乙?；⒓谆?、泛素化、磷酸化等[38]，而目前研究與卵母細胞和胚胎玻璃化冷凍相關的組蛋白修飾主要為組蛋白乙?；图谆?。

組蛋白乙?；航M蛋白乙?；墙M蛋白表觀修飾方式之一，組蛋白乙?；腿ヒ阴；癄顟B(tài)主要由組蛋白乙?；D移酶(HATs)與去乙?；?HDACs)這兩類乙?；揎椕腹餐饔枚_到平衡。當組蛋白乙?；c去乙?；?、HATs和HDACs之間的平衡異常，則會影響DNA復制和轉錄過程，導致卵母細胞及胚胎發(fā)育異常。有文獻報道，玻璃化冷凍會增加小鼠MⅡ期卵母細胞中組蛋白H4K12[39]和H3K9[40]的乙?；?，降低小鼠MⅡ期卵母細胞HDAC1[40]水平。相對較低組蛋白乙酰化水平是玻璃化冷凍卵母細胞成熟能力的關鍵，低HDAC6水平的小鼠卵母細胞玻璃化冷凍后存活率、卵裂率和囊胚形成率均降低，用HDAC6反義轉染卵母細胞可顯著提高卵母細胞玻璃化冷凍后的存活率、卵裂率和囊胚率[41]。也有其他研究報道，玻璃化冷凍小鼠2細胞期胚胎可增加其卵裂期及囊胚期胚胎組蛋白H3K9乙?；絒42]?？傮w上來說，玻璃化冷凍卵母細胞、胚胎會促進卵母細胞和早期胚胎組蛋白乙酰化高水平表達，這與玻璃化冷凍導致HATs和HDACs之間的平衡異常以及早期胚胎基因組激活較少有關，但是否會導致囊胚期組蛋白乙?；礁淖?，還需擴大樣本量深入研究。

組蛋白甲基化：組蛋白甲基化修飾主要發(fā)生在組蛋白的賴氨酸和精氨酸殘基上，特定的組蛋白甲基化修飾可以調控早期胚胎的命運，并對維持胚胎多功能性起著重要作用。早期胚胎組蛋白低甲基化水平與胚胎異常形態(tài)有關[43]，有可能是胚胎發(fā)育不良的預測指標。H3K9甲基化水平在胚胎發(fā)育過程中非常重要，相對較高H3K9甲基化水平可提高囊胚形成率[24]。研究表明，玻璃化冷凍小鼠MⅡ期卵母細胞H3K9甲基化水平增高，繼續(xù)體外培養(yǎng)至2細胞期及4細胞期胚胎，發(fā)現(xiàn)卵裂期胚胎H3K9甲基化水平降低，而胚胎繼續(xù)發(fā)育至囊胚期，H3K9甲基化水平恢復至正常水平[43]。以此推測，卵母細胞玻璃化冷凍后發(fā)育成囊胚過程中，可能主動調整了卵母細胞及早期卵裂期胚胎的異常組蛋白甲基化水平，這些異常可以通過某些機制在早期卵裂期胚胎中得到部分糾正，胚胎最終發(fā)育到囊胚階段。

五、結語

卵母細胞和胚胎玻璃化冷凍及復蘇技術已被廣泛運用于各生殖中心，玻璃化冷凍技術相較于程序化冷凍不僅有著安全、經(jīng)濟、便捷的優(yōu)勢，還可提高胚胎的復蘇率和利用率。動物實驗提示，經(jīng)玻璃化冷凍復蘇的胚胎產(chǎn)生的子代其體重及脂肪含量增加，但是卵母細胞、胚胎玻璃化冷凍是否會對母嬰結局有其他影響仍需加強后續(xù)子代的長期隨訪研究。目前研究結果表明，雖然卵母細胞和胚胎玻璃化冷凍不改變哺乳動物DNA序列，但可導致基因表觀遺傳修飾水平的變化進而影響其靶基因表達水平，包括DNA甲基化和組蛋白修飾等復雜且動態(tài)的改變。廣泛、深入、系統(tǒng)地研究卵母細胞和胚胎經(jīng)玻璃化冷凍后所造成的表觀遺傳學改變，可以為改善玻璃化冷凍卵母細胞及胚胎技術、了解玻璃化冷凍對妊娠結局及子代長遠影響的機制提供理論依據(jù)。