齊廣耀 張書(shū)菡 孫建平 劉雅輝 蘇斌 呂騏羽 姜淑霞

摘要：為研究大球蓋菇出菇后剩余栽培基質(zhì)（菌渣）就地還田對(duì)濱海鹽堿土區(qū)林地土壤的改良效果，選用3種不同含鹽量的林地栽培大球蓋菇，將出菇后的菌渣就地混翻于0～20cm土層中，自然降解4個(gè)月后，研究其對(duì)試驗(yàn)林地土壤理化性質(zhì)、養(yǎng)分含量及土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明：3種濱海鹽堿土區(qū)林地土壤的EC值、含鹽量及容重均顯著降低;土壤孔隙度、水穩(wěn)性團(tuán)聚體、有機(jī)質(zhì)、速效磷、堿解氮含量均顯著提高;3個(gè)處理樣地真菌群落的Beta多樣性變化明顯，強(qiáng)度鹽化處理樣地（Z2s）土壤真菌群落的Alpha多樣性顯著提高。環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析表明，濱海鹽堿土區(qū)林地理化性質(zhì)與土壤真菌群落分布顯著相關(guān)。綜之，施入大球蓋菇菌渣能有效降低濱海鹽堿土區(qū)林地的土壤含鹽量，優(yōu)化土壤理化性質(zhì)，改善土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，改良效果顯著。

關(guān)鍵詞：大球蓋菇菌渣;鹽堿土改良;土壤理化性質(zhì);土壤真菌群落

中圖分類(lèi)號(hào)：S156.4+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2022）01-0104-07

我國(guó)濱海鹽堿土總面積達(dá)500萬(wàn)hm2，多年來(lái)主要采取一些物理措施，如整土、覆蓋、深耕、添加磷石膏、沸石粉及井溝渠灌等來(lái)改變鹽堿地的土壤結(jié)構(gòu)，降低其含鹽量[1]，這些措施達(dá)到一定的改良效果。但物理措施和水利工程方法需較大的工程量和較高的投資成本，化學(xué)手段存在二次污染等問(wèn)題。食用菌出菇后剩余的栽培基質(zhì)又稱(chēng)為菌渣，具有容重小、通氣性好的特性，富含大量纖維素、菌絲蛋白等有機(jī)質(zhì)和多種微生物及酶等其他活性物質(zhì)[2，3]。國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)菌渣對(duì)改良土壤理化性狀、增加土壤養(yǎng)分含量、改良土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)吸收都有著積極作用[4-7]。

大球蓋菇（Strophariarugosoannulata）是近年來(lái)我國(guó)新興起栽培的一種珍稀食用菌品種，可在田間、林下、大棚等地進(jìn)行栽培。其栽培模式主要以各種農(nóng)林廢棄物為原料，通過(guò)堆積發(fā)酵、鋪料、播種進(jìn)行栽培生產(chǎn)，"菇后殘余的大量栽培基質(zhì)（菌渣）可以就地還田，有改良土壤的作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明大球蓋菇在林地栽培出菇后，菌渣就地還田對(duì)林地土壤有較好的土壤改良效果[8]。然而菌渣還田對(duì)濱海鹽堿土的影響研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)通過(guò)探究3種不同含鹽量的濱海鹽堿土區(qū)林地栽培大球蓋菇出菇后，其菌渣就地還田對(duì)鹽堿地土壤理化性質(zhì)、養(yǎng)分含量以及真菌群落的影響，以期為大球蓋菇鹽堿地栽培及其菌渣還田改良鹽堿地技術(shù)的推廣提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況及材料

試驗(yàn)地位于山東省林業(yè)科學(xué)研究院東營(yíng)分院（E118°41′33″，N37°24′35″）栽植的白蠟林下，樹(shù)齡6年，株行距3m×4m，郁閉度0.7。土壤類(lèi)型為中度～強(qiáng)度鹽化土，為典型的濱海林地鹽堿土（含鹽量2‰ ～6‰），土壤性狀背景值見(jiàn)表1。當(dāng)?shù)啬昃鶜鉁?2.8℃，年均降水量555.9mm，年均日照時(shí)數(shù)2657.5h。

供試菌渣為2018年10月—2019年5月在鹽堿區(qū)林下栽培大球蓋菇出菇后的栽培基質(zhì)?；|(zhì)配方為稻殼45%、闊葉雜木屑38%、玉米芯10%、林地土5%、生石灰2%，666.7m2栽培料施用量6500kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

2019年6月3日出菇結(jié)束后，將3塊鹽堿地上的菌渣，用旋耕機(jī)就地旋耕于地下，深度20cm。菌渣施入量（自然干重，含部分土壤）約20kg/m2。小區(qū)面積30m2，每處理重復(fù)3次。各重復(fù)地塊之間相隔5m，對(duì)照組與處理組相隔10m。對(duì)照組只旋耕不添加菌渣。試驗(yàn)處理見(jiàn)表2。

1.3 取樣方法

菌渣施入土壤自然降解4個(gè)月后，用環(huán)刀法取土樣用于測(cè)定土壤物理指標(biāo)。通過(guò)五點(diǎn)法采集0～20cm土層土壤，上下層土混勻，四分法留取土樣，之后立即過(guò)2mm網(wǎng)篩，裝入已消毒的密封塑料袋中，液氮條件下保存帶回實(shí)驗(yàn)室，一半用于測(cè)定土壤微生物指標(biāo)，一半風(fēng)干用于測(cè)定土壤理化指標(biāo)。

1.4 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤容重用環(huán)刀法測(cè)定，孔隙度（%）=（1-容重/土粒密度）×100，pH值采用pHS-2C型數(shù)字酸度計(jì)測(cè)定，電導(dǎo)率（EC5∶1）采用DDS-11A型電導(dǎo)儀測(cè)定，土壤水穩(wěn)團(tuán)聚體采用濕篩法測(cè)定，有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀氧化-比色法測(cè)定，堿解氮采用擴(kuò)散吸收法測(cè)定，有效磷采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定，土壤含鹽量用電導(dǎo)率法測(cè)定[9]。

1.5 土壤真菌高通量測(cè)定

1.5.1 土壤微生物DNA提取、測(cè)序、處理 采用CTAB法[10]對(duì)所采樣本的基因組DNA進(jìn)行提取。以稀釋后的基因組DNA 為模板，使用帶Barcode的特異引物ITS5-1737F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG - 3′）/ITS2 - 2043R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′），以及高保真酶擴(kuò)增ITS1區(qū)域。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5min;94℃ 45s，58℃ 45s，72℃ 60s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸7min。

PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，對(duì)目的條帶使用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。使用TruSeq DNAPCR-FreeSamplePreparationKit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit和Q-PCR定量，使用HiSeq2500PE250進(jìn)行上機(jī)測(cè)序（北京諾禾致源生物信息科技有限公司）。根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后使用FLASH對(duì)每個(gè)樣品的reads進(jìn)行拼接，得到的拼接序列為原始Tags數(shù)據(jù)（rawtags）;拼接得到的rawtags，參照Qiime的Tags質(zhì)量控制流程，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的過(guò)濾處理得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)（cleantags）[11，12]。經(jīng)過(guò)以上處理后得到的Tags序列通過(guò)UCHIMEAlgorithm與數(shù)據(jù)庫(kù)Golddatabase進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)并去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)（effectivetags）[13，14]。

1.5.2 OTU聚類(lèi)和物種注釋 利用Uparse軟件[15]對(duì)所有樣品的全部有效序列（effectivetags）進(jìn)行聚類(lèi)，默認(rèn)以97%的一致性（identity）將序列聚類(lèi)成為OTUs（operationaltaxonomicunits），同時(shí)選取OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為代表序列。用SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)[16]對(duì)代表序列進(jìn)行物種注釋?zhuān)@得分類(lèi)學(xué)信息并分別在各個(gè)分類(lèi)水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。使用PyNAST軟件[17]與GreenGene數(shù)據(jù)庫(kù)中的“CoreSet”數(shù)據(jù)信息進(jìn)行快速多序列比對(duì)，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后以reads數(shù)最少的樣品為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，后續(xù)的Alpha多樣性和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

土壤理化性質(zhì)數(shù)據(jù)及微生物相對(duì)豐富度數(shù)據(jù)采用MicrosoftExcel2010進(jìn)行處理和圖表繪制;應(yīng)用IBMSPSS21.0中的Duncan’s法進(jìn)行單因素方差分析。使用Qiime軟件（Version1.7.0）計(jì)算土壤Observedspecies、ShannonWiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù);使用R軟件進(jìn)行Alpha多樣性、Beta多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大球蓋菇菌渣對(duì)鹽堿土區(qū)林地土壤理化性質(zhì)的影響

2.1.1 對(duì)土壤物理性質(zhì)的影響 由表3看出，與各自對(duì)照相比，施入大球蓋菇菌渣的各處理土壤容重顯著降低，土壤孔隙度、水穩(wěn)性團(tuán)聚體顯著增加。其中，M1s、Z1s、Z2s處理土壤容重分別降低34.07%、46.58%、48.48%，土壤孔隙度分別增加28.78%、52.90%、52.50%，水穩(wěn)性團(tuán)聚體分別增加58.54%、111.33%、123.82%。各處理組間差異不顯著，對(duì)照組間比較，M1ck的土壤容重、土壤孔隙度與Z1ck、Z2ck間差異顯著，M1ck的水穩(wěn)性團(tuán)聚體與Z2ck間差異顯著。結(jié)果表明，施入大球蓋菇菌渣后顯著改善了濱海鹽堿土區(qū)林地的物理性質(zhì)。

2.1.2 對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)和養(yǎng)分的影響 由表4看出，與各自對(duì)照相比，施加大球蓋菇菌渣的各處理土壤EC值、含鹽量均顯著降低，土壤EC值分別降低40.43%、83.03%、88.98%，含鹽量分別降低45.45%、85.34%、90.42%;各處理組間EC值、含鹽量差異不顯著，各對(duì)照組間差異顯著。各處理土壤有機(jī)質(zhì)、速效磷、堿解氮均顯著提高，土壤有機(jī)質(zhì)分別提高87.15%、138.50%、238.90%，速效磷分別提高401.33%、642.28%、965.80%，堿解氮分別提高79.86%、179.57%、269.89%。各處理組間有機(jī)質(zhì)、速效磷、堿解氮差異不顯著，各對(duì)照組間差異顯著（Z1ck與Z2ck速效磷除外）。

2.2 大球蓋菇菌渣對(duì)鹽堿土區(qū)林地土壤真菌群落的影響

2.2.1 對(duì)土壤真菌群落分布特征的影響 測(cè)定結(jié)果表明，各處理得到有效序列均超過(guò)55000個(gè)，OTUs數(shù)目在400～800之間。各處理真菌的相對(duì)豐富度在門(mén)水平上差異較大（圖1）。與其處理組相比，M1ck的球囊菌門(mén)Glomeromycota（0.17%），M1s的單毛壺菌門(mén)Monoblepharomycota（0.04%），Z1ck組的優(yōu)被孢霉門(mén)Mortierellomycota（13.94%）、捕蟲(chóng)霉門(mén)Zoopagomycota（0.002%），Z1s的羅茲菌門(mén)Rozellomycota（1.30%）、擔(dān)子菌門(mén)Basidiomycota（37.23%）、毛霉菌門(mén)Mucoromycota（0.003%），Z2ck的壺門(mén)菌Chytridiomycota（1.57%）、芽枝霉門(mén)Blastocladiomycota（5.19%），Z2s的梳霉門(mén)Kickxellomycota（0.002%）、新麗鞭毛菌門(mén)Neocallimastigomycota（0.003%）相對(duì)豐富度最高。

如圖2所示，除Z1s處理外，各處理的最優(yōu)勢(shì)真菌群落是子囊菌門(mén)Ascomycota（>35%），Z1s的最優(yōu)勢(shì)真菌群落為擔(dān)子菌門(mén)Basidiomycota（37.23%）;與各自對(duì)照相比，各處理的Ascomycota相對(duì)豐富度以及top10真菌群落的相對(duì)豐富度之和均顯著降低，M1s、Z1s、Z2s處理的Ascomycota相對(duì)豐富度分別降低33.87%、70.23%、29.18%，top10真菌群落的相對(duì)豐富度之和分別降低34.09%、27.06%、30.29%。這表明，施加大球蓋菇菌渣顯著降低濱海鹽堿地土壤子囊菌門(mén)及top10真菌群落的相對(duì)豐富度。

2.2.2 對(duì)土壤功能真菌豐富度的影響 如表5所示，鹽堿土區(qū)林地土壤中具有解磷功能的真菌有青霉屬Penicillium、曲霉屬Aspergillus、鐮刀菌屬Fusarium，具有解鉀功能的真菌有黑曲霉Aspergillusniger，具有生防功能的真菌有木霉菌屬Trichoderma、節(jié)叢孢屬Arthrobotrys，林木病原真菌有尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum。與各自對(duì)照相比，M1s處理的Penicillium、Fusarium、Aspergillusniger、Fusariumoxysporum相對(duì)豐富度顯著降低，Trichoderma、Arthrobotrys相對(duì)豐富度顯著增加，Z1s處理的Aspergillus、Fusarium、Fusariumoxysporum相對(duì)豐富度顯著降低，Z2s處理的Penicillium、Trichoderma相對(duì)豐富度顯著增加。這表明，施入大球蓋菇菌渣后，鹽堿土區(qū)林地土壤功能真菌豐富度變化顯著，其中中度鹽化地（M1s）的木霉菌屬、節(jié)叢孢屬分別增加604.11%、236.36%;強(qiáng)度鹽化地（Z2s）的青霉屬、木霉菌屬分別增加874.55%、218.10%;中度鹽化地（M1s）、強(qiáng)度鹽化地（Z1s）的尖孢鐮刀菌分別降低80.43%、74.44%，尖孢鐮刀菌為林木病原菌，其減少后有利于樹(shù)木健康生長(zhǎng)。

2.2.3 對(duì)土壤真菌Alpha多樣性的影響 如表6所示，與對(duì)照相比，施入大球蓋菇菌渣的Z2s處理土壤真菌的物種數(shù)（Observedspecies）、豐富度指數(shù)（Chao1）、菌群多樣性指數(shù)（ShannonWiener與Simpson）均顯著增加，M1s、Z1s處理各指標(biāo)與其對(duì)照相比變化不顯著（Z1s處理的Simpson除外）。

2.2.4 對(duì)土壤真菌Beta多樣性的影響 如圖3所示，各處理與各對(duì)照在MDS1軸上明顯分開(kāi)。在MDS2軸上，3個(gè)對(duì)照也可明顯分開(kāi)，但是3個(gè)處理聚集在一起。說(shuō)明施入大球蓋菇菌渣后，不同鹽堿土區(qū)林地的真菌群落結(jié)構(gòu)（Beta多樣性）顯著改變，且處理組的真菌群落分布特征趨于一致。

2.2.5 環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析 由圖4看出，X軸（CCA1）為第一主成分;Y軸（CCA2）為第二主成分;環(huán)境因子與處理組（M1s、Z1s、Z2s）的相關(guān)性大小排序?yàn)椋嚎紫抖龋╬orosity）>有機(jī)質(zhì)（organic）>水穩(wěn)性團(tuán)聚體（aggregate）>pH值>含鹽量（salinity），表明孔隙度是影響處理組土壤真菌群落結(jié)構(gòu)差異的最大因素。含鹽量、水穩(wěn)性團(tuán)聚體、有機(jī)質(zhì)和孔隙度在X軸上的投影長(zhǎng)度均明顯大于在Y軸上的投影長(zhǎng)度，表明這4個(gè)變量主要影響對(duì)照組和處理組之間的真菌群落構(gòu)成。含鹽量、pH值、有機(jī)質(zhì)、水穩(wěn)性團(tuán)聚體、孔隙度與真菌群落組成的相關(guān)系數(shù)和P 值分別為（0.8970，0.0005）、（0.5370，0.0070）、（0.9700，0.0005）、（0.9214，0.0005）、（0.9532，0.0005），均達(dá)到顯著水平（P<0.05）。這表明，濱海鹽堿土區(qū)林地土壤含鹽量、pH值等理化性質(zhì)與土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

大球蓋菇菌渣含有大量有機(jī)質(zhì)和多種微生物及酶等其他活性物質(zhì)，將其就地翻混于林地鹽堿土4個(gè)月后，土壤容重降低34.07% ～48.48%，土壤孔隙度增加28.78% ～52.90%，水穩(wěn)性團(tuán)聚體增加58.54% ～123.82%，含鹽量降低45.45% ～90.42%，有機(jī)質(zhì)增加87.15% ～238.90%，速效磷增加401.33% ～965.80%，堿解氮增加79.86% ～269.89%。這與謝修鴻等[18]關(guān)于姬松茸菌糠改良蘇打鹽堿土、陳世昌等[19]關(guān)于平菇菌渣改良普通耕作土以及胡留杰等[20]關(guān)于杏鮑菇等其他菌渣改良普通耕作土的研究結(jié)果較為相似，不同之處為本研究是出菇后就地還田，不需要將菌渣粉碎和二次發(fā)酵，其改良成本低，改良效果更為顯著。

施加大球蓋菇菌渣后，濱海鹽堿土區(qū)林地土壤微生物中的子囊菌門(mén)Ascomycota及top10真菌群落的相對(duì)豐富度顯著降低;中度鹽化地（M1s）的木霉菌屬、節(jié)叢孢屬分別增加604.11%、236.36%;強(qiáng)度鹽化地（Z2s）的青霉屬、木霉菌屬分別增加874.55%、218.10%;中度鹽化地（M1s）、強(qiáng)度鹽化地（Z1s）的尖孢鐮刀菌分別降低80.43%、74.44%。這可能是由于外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的施入，為真菌微生物提供了大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而改變真菌微生物的群落豐富度所致[21]。

微生物群落結(jié)構(gòu)可反映微生物競(jìng)爭(zhēng)和協(xié)作等相互關(guān)系，群落結(jié)構(gòu)影響微生物群落的功能和變化，從而導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)的改變[22，23]。本研究對(duì)濱海鹽堿土壤真菌群落Beta多樣性分析表明，菌渣對(duì)土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)改變顯著。濱海鹽堿地土壤微生物群落與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)與土壤孔隙度、有機(jī)質(zhì)等理化性質(zhì)顯著相關(guān)，這與陳莉莉等[24]關(guān)于土壤微生物群落與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性結(jié)果較為一致。但本研究表明，鹽堿土區(qū)林地土壤真菌微生物群落的豐富度變化幅度更大。其原因?yàn)?，大球蓋菇林地栽培特點(diǎn)是栽培基質(zhì)數(shù)量大，菌渣還田4個(gè)月測(cè)量數(shù)據(jù)時(shí)，剩余的菌絲和菌渣還未完全降解，之后隨著菌渣降解時(shí)間的延長(zhǎng)，土壤群落豐富度變化趨勢(shì)會(huì)相對(duì)穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)室前期研究已經(jīng)得到驗(yàn)證[8]。

大球蓋菇林地栽培出菇后，出菇畦面上仍有約20kg/m2的菌渣留在土壤中，菌渣剩余量大，就地翻混還田改良土壤成本低。本試驗(yàn)表明：濱海鹽堿土施加大球蓋菇菌渣后，土壤EC值、含鹽量及土壤容重均顯著降低;土壤孔隙度、有機(jī)質(zhì)、速效磷、堿解氮含量均顯著提高;土壤中子囊菌門(mén)Ascomycota及top10真菌群落的相對(duì)豐富度顯著降低;強(qiáng)度鹽化地（Z2s）土壤真菌群落豐富度顯著提高，Alpha多樣性顯著提高;鹽堿地土壤真菌群落的Beta多樣性顯著改變;鹽堿地理化性質(zhì)與土壤真菌群落結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)。本研究結(jié)果為濱海鹽堿土的改良探討了一條新的有效途徑。